Xây dựng quy trình phân tích JWH 018 và 4 chất chuyển hóa trong mẫu nước tiểu bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ

Xây dựng quy trình phân tích JWH 018 và 4 chất chuyển hóa trong mẫu nước tiểu bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ Xây dựng quy trình phân tích JWH 018 và 4 chất chuyển hóa trong mẫu nước tiểu bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ luận văn tốt nghiệp thạc sĩ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

PHẠM NGỌC TUẤN

ĐỀ TÀI : XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH JWH-018

VÀ 4 CHẤT CHUYỂN HÓA TRONG MẪU NƯỚC TIỂU BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

PHẠM NGỌC TUẤN

ĐỀ TÀI : XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH JWH-018

VÀ 4 CHẤT CHUYỂN HÓA TRONG MẪU NƯỚC TIỂU BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ

Chuyên ngành :Kỹ thuật hóa học

Mã số: CA170300

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS TS TRẦN THỊ THÚY

2 PGS TS TRẦN VIỆT HÙNG

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi chân thành cảm ơn Viện Kỹ thuật hóa học, bộ môn Hóa Phân tích

đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và làm luận văn

Tôi xin bày tỏ lời cám ơn chân thành và sự kính trọng đối với PGS.TS Trần Thị Thúy, PGS.TS.Trần Việt Hùng các thầy cô đã nhận tôi là học viên và hướng dẫn trong suốt quá trình tôi thực hiện bản luận văn này Các thầy cô đã tận tình chỉ bảo cả

về lĩnh vực khoa học cũng như trong cuộc sống.Tôi đã học được rất nhiều từ những điều chỉ dẫn, những buổi thảo luận chuyên môn và phong cách khoa học trong công việc của các thầy cô Tôi cảm phục những hiểu biết sâu sắc về chuyên môn, những khả năng cũng như sự tận tình của các thầy cô.Tôi cũng rất biết ơn sự kiên trì của các thầy cô đã đọc cẩn thận và góp ý kiến cho bản thảo của luận văn Những kiến thức mà tôi nhận được từ các thầy cô không chỉ là bản luận văn mà trên hết là cách nhìn nhận, đánh giá cũng như phương thức giải quyết vấn đề một cách toàn diện trong khoa học

và sự trải nghiệm của cuộc sống Tôi luôn kính trọng và biết ơn các thầycô

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Đại tá Nguyễn Văn Hòa - Viện Trưởng Viện Pháp y Quân đội đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi được nghiên cứu làm luận văn tại viện Tôi xin trân trọng cám ơn Th.S Đặng Đức Khanh - Chủ Nhiệm Khoa Độc Học - Viện Pháp y Quân đội, Th.S Nguyễn Thị Ngọc Minh và các đồng nghiệp, đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt quá trình thu thập thông tin, số liệu, thực hiện các thực nghiệm của luận văn, đồng thời có những đóng góp gợi mở quý báu trong quá trình tôi hoàn thiện luận văn

Cuối cùng, tôi muốn giành lời cảm ơn cho những người thân yêu nhất của tôi.Bản luận văn này là món quà quý giá tôi xin được tặng cho cha mẹ và gia đình thân yêu của tôi

Hà Nội, tháng 9 năm 2019

Tác giả luận văn

Phạm Ngọc Tuấn

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Trần Thị Thúy, PGS.TS.Trần Việt Hùng Các kết quả nêu trong luận văn

là trung thực và chưa từng công bố trong bất kỳ một công trình nào

Tác giả luận văn

Phạm Ngọc Tuấn

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

1 GC/MS Gas chromatography- mass

2 LLOQ Lower limit of quantification Nồng độ dưới hạn dưới

3 RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

5 SPE Solid-phase extraction Chiết pha rắn

8 SPME Solid phase microextraction Kỹ thuật vi chiết pha rắn

9 MSD Mass selective detector Detector khối phổ

11 M/Z Mass-to-charge ratio Tỷ lệ khối lượng tính phí

12 LC/MS Liquid chromatography-mass

spectrometry Sắc ký lỏng khối phổ

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC CÁC BẢNG viii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ix

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1.Tổng quan về cần sa tổng hợp 3

1.1.1.Định nghĩa và phân loại 3

1.1.2.Cách tạo ra sản phẩm chứa cần sa tổng hợp 4

1.1.3.Tính chất vật lý và hóa học của JWH-018 5

1.1.4.Dược động học của JWH-018 và các chất chuyển hóa 7

1.1.5.Tác dụng dược lý 8

1.2 Tổng quan về mẫu nước tiểu 10

1.3 Tổng quan về các kỹ thuật xử lý mẫu nước tiểu phân tích JWH-018 11

1.3.1 Phương pháp thủy phân 11

1.3.2 Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng 12

1.4 Tổng quan kỹ thuật tạo dẫn xuất 13

1.4.1 Dẫn xuất hoá bằng tác nhân Acyl 15

1.4.2 Dẫn xuất hoá bằng tác nhân Alkylsilyl 15

1.5 Tổng quan về phương pháp sắc ký khí khối phổ 17

1.5.1 Cấu tạo của hệ thống sắc ký khí khối phổ 18

1.5.2 Kỹ thuật ph n t ch và ưu nhược điểm của sắc h hối phổ 19

1.5.3 Phương pháp định t nh và định lượng của sắc kí khí khối phổ 20

1.6 Các phương pháp xác định JWH-018 trong mẫu nước tiểu hiện nay trên thế giới 21

1.6.1 Phương pháp xử lý mẫu 21

1.6 Phương pháp ph n t ch 22

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 24

2.2.1 Hóa chất 24

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị 24

2.3 Phương pháp nghiên cứu 25

3.1 Phương pháp hồi cứu 25

3 Phương pháp thực nghiệm 25

3.3 Đánh giá quy trình ph n t ch 29

3.4 Phương pháp định t nh và định lượng chất phân tích 29

3.5 Phương pháp xử lý số liệu 30

2.3.6 Ứng dụng quy trình xây dựng được phân tích mẫu thực tế 30

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Kết quả khảo sát điều kiện phân tích JWH-018 và 4 chất chuyển hóa trên thiết bị GC/MS 31

3.2 Khảo sát độ chọn lọc 34

3.3 Kết quả khảo sát độ ổn định của thiết bị GC/MS 35

3.4 Kết quả khảo sát tìm điều kiện về nhiệt độ, thời gian để dẫn xuất 4 chất chuyển hóa JWH-018-6OH, JWH-018-COOH, JWH-018-4OH, JWH-018-5OH38 3.5 Khảo sát lựa chọn dung môi chiết lỏng lỏng 40

3.6 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện của thiết bị đối vớiJWH-018 và 4 chất chuyển hóa 42

3.7 Đánh giá quy trình phân tích 45

3.7.1 Kết quả khảo sát độ lặp lại của quy trình phân tích 45

3.7.2 Kết quả khảo sát độ thu hồi của quy trình phân tích 46

3.7.3 Tóm tắt quy trình phân tích 48

3.8 Kết quả phân tích mẫu thực tế giám định 49

3.9 BÀN LUẬN 50

3.9.1 Quy trình chiết mẫu 50

3.9.2 Phản ứng tạo dẫn xuất 50

3.9.3.Phương pháp ph n t ch GC/MS 50

3.9.4 Phân tích mẫu thực tế 51

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52

4.1 KẾT LUẬN 52

4.2 KIẾN NGHỊ 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

PHỤLỤC………57

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1.Bảng phân loại các nhóm cần sa tổng hợp [2] 4

Bảng 1.2 Trình bày tổng quan về JWH-018 và các chất chuyển hóa của JWH-018 5

Bảng 1.3 Hằng số ái lực (Ki) của THC và 1 số chất SC với các thụ thể CB1, CB2[15,16,17] 9

Bảng 1.4 Các dung môi chiết phổ biến 13

Bảng 2.1 Nhóm chất nghiên cứu và các chất chuyển hóa 23

Bảng 2.2 Hàm lượng các chất khảo sát xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính 28

Bảng 3.1 Điều kiện phân tích sắc ký khí khối phổ……….34

Bảng 3.3 Thời gian lưu tương đối của 5 chất phân tích và 2 chất surrogate so với 1chất nội chuẩn (IS1) 34

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát độ ổn định của thiết bị dựa vào tR 36

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát độ ổn định của thiết bị dựa vào diện tích pic 37

Bảng 3.6 Số liệu khảo sát ở 60 oC; Thời gian 20; 40; 60; 120 phút 38

Bảng 3.7 Số liệu khảo sát ở 70 oC; Thời gian 20; 40; 60; 120 phút 38

Bảng 3.8 Số liệu khảo sát ở 80 oC; Thời gian 20; 40; 60; 120 phút 39

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát lựa chọn dung môi chiết mẫu 40

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát lựa chọn dung môi chiết mẫu 41

Bảng 3.11 Kết quả khảo sát đường chuẩn nội 42

Bảng 3.12 Kết quả xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính của 5 chất phân tích với chất nội chuẩn JWH-018-d9 43

Bảng 3.13 Kết quả khảo sát độ lặp lại của quy trình phân tích ở 3 điểm hàm lượng khác nhau 46

Bảng 3.14 Kết quả khảo sát độ thu hồi của quy trình phân tích 47

Bảng 3.15 Kết quả phân tích mẫu nước tiểu thực tế ……… ……… 49

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Một số dạng cần sa tổng hợp 5

Hình 1.2.Sự liên kết giữa chất gốc và các chất chuyển hóa của JWH-018(ở trên) và THC (ở dưới) với thụ thể CB1 8

Hình 1.3.Thành phần chính trong nước tiểu……… 10

Hình1.4 :Chiết lỏng-lỏng trên phễu chiết (a) trước khi chiết, 100% chất phân tích trong pha 1 (b) Sau khi chiết, hầu hết chất cần phân tích trong pha 2, tuy nhiên một chút vẫn bị lưu giữ lại trong pha 1[21] 12

Hình 1.5 Thiết bị GC-MS trong phân tích 18

Hình 1.6 cấu tạo của thiết bị sắc ký khí khối phổ 18

Hình 1.7 (a) Hình ảnh cột mao quản; (b) cấu tạo cắt ngang của cột mao quản 19

Hình 3.1.Phổ khối full SCAN của JWH-018 31

Hình 3.2 Phổ khối full Scan của JWH-018-6OHI-TMS……… 32

Hình 3.3 Sắc ký (SIM) một số mảnh phổ (m/z) phân tích JWH-018 33

Hình 3.4 Sắc ký (SIM) hỗn hợp 5 chất phân tích và 3 chất nội chuẩn 33

Hình 3.5.Sắc ký phân tích mẫu nước tiểu blank 35

Hình 3.6 Đ thị biểu diễn tư ng quan tuyến tính của JWH-018 với chất nội chuẩn 43 Hình 3.7 Đ thị biểu diễn tư ng quan tuyến tính của JWH-018-4OH với chất nội chuẩn……….44

Hình 3.8 Đ thị biểu diễn tư ng quan tuyến tính của JWH-018-6OH với chất nội chuẩn 44

Hình 3.9 Đ thị biểu diễn tư ng quan tuyến tính của JWH-018-5OH với chất nội chuẩn 45

Hình 3.10 Đ thị biểu diễn tư ng quan tuyến tính của JWH-018 COOH với chất nội chuẩn 45

Hình 3.11 tóm tắt quy trình phân tích mẫu 48

MỞ ĐẦU

Cần sa tổng hợp (SC) được phát hiện sử dụng trái phép trên thế giới vào khoảng năm 2004 đến nay Các hợp chất SC xuất hiện trên thị trường dưới các tên gọi khác nhau như K2, Spice Gold, Spice Silver, Spice Diamond, Yucatan Fire, Sence, Chill X, Smoke… Trong các sản phẩm thảo dược [1] SC được sử dụng nhiều tại các nước như Mỹ, Úc và New Zealand và Châu Âu Năm 2015, một số chất ma túy mới xâm nhập vào Việt Nam được phát hiện là SC dạng thảo dược hoặc tinh thể dưới tên gọi như K2, Spice, cỏ Mỹ…[19]

SC xuất hiện trên thị trường đa dạng và phong phú cả về hình thức lẫn đối tượng sử dụng.Tình hình sử dụng trái phép các chất SC hiện nay diễn ra rất phức tạp từ học sinh, sinh viên đến người lao động và ở các độ tuổi khác Những năm gần đây ở nước ta một bộ phận không nhỏ thanh thiếu niên sử dụng cần sa tổng hợp giống như thuốc lá thường Hút cần sa tổng hợp đang trở thành thứ "mốt ngầm'' trong một bộ phận bạn trẻ mới lớn muốn chứng tỏ mình '' sành điệu''

Các chất SC có ảnh hưởng nguy hại tới sức khỏe hơn cả cần sa tự nhiên Các nghiên cứu dịch tễ học, lâm sàng và phòng thí nghiệm trong 10 năm qua cho thấy việc sử dụng SC thường xuyên có tác dụng phụ xấu đến sức khỏe bao gồm chứng phụ thuộc, tăng nguy cơ tai nạn xe cơ giới, chức năng hô hấp bị suy yếu, bệnh tim mạch và tác động bất lợi đến phát triển tâm lý xã hội vị thành niên và sức khỏe tâm thần Do đó, việc xác định định tính và định lượng chính xác được các chất SC trong các đối tượng khác nhau ngày càng trở nên cấp thiết với các nhà khoa học nói chung và các cơ quan chức năng có vai trò kiểm soát việc sử dụng các chất SC nói riêng

SC được tạo ra bằng cách hòa tan các chất trong các dung môi hữu cơ như ethanol, aceton sau đó phun hoặc ngâm với các loại thảo dược Khi đó, các loại thảo dược như sen, súng, cây họ đậu… đóng vai trò là vật chủ mang các chất SC Trong

số các loại SC hay được sử dụng, tiêu biểu là JWH-018 có mặt trong thành phần của hầu hết các chất SC hay được sử dụng

Hiện nay, có nhiều phương pháp như sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc khí khí (GC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký lỏng khối phổ (LC/MS hoặc LC/MS/MS hoặc UPLC/MS/MS) được dùng để phát hiện các chất SC [20] Tuy nhiên, các phương pháp này chỉ thích hợp với các quá trình phân tích nhằm xác định các chất SC và các chất chuyển hóa hàm lượng cao Mẫu máu, nước tiểu là các đối tượng nghiên cứu có hàm lượng các chất SC và chất chuyển hóa rất nhỏ, thường

từ 5 đến khoảng 100 ng/ml Do vậy, ngoài việc lựa chọn phương pháp chiết, làm giàu và làm sạch chất SC thì cần lựa chọn phương pháp phân tích có độ nhạy cao Phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC/MS hoặc GC/MS/MS) là phương pháp được trang bị hầu hết ở các tổ chức giám định pháp y hiện nay với ưu điểm về độ nhạy và tính kinh tế do trong quy trình chuẩn bị mẫu sẽ áp dụng kỹ thuật tạo dẫn xuất nhằm tăng độ nhạy của thiết bị

Ở Việt Nam hiện nay chưa có đề tài nghiên cứu phân tích SC đặc biệt là JWH-018 và 4 chất chuyển hóa của nó trong mẫu nước tiểu Xuất phát từ những lý

do trên, tôi thực hiện đề tài ''Xây dựng quy trình phân tích JWH-018 và 4 chất

chuyển hóa trong mẫu nước tiểu bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ''

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về cần sa tổng hợp

1.1.1 Định nghĩa và ph n loại

Cần sa tổng hợp (SC) được định nghĩa là những chất hóa học do người tổng hợp Những chất này tương tác với thụ thể trong não và các cơ quan khác giống như delta 9 THC có trong cây cần sa tự nhiên.Cần sa tổng hợp được phát hiện sử dụng trái phép trên thế giới vào khoảng năm 2004 đến nay Các sản phẩm thảo dược có chứa các hợp chất SC xuất hiện trên thị trường dưới các tên gọi khác nhau như K2, Spice Gold, Spice Silver, Spice Diamond, Yucantan Fire, Sence, Chill X, Smoke…[1] Khi đó một số chất được trộn vào thảo dược ngụy trang dưới dạng thuốc lá mà trong đó không có thành phần của thuốc lá và cần sa tự nhiên, nhưng khi sử dụng thì có hiệu ứng tương tự đến mạnh hơn hàng trăm lần so với THC có trong cần sa tự nhiên [2] Chính vì vậy, từ năm 2009 một số nước như Australia, Pháp, Đức, Ba Lan, Thụy Điển đã đưa toàn bộ những sản phẩm có chứa các hợp chất cần sa tổng hợp vào luật ma túy [2] Chất UR-144 được phát hiện bắt giữ ở Hàn Quốc năm 2012, chất này cũng được phát hiện phổ biến ở Châu Âu, Nhật Bản

và Mỹ, nó là chất SC được tìm thấy hầu hết trong các mẫu phân tích SC ở Nga năm

2012 Một số nước như New Zealand, Nga đã cấm một số SC năm 2012, Anh và

Mỹ cấm năm 2013 [4]

Phân loại SC

Mặc dù được gọi là cần sa tổng hợp nhưng đa số các chất SC không có mối liên quan về cấu trúc hóa học với các chất có trong cần sa tự nhiên Hiện nay, dựa vào cấu trúc hóa học cần sa tổng hợp được chia ra thành các nhóm được trình bày trong bảng 1.1

9 Adamantoylindoles AB-001; AM-1248

10 Tetramethylcyclopropylindoles XLR-11; UR-144; A-796, A-260; AB-005

1.1.2 Cách tạo ra sản phẩm chứa cần sa tổng hợp

SC thường được hòa tan trong các dung môi hữu cơ như Ethanol, aceton sau

đó phun hoặc ngâm với các loại thảo dược Khi đó thực vật đóng vai trò là vật chủ mang các chất SC Các như loại thảo dược thường được dùng là cây sen, súng, cây

họ đậu…Quá trình phun, ngâm tẩm cần sa tổng hợp với thảo dược trái phép thường xảy ra sai sót như tạo ra "Điểm nóng" hóa chất hoặc khu vực có tiềm năng gây nguy hiểm cao thường có nồng độ chất cần sa lớn, đối tượng không may sử dụng các mẫu này sẽ dẫn đến tác hại nguy hiểm ở mức độ cao hơn của các biểu hiện thông thường khi sử dụng SC, đặc biệt hơn là dẫn đến tử vong

Hình 1.1 Một số dạng cần sa tổng hợp

1.1.3 Tính chất vật lý và hóa học của JWH-018

Bảng 1.2.Trình bày tổng quan về JWH-018 và các chất chuyển hóa của JWH-018

Được tìm thấy trong hỗn hợp thảo dượcloại

Spice / K2 và có thể có đặc tính gâyđộc cho

hệ thần kinh JWH-018 được quyđịnh là hợp

chất Bảng I tại Hoa Kỳ Sảnphẩm này được

dành cho nghiên cứu và các ứng dụng pháp y

hóa chính của JWH 018, được hình thành

trong quá trình chuyển hóa 1 pha và có thể

phát hiện trong nước tiểu ở dạng glucuronid

hóa Tính chất sinh học của nó chưa được

kiểm tra Sản phẩm này được dành cho lĩnh

Chất chuyển hóa JWH-018 5-hydroxypentyl

là một chất nội chuẩn phân tích được phân

loại là một cannabinoid tổng hợp Nó là một

chất chuyển hóa tiết niệu chính của JWH 018

được đặc trưng bởi quá trình monohydroxyl

hóa chuỗi N-alkyl Trong các mẫu nước tiểu,

nó gần như glucuronid hóa hoàn toàn Sản

phẩm này dành cho nghiên cứu và ứng dụng

Chất chuyển hóa axit JWH 018 N- pentanoic

là một chất chuyển hóa nhỏ trong nước tiểu

của JWH 018, được đặc trưng bởi quá trình

carboxyl hóa chuỗi N- alkyl Trong các mẫu

nước tiểu, chất chuyển hóa này gần như

glucuronid hóa hoàn toàn

1.1.4 Dược động học của JWH-018 và các chất chuyển hóa

Hầu hết SC được dùng để giải trí bằng cách hít Khi nghiên cứu về hấp thu

và phân bố, Poklis và cộng sự (2012) đã nghiên cứu dược động học trên chuột sau khi hít đến 200 mg "cỏ" có chứa 10,8 mg (5,4 % khối lượng) JWH-018 Sáu con chuột, sau 20 phút sử dụng thì giải phẫu, có nồng độ JWH-018 trong máu là 82±42 ng/ml, 1990±72 ng/g trong gan và 510±166 ng/g não Sau đó tác giả cũng nghiên cứu dược động học trên máu và não của 2 nhóm mỗi nhóm 5 con chuột sau khi hít

10 phút sản phẩm "Magic Gold" có chứa 3,6 % JWH-018, 5,7 % JWH-073 và 0,1 % JWH-398 Trong nhóm đầu, sau 20 phút sử dụng thì giải phẫu, nồng độ trong máu

là 88±42 ng/ml JWH-018 và 134±62 ng/ml JWH-073, nồng độ trong não là 317±81 ng/g JWH-018 và 584±163 ng/g JWH-073 JWH-398 không thấy trong bất kỳ mẫu nào Nhóm thứ 2, sau 20h sử dụng thì giải phẫu, chỉ có 2 con chuột phát hiện thấy JWH-018 trong máu (3,4 và 9,4 ng/ml) và chỉ có 1 con phát hiện thấy JWH-073 ở nồng độ 4,3 ng/ml Nồng độ trung bình của JWH-018 trong não là 19±9 ng/g, trong

cả 5 con chuột đều phát hiện thấy nồng độ JWH-018; đối với JWH-073 không tìm thấy trong bất kỳ con chuột nào sau 20 h Tỉ lệ trung bình của các chất ở trong não/máu sau 20 h là 4,4 đối với JWH-018 và 5,2 với JWH-073 [5]

Chimalakonda và cộng sự [6] đã xác định các chất chuyển hóa bước 1 được tìm thấy trong các mẫu nước tiểu của người sử dụng là JWH-018 3-Hydroxypentyl, JWH-018 N 4-Hydroxypentyl, JWH-018 N 5-Hydroxypentyl, axit JWH-018 N-pentanoic, JWH-018 5-Hydroxyindole, JWH-018 6-Hydroxyindole Khi nghiên cứu

in vitro trên vi thể gan người thì sản phẩm chính tạo thành là JWH-018 Hydroxyindole (19%) và JWH-018 N-Hydroxypentyl (18%) Hầu hết các chất

6-chuyển hóa của JWH-018 được bài tiết trong nước tiểu ở dạng liên kết với axit glucuronic

1.1.5 Tác dụng dược lý

Các chất SC có tác dụng dược lý giống THC có trong cây cần sa, do các SC

và THC đều là những chất chủ vận gắn với thụ thể cannabinoid (CB) Có 2 loại thụ thể cannabinoid là CB1 và CB2 Thụ thể CB1 có trong nhiều trong não, tủy sống, gây ra những tác dụng bao gồm giảm đau, tăng nhịp tim, giảm huyết áp, khô miệng, mất khả năng điều hòa, giảm miễn dịch và các tác động lên tâm thần [7,5] Thụ thể CB2 chủ yếu tập trung ở lá lách và ở các tế bào miễn dịch, làm suy giảm miễn dịch

ở mức độ trung bình do giảm chu kỳ sống của tế bào, ức chế sản sinh tế bào, giảm sản sinh cytokine và protein hoạt hóa bạch cầu [7,8]

Hình 1.2.Sự liên kết giữa chất gốc và các chất chuyển hóa của JWH-018

(ở trên) và THC (ở dưới) với thụ thể CB1

Tuy có tác dụng dược lý giống nhau nhưng độ mạnh, nồng độ để gây nên cùng một mức tác dụng, thời gian tác dụng của các SC và THC khác nhau Về bản chất, THC cho thấy hoạt tính của chất chủ vận một phần với thụ thể CB1 và CB2, trong khi các SC đều là chất chủ vận toàn phần với những thụ thể này, vì vậy các SC gây

ra những tác dụng tối đa khi liên kết với các thụ thể [9-12] Thêm vào đó, ái lực liên kết các chất chủ vận với các thụ thể CB1, CB2 khác nhau dẫn đến tác dụng dược lý gây ra mạnh yếu khác nhau Hằng số Ki là hằng số ái lực của các chất chủ vận với thụ thể, giá trị của hằng số này tỉ lệ nghịch với độ mạnh của các chất chủ vận Tuy

nhiên, tùy từng tác nhân nghiên cứu, hằng số Ki của 1 chất có thể khác nhau [13,14] Bảng 1.3 dưới đây cho thấy hằng số Ki của THC và SC nghiên cứu với các thụ thể CB Ta thấy, hằng số ái lực của THC lớn hơn của các SC trên cùng một tác nhân nghiên cứu, do đó khả năng liên kết của THC với các thụ thể CB yếu hơn so với các SC Vì vậy, hầu hết các SC tác dụng mạnh hơn và thời gian duy trì tác nhân lâu hơn

Bảng 1.3 Hằng số ái lực (Ki) của THC và 1 số chất SC với các thụ thể CB1, CB2

JL, 2013 JWH-073 8,9±1,8 ≤159 [3H]rimonabant Auwater V, 2013; Wiley

JL, 2013 UR-144 29

150

368

4,5 1,8

[3H]CP-55,940 [3H]CP-55,940 [3H]rimonabant

Wiley JL, 2013 Frost J.M,2010 Auwater V, 2013; Wiley

JL, 2013 XLR-11 24 2,1 [3H]CP-55,940 Wiley JL, 2013

Một điểm khác nhau rõ rệt giữa các SC và THC là sự hình thành các chất chuyển hóa có ái lực liên kết cao với các thụ thể CB Trong khi đó, những trường hợp sử dụng THC, chỉ có 1 trong những chất chuyển hóa chính của THC (là 11-OH-THC) được biết đến là có hoạt tính thần kinh và duy trì sự gắn kết với CB1 và CB2 [8,14]

Cụ thể, trong các sản phẩm chuyển hóa của JWH-018, chất chuyển hóa có hoạt tính của chất chủ vận toàn phần là JWH-018 N 5-Hydroxypentyl và JWH-018 6-Hydroxyindole duy trì ái lực cao với CB1 [18, 9, 10] Các chất chuyển hóa của JWH-018 cũng gắn với thụ thể CB2 do ái lực cao với các thụ thể này Ái lực liên kết với CB2 có thể được xếp theo thứ tự JWH-018 > THC > JWH-018 N 5-Hydroxypentyl > JWH-018 6-Hydroxyindole > JWH-018 N 4-Hydroxypentyl >> axit JWH-018 Pentanoic

1.2 Tổng quan về mẫu nước tiểu

Cho tới nay, nước tiểu là mẫu được sử dụng rộng rãi nhất để thử nghiệm lạm dụng ma túy Mẫu nước tiểu có những ưu điểm là thể tích lớn và nồng độ tương đối cao do tác dụng cô đặc nồng độ lên 100 lần ở thận (mỗi phút, khoảng 125 ml huyết tương được lọc qua thận và cô đặc thành xấp xỉ 1 ml nước tiểu) Có rất nhiều những tài liệu về phân tích ma túy và các chất chuyển hóa của chúng trong mẫu nước tiểu, chủ yếu về dược động học và sự thải trừ các chất chuyển hóa trong nước tiểu

Hình 1.3.Thành phần chính trong nước tiểu

* Các thành phần vô cơ

- Natri và kali, Canxi và magie, Clorua, Phosphat, Sulfat, Bicarbonat

Bên cạnh những thành phần vô cơ kể trên, nước tiểu còn có thể có lượng nhỏ các nguyên tốt vi lượng như kẽm, iod, arsenic, sắt, đồng, chì

* Các thành phần hữu cơ

- Urê, Axít uric, Creatinin và creatin, Axít hippuric, Protein

Ngoài những chất hữu cơ kể trên, nước tiểu còn chứa những chất hữu cơ khác như sắc tố mật (bilirubin), muối mật, sản phẩm chuyển hóa của sắc tố mật (urobilinogen), vitamin, các hormon và sản phẩm chuyển hóa của chúng (như gonadotropin, ostrogen, pregnandiol ), các sản phẩm phân giải acid amin ở ruột (indol, skatol, indoxyl )

1.3 Tổng quan về các kỹ thuật xử lý mẫu nước tiểu phân tích JWH-018

Trước khi phân tích các chất SC trong mẫu máu và nước tiểu bằng sắc ký khí khối phổ thường phải sử dụng các kỹ thuật như thủy phân để tách liên hợp, chiết mẫu, làm sạch và dẫn xuất hóa Mục đích của chiết và làm sạch là tách chất cần sa

ra khỏi mẫu dịch sinh học, loại một số tạp chất trong mẫu dịch sinh học có ảnh hưởng đến quá trình phân tích, kỹ thuật dẫn xuất hóa mẫu làm tăng độ nhạy của phép phân tích, phù hợp hơn với điều kiện phân tích sắc ký Một số các kỹ thuật sử dụng là thủy phân, chiết lỏng lỏng, chiết pha rắn, dẫn xuất nhóm(-OH; -COOH) bằng tác nhân acyl hóa

1.3.1 Phương pháp thủy phân

Để phân tích cần sa tổng hợp và những sản phẩm chuyển hóa bằng sắc ký khí khối phổ, cần phải thủy phân các sản phẩm liên hợp, chủ yếu là liên hợp glucuronid trong máu và nước tiểu

Liên kết glucuronid có thể là ether (acetal), ester (acylal) hoặc N- hay Glucuronide Phương pháp thủy phân nhanh và ít tốn kém là ủ với acid vô cơ mạnh,

S-ví dụ acid hydrochloric 5 mol/L ủ trong 15-30 phút, nhiệt độ 100 oC dưới áp suất thường

Hiện nay, thủy phân bằng cách ủ với enzym β-glucuronidase hoặc arylsulfatase (trong 15 giờ ở 35 oC) là phương pháp thủy phân khá đặc hiệu và điều kiện tương tối nhẹ nhàng nhưng tốn thời gian và kinh phí Có nhiều enzym có thể

dùng để thủy phân, phổ biến là Escherichia coli hoặc Helix pomatia Các enzym

khác nhau có hoạt tính thủy phân tốt nhất ở những điều kiện pH khác nhau Ví dụ,

pH tối ưu cho Helix pomatia là 4,5 trong khi của Escherichia coli là 6,8

1.3.2 Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng

Các chất ma túy thường có đặc tính thân dầu Để chiết các chất phân tích thân dầu từ mẫu sinh học, thường sử dụng phương pháp chiết lỏng – lỏng với dung môi hữu cơ, không tan trong nước ở pH phù hợp

Chiết lỏng – lỏng là phương pháp được sử dụng để làm sạch hoặc để tách một hoặc một nhóm các cấu tử ra khỏi mẫu gốc dựa vào sự phân bố khác nhau của chất tan trong hai chất lỏng không thể hòa trộn vào nhau, thường là nước và một dung môi hữu cơ

Hình 1.4: Chiết lỏng-lỏng trên phễu chiết (a) trước khi chiết, 100% chất phân tích trong pha 1 (b) Sau khi chiết, hầu hết chất cần phân tích trong pha 2, tuy nhiên một chút vẫn bị lưu giữ lại trong pha 1[21]

Tốt nhất nên sử dụng dung môi ít phân phân cực Việc lựa chọn dung môi có khả năng chiết quá tốt có thể làm giảm độ chọn lọc của do lẫn nhiều tạp chất Đặc tính của một dung môi chiết lý tưởng:

- Có khả năng chiết tốt (Hòa tan chất phân tích tốt)

- Ít tan trong nước

- Khối lượng riêng nhỏ hơn nước

- Khả năng bay hơi vừa phải để dễ dàng loại bỏ khi cần giảm thể tích mẫu, nhưng cũng không quá dễ bay hơi để đảm bảo không bị mất mẫu trong quá trình xử lý

- Ổn định/ trơ về mặt hóa học (không chứa chất ổn định)

- Ít độc hại (đối với đường hô hấp và tiếp xúc qua da)

- Ít gây kích ứng

- Rẻ tiền,tinh khiết

- Không hấp thụ UV hoặc có hoạt tính quang điện

- Không có những đáp ứng hoặc mất hiệu quả trên các detector NPD/ECD/MS

Những dung môi chiết hay sử dụng được liệt kê trong Bảng 1.4

Bảng 1.4 Các dung môi chiết phổ biến

Tên dung môi Khối lượng

riêng (g/cm3)

Nhiệt độ sôi (oC)

Độ phân cực

Độ tan trong nước (g/L)

1.4 Tổng quan kỹ thuật tạo dẫn xuất

Kỹ thuật dẫn xuất hóa sử dụng trong phân tích có mục đích chính là tạo ra chất mới có khả năng phù hợp hơn về một số điều kiện nhằm đáp ứng tốt cho phương pháp phân tích như sắc ký khí, sắc ký lỏng hoặc phương pháp phân tích khác Các chất hữu cơ khi phân tích bằng phương pháp sắc ký khí thì mẫu phải hóa hơi trong điều kiện nhiệt độ làm việc của thiết bị Do đó để tăng khả năng hóa hơi

của một số chất có nhóm chức hydroxyl, carboxylic, amin, thiol, phosphate thì kỹ thuật thường được sử dụng là tạo dẫn xuất Kỹ thuật dẫn xuất hóa có thể làm giảm

độ phân cực của chất phân tích bằng cách chuyển những nhóm chức phân cực thành những nhóm ít phân cực, như vậy sẽ hạn chế khả năng hấp phụ trong quá trình sắc

ký khí do tương tác của nhóm chức phân cực gây ra Ngoài ra kỹ thuật dẫn xuất hoá thường áp dụng cho việc phân tích các chất có nồng độ thấp do các chất sau khi dẫn xuất thì khả năng thích ứng với thiết bị sắc ký, detector là tốt hơn, tạo nên các pic cân đối hơn, độ nhạy cao hơn

Mục tiêu của dẫn xuất hoá:

- Tạo các hợp chất mới phù hợp hơn cho phương pháp phân tích (tăng khả năng hóa hơi, bền nhiệt …)

- Làm tăng hiệu quả sắc ký (Thay đổi thời gian lưu, giảm hoặc loại bỏ doãng pic, tăng độ phân giải và hệ số đối xứng )

- Tăng khả năng phát hiện của thiết bị đối với chất phân tích Như dẫn xuất với tác nhân có Clo, flo sẽ làm tăng độ nhạy cho detector ECD, hoặc dẫn xuất với tác nhân TMCS sẽ tạo ra chất có nhóm TMS và phân tích bằng khối phổ sẽ tạo ra phổ khối đặc trưng cho chất phân tích

Các nhóm chức trong phân tử thường có khả năng tạo dẫn xuất là có nguyên

tử hydro linh động kết hợp với nguyên tử oxy, nitơ, … Như vậy các nhóm chức có khả năng tạo dẫn xuất như hydroxyl (-OH), carboxylic (-COOH), amins (R2-NH)…

Chọn tác nhân dẫn xuất:

Tác nhân dẫn xuất là chất được sử dụng làm thay đổi hóa học một hợp chất

và tạo ra một hợp chất mới có các tính chất phù hợp để phân tích trong GC hoặc

LC Lựa chọn tác nhân dẫn xuất thích hợp cho phân tích GC thường dựa vào các tiêu chí sau:

- Hiệu suất phản ứng dẫ xuất phải cao > 95 %

- Trong quá trình tạo dẫn xuất không làm thay đổi cấu trúc của hợp chất

- Không làm mất mẫu trong quá trình phản ứng

- Tạo ra hợp chất mới có tính ổn định cao

- Tạo ra hợp chất mới không tương tác với pha tĩnh của cột GC

Thông thường có 3 loại phản ứng tạo dẫn xuất khác nhau để ứng dụng cho phân tích sắc ký như: Alkyl hóa tạo ra ester, Acyl hóa và silyl hóa

1.4.1 Dẫn xuất hoá bằng tác nhân Acyl

Phản ứng acyl hoá xảy ra khi nhóm chức alcol (OH), thiol (SH), amin (bậc 1 hoặc bậc 2) phản ứng với 1 axít anhydride, phản ứng này tạo este, thioeste, amit tương ứng và phụ thuộc vào tác nhân dẫn xuất hoá là axit hoặc amidazole Phản ứng xảy ra gần như hoàn toàn mà không cần xúc tác Phản ứng này làm tăng độ nhạy, độ

ổn định khi phân tích bằng detector khối phổ, cộng kết điện tử

Có hai nhóm tác nhân dẫn xuất khác nhau là axít anhydride và acyl imidazole Các tác nhân dẫn xuất nhóm axít anhydride hiện nay thường sử dụng để tạo dẫn xuất với nhóm amin của ma túy tổng hợp là TFAA, HFBA, PFPA … Các tác nhân dẫn xuất nhóm acyl imidazole thường sử dụng là TFAI, PFPI, HFBI …

Phương trình phản ứng minh hoạ khi dẫn xuất amin với axít anhydride

R1NH2 + (R2CO)2O = R1NHOCR2 + R2COOH Sau khi sử dụng tác nhân dẫn xuất hoá là axít anhydride, ngoài sản phẩm với chất phân tích được tạo ra còn có axít do đó phải được loại khỏi mẫu bằng cách làm bay hơi đến gần khô dưới dòng khí nitơ và hòa lại bằng dung môi hữu cơ thích hợp khác trước khi bơm vào hệ thống sắc ký khí Tuy nhiên nếu sử dụng tác nhân dẫn xuất là acyl imidazole thì không tạo ra sản phẩm là axít do đó không cần phải làm bay hơi trước khi phân tích bằng sắc ký

1.4.2 Dẫn xuất hoá bằng tác nhân Alkylsilyl

Dẫn xuất bằng tác nhân silyl hóa là phổ biến nhất, rất thích hợp cho phân tích các chất không có khả năng bay hơi bằng GC

Cơ chế của phản ứng tạo dẫn xuất bằng tác nhân alkylsilyl là sự thay thế nguyên tử hydro linh động trong nhóm chức hydroxyl, carboxylic, thiols, amin…của chất phân tích bằng một nhóm ankylsilyl như trimethylsilyl của tác nhân dẫn xuất

Phản ứng tạo dẫn xuất của Hydroxy-PAHs với tác nhân BSTFA có xúc tác TMCS

Phản ứng dẫn xuất alkylsilyl thường được thực hiện trong hỗn hợp dung môi

và chất dẫn xuất có nhiệt độ và thời gian thích hợp Dung môi không phân cực thường được sử dụng trong dẫn xuất bằng tác nhân alkylsilyl như hexan, diethylether, toluene, ethylacetate, pyridine Với kỹ thuật dẫn xuất bằng tác nhân alkylsilyl thì mẫu và dung môi phải không chứa nước, tác nhân alkylsilyl có khả năng hút ẩm mạnh nên cần bảo quản trong lọ có nút kín, dung môi trong dẫn xuất phải tinh khiết

Phản ứng silyl hóa thực hiện được cho cả alcohol và axit carboxylic để lần lượt tạo thành trimethyl ether và trimethyl ester Theo nghiên cứu của Regis (1999) chỉ ra các nhóm chức có khả năng phản ứng với nhóm silyl tương đối như sau: Alcohol > Phenol > Carboxyl > Amine > Amide > Hydroxyl Riêng với Alcohol thì (bậc 1 > bậc 2 > bậc 3)

Đa số các phản ứng tạo dẫn xuất cần nhiệt độ, thông thường phản ứng thực hiện từ nhiệt độ phòng đến 200 0C, thời gian phản ứng thường 10 đến 60 phút

Như vậy, lựa chọn kỹ thuật tạo dẫn xuất trong phân tích GC sẽ phụ thuộc vào chất phân tích có nhóm chức gì, có thể phản ứng hay không, phụ thuộc vào detector của GC để phân tích, sau đó sẽ lựa chọn tác nhân dẫn xuất Dẫn xuất phải phù hợp,

có khả năng phát hiện và hiệu quả khi phân tích sắc ký với từng loại detector riêng Nếu sử dụng detector ECD thường lựa chọn tác nhân dẫn xuất có clo, flo vì detector ECD có độ nhạy cao khi phân tích các chất có chứa clo, flo Với chất phân tích là acid carboxylic, lựa chọn đầu tiên cho dẫn xuất là phản ứng tạo ester hóa Chất phân tích có nhóm chức axit carboxylic chưa được dẫn xuất có độ phân cực hơn, khi phân

tích trên GC sẽ cho pic không cân đối do sự hấp thụ và tương tác không chọn lọc với pha tĩnh trên cột Khi phản ứng ester hóa sẽ làm giảm độ phân cực của chất phân tích do đó sẽ phù hợp hơn cho phân tích GC

Trong phân tích gần đây, các chất có nhóm chức như hydroxyl, carboxylic, amin, thiol, phosphate khi phân tích bằng GC muốn hiệu quả hơn thường được silyl hóa Dẫn xuất bằng tác nhân silyl thường giảm độ phân cực, tăng khả năng bay hơi, ổn định nhiệt hơn Phản ứng silyl hóa tạo ra chất mới khi phân tích bằng sắc ký khí khối phổ sẽ cho sơ đồ phổ khối nhiều mảnh hơn, phù hợp khi cần xác định cấu trúc

1.5 Tổng quan về phương pháp sắc ký khí khối phổ

Phương pháp phân tích sắc ký khí detector khối phổ là một phương pháp phân tích hóa lý được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành khoa học hiện nay như y dược học, hóa học, hình sự, môi trường, Đây là phương pháp phân tích hiện đại,

có độ chính xác cao thường được dùng để khẳng định các kết quả cuối cùng của phép phân tích lượng vết

Thiết bị phân tích sắc ký khí khối phổ gồm có thiết bị sắc ký khí kết nối với detector khối phổ Mẫu sau khi được tách trên cột phân tích của thiết bị sắc ký khí

sẽ được detector khối phổ (MSD) nhận biết và cho ra kết quả dưới dạng sắc ký đồ

và phổ khối Kết quả nhận biết của detector khối phổ có ưu điểm hơn các detector khác là ngoài việc cho thông tin về thời gian lưu, diện tích píc của chất thì còn cho thông tin về phổ khối lượng của chất, từ đó sẽ giúp cho định tính các chất chính xác hơn hay so sánh với thư viện phổ để phát hiện ra các chất cần thiết khác

Như vậy đề tài sử dụng phương pháp sắc ký khí khối phổ sẽ giúp cho việc định tính, định lượng các chất cần sa tổng hợp một cách chính xác dựa vào kỹ thuật phân tích lựa chọn các mảnh phổ khối của từng chất (SIM), mảnh phổ lựa chọn để phân tích phải có tính chất đặc trưng và là mảnh có tín hiệu cao nhất Kỹ thuật phân tích Scan của khối phổ cho phép thu nhận toàn bộ các mảnh phổ khổi của chất phân tích thể hiện trên từng píc, dựa vào thư viện phổ sẽ cho chúng ta biết được píc đó là

chất gì, như vậy kỹ thuật scan sẽ cho phép phát hiện một số chất chuyển hóa trong các giai đoạn khác nhau sau khi sử dụng cần sa tổng hợp

Hình 1.5 Thiết bị GC-MS trong phân tích

1.5.1 Cấu tạo của hệ thống sắc ký khí khối phổ

Cấu tạo của thiết bị sắc ký khí (GC) khối phổ (MS) gồm có các bộ phận như sau:

1: Nguồn khí mang

2: Bơm chân không

3: Buồng bơm mẫu

4: Lò điều nhiệt

5: Cột tách sắc ký

6: Detector MS

7: Thiết bị thu nhận và xử lý tín hiệu

Hình 1.6 cấu tạo của thiết bị sắc ký khí khối phổ

Ngu n khí mang: Thiết bị sắc ký khí kết nối detector khối phổ chỉ sử dụng

khí trơ là heli hoặc hydro Các khí này có độ tinh khiết cao (99,999 %)

B m chân không: Có nhiệm vụ tạo môi trường chân không trong buồng ion

hóa mẫu đạt khoảng 10-5 torr trong MSD

Cột sắc ký khí: Là bộ phận rất quan trọng của thiết bị sắc ký, được thể hiện

thông qua khả năng lưu giữ và tách các chất trong mẫu phân tích Cột phân tích hay được ví như là trái tim của hệ thống sắc ký khí

Hình 1.7 (a) Hình ảnh cột mao quản; (b) cấu tạo cắt ngang của cột mao quản

Lò iều nhiệt: Là bộ phân gia nhiệt cho cột tách sắc ký giúp cho các cấu tử

tách ra trong cột sắc ký, quá trình tách sắc ký ngoài việc dựa vào yếu tố là dòng khí mang, bản chất pha tĩnh còn dựa vào tốc độ gia nhiệt của lò

Detector khối phổ (MSD): Hoạt động của detector khối phổ dựa trên nguyên

tắc bẻ gẫy phân tử chất phân tích thành các mảnh ion có tỷ số m/z xác định và đặc trưng cho chất phân tích

1.5.2 Kỹ thuật ph n t ch và ưu nhược điểm của sắc h hối phổ

Có hai chế độ trong phân tích GC/MS là quét toàn bộ các ion như SCAN hoặc chỉ lựa chọn một số ion giàu hay đặc trưng để quét (SIM) Chế độ SCAN thường dùng để định tính các chất chưa biết nhờ việc so sánh với thư viện phổ hoặc chất chuẩn hoặc dùng để xác định thời gian lưu của chất Ở chế độ SIM, chỉ vài ion

xác định được lựa chọn để quét, tốc độ thu thập số liệu sẽ nhanh hơn, tương ứng với khoảng thời gian của một píc sắc ký (1 giây), như vậy kết quả định lượng sẽ tốt hơn

và độ nhạy được cải thiện nhiều

Ứng dụng:GC/MS thường được sử dụng để phân tích các chất hữu cơ có khả

năng bay hơi ở nhiệt độ dưới 350 o

C, có khối lượng phân tử nhỏ hơn 600 đvC

Ưu iểm: Kết hợp ưu điểm của cả GC và MS, tính năng phân tích nhanh và

độ phân giải cao của sắc ký khí được bảo toàn MS cung cấp độ nhạy cả phân tích định tính và định lượng ở mức ppb đến ppt Dữ liệu phân tích được lưu dữ đầy đủ ở dạng phổ khối

Nhược iểm: GC/MS là thiết bị phân tích đắt, vận hành phức tạp hơn sắc ký

sử dụng để khẳng định kết quả phân tích cuối cùng

b Định lượng

Một số kỹ thuật dùng để định lượng trong phân tích sắc ký khí là chuẩn hóa diện tích pic, ngoại chuẩn, thêm chuẩn và chuẩn nội

- huẩn h a diện tích pic: Kỹ thuật tính toán này coi tỷ lệ phần trăm diện tích pic

trong sắc ký đồ tương ứng với tỷ lệ phần trăm lượng chất Kỹ thuật này được dùng chủ yếu phân tích các mẫu tinh dầu, không được sử dụng trong phân tích lượng vết

- Ngoại chuẩn: Kỹ thuật này tính toán dựa trên đường ngoại chuẩn được xây dựng

biểu diễn tương quan tuyến tính giữa nồng độ chất chuẩn trong dung dịch với diện

tích píc sắc ký Đường ngoại chuẩn được xây dựng thường dựa vào từ 3 điểm nồng

độ trở lên

- h m chuẩn: Kỹ thuật thêm chuẩn được tính toán dựa vào nồng độ chất chuẩn

thêm vào chính mẫu đã phân tích trước đấy Kỹ thuật này không phải dựng đường ngoại chuẩn nhiều điểm Tuy nhiên mất nhiều thời gian khi phân tích nhiều mẫu hoặc tính toán giữa các ngày khác nhau

- huẩn nội: Ngoài các kỹ thuật tính toán trên thì kỹ thuật dùng nội chuẩn để định

lượng trong phân tích sắc ký khí có độ chính xác hơn cả Kỹ thuật này loại trừ được sai số trong quá trình bơm mẫu, độ đáp ứng của detector với chất phân tích giữa các ngày khác nhau Đường nội chuẩn được xây dựng dựa vào tương quan tuyến tính giữa tỷ lệ diện tích pic và tỷ lệ lượng chất phân tích Trong phân tích GC/MS thì mảnh phổ dùng để định lượng là mảnh phổ có tín hiệu mạnh nhất tức là cho diện tích pic lớn nhất Mảnh phổ này được xác định sau khi phân tích mẫu trên GC/MS ở chế độ Scan

1.6 Các phương pháp xác định JWH-018 trong mẫu nước tiểu hiện nay trên thế giới

1.6.1 Phương pháp xử lý mẫu

Hiện nay, trên thế giới thường sử dụng phương pháp chiết lỏng lỏng, phương pháp chiết pha rắn, phương pháp tủa protein, phương pháp thủy phân để phân tích các chất cần sa tổng hợp Tùy từng đối tượng mẫu và thiết bị phân tích khác nhau

mà nghiên cứu sẽ lựa chọn các phương pháp xử lý khác nhau, lựa chọn một phương pháp xử lý hoặc kết hợp nhiều phương pháp xử lý phụ thuộc vào nền mẫu đơn giản hay phức tạp

Các nghiên cứu đã công bố hiện nay trên thế giới thường sử dụng các phương pháp xử lý mẫu sau:

Phương pháp thủy phân trong phân tích các sản phẩm chuyển hóa của SC thực chất là phản ứng để ngắt liên kết giữa các sản phẩm chuyển hóa với axít glucuronic để đưa các sản phẩm chuyển hóa về dạng tự do Do đó phương pháp này thường được dùng để phân tích các sản phẩm chuyển hóa trong mẫu dịch sinh học

Có nhiều nghiên cứu công bố phương pháp thủy phân bằng các dung dịch axít khác nhau như:

- Phương pháp chiết pha rắn:

Đây là phương pháp hay được sử dụng nhất hiện nay, phương pháp này có nhiều ưu điểm vượt trội như loại được nhiều tạp chất, dễ tự động hóa Chất hấp phụ hay sử dụng nhiều là C18, C8

1.6.2 Phương pháp phân tích

Để phân tích SC thường sử dụng phương pháp như sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lỏng (LC), sắc ký khí (GC), sắc ký khí khối phổ (GC/MS), sắc ký lỏng khối phổ (LC/MS) Tuy nhiên, phụ thuộc vào lượng chất, tạp chất có trong mẫu phân tích mà nghiên cứu lựa chọn phương pháp phân tích khác nhau Với phương pháp phân tích có độ nhạy kém, giới hạn phát hiện cao như TLC, LC, GC thường sử dụng

để phân tích các SC có trong mẫu tang vật ở dạng tinh thể hay dạng trong thảo dược Còn phương pháp có độ nhạy cao như GC/MS, GC/MS/MS, LC/MS, LC/MS/MS thường được sử dụng để phân tích các chất SC có nồng độ thấp và nền mẫu phức tạp ở trong mẫu dịch sinh học

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

1- Mẫu nước tiểu của người tình nguyện không sử dụng ma túy (mẫu blank), được dùng để nghiên cứu, xây dựng, thẩm định quy trình phân tích

2- Mẫu nước tiểu của người đến giám định ma túy tại Viện Pháp y Quân đội, bệnh viện Tâm thần Hà Nội, các lái xe được kiểm tra ma túy

3- Chất chuẩn cần sa tổng hợp nhóm Naphthoyindoles là JWH-018, 4 chất chuyển hóa và chất nội chuẩn (IS), 2 chất surrogate (Sr) được thể hiện trong bảng 2.1

* Mục tiêu của luận văn như sau:

- Xây dựng quy trình định tính, định lượng JWH-018 và 4 chất chuyển hóa trong mẫu nước tiểu bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ

- Ứng dụng quy trình phân tích mẫu thực tế

Bảng 2.1.Nhóm chất nghiên cứu và các chất chuyển hóa

2 JWH-018 N-4-Hydroxypentyl 10921 Hãng Cayman USA

3 JWH-018 N-5-Hydroxypentyl 9000855 Hãng Cayman USA

4 JWH-018 N-Pentanoic acid 9000856 Hãng Cayman USA

5 JWH-018 6-Hydroxyindole 9000853 Hãng Cayman USA

7 JWH 018 N-5-hydroxypentyl-d5 (Sr) 10933 Hãng Cayman USA

8 JWH 018 6-hydroxyindole-d9 (Sr) 10714 Hãng Cayman USA

2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu

2.2.1 Hóa chất

Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu là tính khiết dùng cho phân tích sắc

ký của hãng Merck, … gồm: aceton, diclometan, hexan, ethanol, methanol, isopropanol, amoniac, HCl, acetic acid, NaOH, ethylacetate, BSTFA + 1 %TMCS, khí nitơ, heli 99,999 %, nước cất loại ion,Na2SO4 khan

Các hóa chất chuẩn g m:

(±) - JWH-018, 5 mg bột ; CAS Number 209414-07-3; Stability ≥ 1

(±) - JWH-018-4OH, nồng độ 1mg/ml methanol; CAS Number 0; Stability ≥ 2

1320363-47-(±) - JWH-018-5OH, nồng độ 1 mg/ml methanol; CAS Number 2; Stability ≥ 2

335161-21-(±) - JWH-018-COOH, nồng độ 1 mg/ml methanol; CAS Number 87-0; Stability ≥ 2

1254475-(±) - JWH-018-6OH, nồng độ 1mg/ml methanol; CAS Number 2; Stability ≥ 1

Cột SPE C8 loại 100 mg của Alltech

Bộ chiết pha rắn 10 vị trí của Agilent

Máy gia nhiệt có độ chính xác ± 0,5 oC

Bộ làm khô mẫu bằng khí nitơ

Máy ly tâm Rotina 380, tốc độ max 14000 vòng/phút

Cân phân tích Satorius độ chính xác 10– 4 g

Máy gia nhiệt: EYELA MG-2200

Tủ sấy: MODEL: MEDDA 05.32-TS của Viettronics

Máy làm khô mẫu bằng khí nitơ: hãng ZipVap

Máy vortex: DLAB MX-S

Thiết bị sắc ký khí khối phổ của Shimadzu GC/MS-QP2020, cột mao quản TG-5MS, kích thước 60 m x 0,25 mm x 0,25 µm

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp hồi cứu

Nghiên cứu tổng quan các tài liệu về đối tượng nghiên cứu, các phương pháp phân tích, các kỹ thuật xử lý mẫu, các bài báo, công trình đã nghiên cứu ở trong và ngoài nước Trên cơ sở đó đưa ra các nội dung tổng quan toàn diện, sau đó tiến hành các nghiên cứu thực nghiệm về điều kiện phân tích sắc ký, điều kiện dẫn xuất hóa mẫu, điều kiện chiết tách, làm sạch chất phân tích, quá trình thủy phân…

3 Phương pháp thực nghiệm

2.3.2.1.Chuẩn bị mẫu và thực hiện nghiên cứu khảo sát iều kiện phân tích

JWH-018 và 4 chất chuyển hóa trên thiết bị phân tích sắc ký khí khối phổ

Các chất chuyển hóa của JWH018 và 2 chất surrogate có nhóm chức (OH; COOH) kém nhạy hơn với GC/MS Do đó để phân tích tốt các chất SC gồm JWH-

-018 và 4 chất chuyển hóa trên thiết bị GC/MS thì các chất chuyển hóa cũng như surrogate có nhóm chức (-OH; -COOH) phải được dẫn xuất bằng tác nhân ankyl silyl Mẫu dùng để khảo sát điều kiện GC/MS được phân tích đơn chất ở chế độ full SCAN, trên cơ sở kết quả nghiên cứu ban đầu đơn chất theo chế độ full SCAN sẽ tiến hành thay đổi các điều kiện GC nhằm các chất được tách nhau ra hoàn toàn, từ kết quả full scan kết hợp với cấu trúc hóa học của các chất sẽ tiến hành lựa chọn các mảnh phổ khối có m/z đặc trưng và tín hiệu cao cho mỗi chất để thiết lập phương pháp phân tích khối phổ ở chế độ SIM Ngoài ra điều kiện sắc ký và khối phổ cũng được khảo sát sâu hơn khi so sánh với nền mẫu blank (khảo sát độ chọn lọc) để cuối

cùng đưa ra được các điều kiện mà các chất phân tích tách nhau ra hoàn toàn, có độ

ổn định cao, không bị trùng với tạp chất có trong nền mẫu máu, nước tiểu

Chuẩn bị mẫu chưa dẫn xuất: Pha các chuẩn đơn chất, nội chuẩn, 2 chất surrogate trong dung môi ethylacetate có nồng độ 20 µg/ml

Chuẩn bị mẫu chuẩn dẫn xuất: Tiến hành phản ứng dẫn xuất 4 đơn chất chuyển hóa và 2 chất surrogate như sau: Lấy 100 µl mỗi đơn chất nồng độ 20 µg/ml trong dung môi ethylacetate, thêm 50 µl BSTFA+1 %TMCS, đậy chặt nắp Thực hiện phản ứng ở 70 oC trong 40 phút

Phân tích trên GC/MS: Phân tích các mẫu chuẩn đơn đã dẫn xuất và

JWH-018, JWH 018-d9 trên thiết bị GC/MS ở chế độ Scan quét toàn bộ các mảnh phổ từ 40-550 m/z Xác định được thời gian lưu (tR) và sơ đồ phổ khối của từng đơn chất,

từ đó lựa chọn được các m/z đặc trưng và giàu để phân tích SIM

2.3.2.2 Chuẩn bị mẫu Blank ể khảo sát ộ chọn lọc

Mục đích của việc khảo sát độ chọn lọc là để đưa ra điều kiện GC/MS có thể

áp dụng được khi phân tích JWH-018, các chất chuyển hóa, nội chuẩn và 2 chất surrogate trong mẫu máu và nước tiểu

Thực hiện trên mẫu máu blank và 3 mẫu nước tiểu blank của 3 người khác nhau không sử dụng ma túy

Chiết lỏng – lỏng 5 ml máu/nước tiểu 3 lần bằng dung môi ethyl acetat, mỗi lần 5ml Gộp dịch chiết lại, thổi dưới dòng khí nitơ đến thể tích 100 µl Dẫn xuất với 50µl BSTFA +1 %TMCS ở nhiệt độ 70 oC trong 60 phút Mẫu dùng để phân tích GC/MS

2.3.2.3 Chuẩn bị mẫu ánh giá ộ ổn ịnh của thiết bị trong 1 ngày

Mục đích: Độ ổn định của thiết bị là tiền đề quan trọng và bắt buộc cho các bước phân tích tiếp theo Việc đánh giá độ ổn định nhằm khảo sát độ tin cậy của thiết bị trong quá trình phân tích

Độ ổn định của thiết bị trong 1 ngày được khảo sát trên 3 mẫu hỗn hợp có hàm lượng khác nhau (SDOD1: 12,5 ng, SDOD2: 100 ng và SDOD3: 800 ng) của 5 chất phân tích, trong đó 4 chất phân tích đã được dẫn xuất với BSTFA+1 %TMCS Hàm

lượng chất nội chuẩn JWH-018-d9 (IS1) trong 3 mẫu là 100 ng được cho vào mẫu sau khi dẫn xuất Thể tích cuối trước khi bơm mẫu 100 µl Giá trị thống kê độ lệch chuẩn tương đối được đánh giá thông qua yếu tố thời gian lưu tương đối và tỷ lệ diện tích pic của 5 chất phân tích với chất nôi chuẩn

2.3.2.4 Khảo sát tìm iều kiện về nhiệt ộ, thời gian ể dẫn xuất 4 chất chuyển hóa JWH-018-4OH, JWH-018-5OH, JWH-018-COOH, JWH-018-6OH

Quy trình chuẩn bị mẫu hỗn hợp chuẩn thực hiện phản ứng dẫn xuất như sau: Lấy chính xác hàm lượng mỗi chất là 1600 ng, thể tích dung môi trước khi dẫn xuất khoảng 50 µl, thêm 50 µl chất dẫn xuất BSTFA +1 %TMCS, tiến hành phản ứng ở 3 điều kiện nhiệt độ khác nhau là 60 oC; 70 oC; 80 oC Mỗi điều kiện nhiệt độ thí nghiệm ở 4 điểm thời gian duy trì dẫn xuất khác nhau là 20, 40, 60, 120 phút Sử dụng JWH-018 làm chất nội chuẩn, hàm lượng trong tất cả các mẫu đã dẫn xuất là

400 ng Mỗi mẫu thí nghiệm thực hiện lặp lại 3 lần lấy giá trị trung bình Số liệu đánh giá dựa vào tỷ lệ diện tích pic của 4 chất đã dẫn xuất chia cho nội chuẩn JWH-018

2.3.2.5 Khảo sát lựa chọn dung môi chiết lỏng lỏng

Thêm hỗn hợp các chất chuẩn vào mẫu nước tiểu được lấy của người không

sử dụng ma túy ở 2 nồng độ khác nhau là 20 ng/ml và 200 ng/ml nước tiểu Mẫu được khảo sát với 3 loại dung môi chiết là Ethylacetate (EA), Diethylether (D), Chloroform (C)

Quy trình chuẩn bị mẫu nước tiểu thêm chuẩn: Lấy hỗn hợp 5 chất phân tích

và 2 chất surrogate vào ống nghiệm 15 ml, làm bay hơi dung môi đến cắn, thêm 5ml nước tiểu đã ly tâm loại cắn, vortex kỹ 5 phút Tiến hành chiết 3 lần, mỗi lần với 5

ml dung môi, lắc mẫu 30 phút trên máy lắc, dịch chiết được lọc qua muối Na2SO4khan Làm bay hơi dịch chiết đến cắn bằng dòng khí nitơ có gia nhiệt ở 40 oC Thêm

50 µl EA và 50 µl tác nhân dẫn xuất Thực hiện phản ứng dẫn xuất theo điều kiện

đã lựa chọn, trước khi phân tích thêm 100 ng chất nội chuẩn JWH-018-d9 vào dịch mẫu đã dẫn xuất Phân tích mẫu trên GC/MS theo điều kiện đã lựa chọn

Quy trình chuẩn bị mẫu chuẩn so sánh: Lấy hỗn hợp 5 chất chuẩn có hàm lượng các chất là 100 ng vào vial 2 ml (dùng để so sánh với mẫu có nồng độ 20

ng/ml nước tiểu) và 1000 ng mỗi chất vào vial 2 ml (dùng để so sánh với mẫu có nồng độ 200 ng/ml nước tiểu) Thể tích dung môi trước khi chiết là 50 µl EA, thêm

50 µl tác nhân dẫn xuất Thực hiện phản ứng dẫn xuất theo điều kiện đã lựa chọn, trước khi phân tích thêm 100 ng chất nội chuẩn JWH-018-d9 vào dịch mẫu đã dẫn xuất Phân tích mẫu trên GC/MS theo điều kiện đã lựa chọn

Kết quả phân tích đánh giá hiệu suất chiết của từng dung môi được so sánh trực tiếp giữa lượng tìm thấy trong mẫu thêm chuẩn và mẫu chuẩn có cùng nồng độ

và được dẫn xuất song song cùng điều kiện

2.3.2.6 Khảo sát khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn ịnh lượng (LOQ) của thiết bị

Khoảng tuyến tính được khảo sát trong khoảng nồng độ từ 125 ng/ml đến

8000 ng/ml Hỗn hợp chất phân tích được pha trong nền dịch chiết mẫu nước tiểu Blank bằng dung môi lựa chọn Tiến hành pha 7 điểm chuẩn lần lượt có hàm lượng các chất phân tích và chất nội chuẩn JWH-018-d9 được thể hiện trong bảng 2.2; Tiến hành phân tích lặp lại 3 lần lấy giá trị trung bình Đường chuẩn nội được dựng dựa vào mối tương quan giữa tỷ lệ lượng chất phân tích và tỷ lệ diện tích pic của chất phân tích với chất nội chuẩn

Bảng 2.2.Hàm lượng các chất khảo sát xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính

Tên chất

Lượng chất phân tích và chất nội chuẩn xây dựng

phương trình hồi quy (ng) Điểm 1 Điểm 2 Điểm 3 Điểm 4 Điểm 5 Điểm 6 Điểm 7 Chất phân tích 12,5 25,0 50,0 100,0 200,0 400,0 800,0 Nội chuẩn 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

Tỷ lệ lượng chất 0,125 0,25 0,5 1,0 2,0 4,0 8,0

Giới hạn phát hiện (LOD) của thiết bị được thực hiện bằng cách phân tích mẫu chuẩn hỗn hợp các chất phân tích pha trong dịch chiết nền mẫu nước tiểu có nồng độ giảm dần Giá trị LOD được xác định khi tỷ lệ S/N = 3, giới hạn định