TIỂU LUẬN xác ĐỊNH POLYPHENOL BẰNG PHƯƠNG PHÁP sắc ký LỎNG CAO áp (HLPC HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY)

Ví dụ, ở tiểu lục địa Ấn Độ , vỏ quả lựu, có nhiều tannin và các polyphenol khác, hoặc nước ép của nó, được sử dụng trong nhuộm vải phi tổng hợp.. Các hợp chất phenolic của rượu vang và

Trang 1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

TIỂU LUẬN XÁC ĐỊNH POLYPHENOL BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP (HLPC - HIGH PERFORMANCE LIQUID

CHROMATOGRAPHY)

Bộ môn: Phương pháp phân tích trong Công nghệ sinh học

Trang 2

TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com

Trang 3

MỤC LỤC

TÀI LIỆU THAM KHẢO

11

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ĐỀ TÀI

2 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com

Trang 4

1 Giới thiệu về polyphenol

1.1 Polyphenol là gì?

Ở thực vật có một cơ chế giúp bảo vệ thực vật chống lại sự phá hoại của tia cực tím và sự xâm nhập của mầm bệnh đó là sản sinh ra các polyphenol thực hiện chức năng như người bảo vệ và tái tạo cấu trúc tế bào

Các hợp chất polyphenol là các sản phẩm tự nhiên "có cấu trúc polyphenol (tức là, một số

nhóm hydroxyl trên vòng thơm )" bao gồm bốn nhóm chính

Flavonoid: chiếm khoảng 60% của tất cả các polyphenol, bao gồm:

kaempferol,quercetin, catechin và anthocyanin

Axit phenolic: chiếm khoảng 30% các polyphenol, như: stilben, lignans

Polyphenolic amid: bao gồm những hoạt chất như avenanthramides trong yến mạch

và capsaicinoids trong ớt

Các polyphenol khác: bao gồm axit ellagic trong quả mọng, lignans trong hạt lanh, hạt vừng, resveratrol trong rượu vang đỏ, chất curcumin trong củ nghệ Các polyphenol được coi là dưỡng chất đóng vai trò quan trọng trong sức khỏe của con người

Polyphenol thường là các phân tử lớn hơn ( đại phân tử ) Giới hạn trọng lượng phân tử trên của chúng là khoảng 800 dalton , cho phép khả năng khuếch tán nhanh chóng qua màng tế bào

để chúng có thể đến các vị trí hoạt động nội bào hoặc vẫn ở dạng sắc tố sau khi tế bào hình thành

2 Tác dụng của polyphenol

Gần đây, người ta quan tâm nhiều đến các hợp chất polyphenol này vì chúng hoạt động như chất chống oxy hóa giúp vô hiệu hóa các gốc tự do có hại gây hại cho tế bào và ngăn ngừa tình trạng oxidative stress Oxidative stress liên quan đến một số bệnh như tiểu đường và bệnh tim và một số loại ung thư

Polyphenol mang lại một số lợi ích đối với sức khỏe:

Một số polyphenol thường được sử dụng làm thuốc nhuộm Ví dụ, ở tiểu lục địa Ấn Độ , vỏ quả lựu, có nhiều tannin và các polyphenol khác, hoặc nước ép của nó, được sử dụng trong nhuộm vải phi tổng hợp

Polyphenol, đặc biệt là tannin, được sử dụng truyền thống cho da thuộc da và ngày nay cũng là tiền chất trong hóa học xanh, đặc biệt là sản xuất nhựa hoặc nhựa bằng cách polyme hóa hoặc không sử dụng formaldehyde hoặc chất kết dính cho các hạt Mục tiêu nói chung là sử dụng dư lượng thực vật từ nho, ô liu (gọi là pomaces ) hoặc vỏ quả hồ đào còn sót lại sau khi chế biến

3 Tác dụng không mong muốn của polyphenol

Trang 5

Mặc dù polyphenol không thể thiếu đối với sức khỏe, bên cạnh những tác dụng tiêu thụ quá mức hợp chất này cũng có khả năng gây ra tác dụng không mong muốn

Các nghiên cứu trên động vật cho thấy việc bổ sung polyphenol liều cao có thể gây tổn thương thận, gây ra phát triển khối u và gây mất cân bằng nồng độ hormone tuyến giáp Ở người, việc sử dụng polyphenol quá nhiều có thể dẫn đến tăng nguy cơ gây đột quỵ và tử vong sớm

Ngoài ra, bạn cần lưu ý rằng một số loại thực phẩm giàu polyphenol có thể tương tác với sự hấp thu các chất dinh dưỡng hoặc tương tác với thuốc Chẳng hạn như polyphenol có thể giảm khả năng hấp thụ sắt, thiamine hoặc folate của cơ thể

Không những vậy, khi bạn tiêu thụ số lượng lớn một số loại thực phẩm giàu polyphenol như đậu

Hà Lan có thể gây ra các triệu chứng tiêu hóa khó chịu như: đầy hơi, khó tiêu

4 Lý do chọn đề tài

Sự hiện diện của các hợp chất phenolic khác nhau làm cho nho trở thành một nguồn chất chống oxy hóa quan trọng Hoạt động chống oxy hóa của polyphenol trong chế độ ăn uống được coi là lớn hơn vitamin và hàm lượng polyphenol trong nho phản ánh các chất có lợi cho sức khỏe Giống nho (Vitis viniferaL.) là một trong những loại trái cây có hàm lượng hợp chất phenol cao nhất Các hợp chất phenolic của rượu vang và các sản phẩm phụ của rượu vang đã thu hút được nhiều sự quan tâm

do tính chất chống oxy hóa và kháng khuẩn cũng như các tác dụng có lợi cho sức khỏe con người của chúng

Nhiều công nhân đã báo cáo tầm quan trọng của các hợp chất phenolic là chất bảo vệ sức khỏe con người theo những cách khác nhau Rượu là một trong những đồ uống được tiêu thụ nhiều nhất trên thế giới Mức tiêu thụ đã tăng lên đáng kể do nhận thức về các đặc tính tăng cường sức khỏe trong các loại rượu vang được truyền đạt bởi các hợp chất polyphenol khác nhau như flavonoid, anthocyanins, tannin, v.v Các hợp chất phenol là thành phần quan trọng chính của rượu vang quyết định chất lượng rượu do ảnh hưởng trực tiếp đến cảm quan của chúng đặc tính của rượu vang như màu sắc, hương vị, vị đắng, làm se và hương thơm Chất lượng nho làm rượu vang là một trong những yếu tố chính góp phần vào chất lượng cuối cùng của rượu vang

Để chọn giống nho sản xuất rượu vang, không chỉ cần chú trọng đến năng suất kinh tế, khả năng chống chịu sâu bệnh, thu hồi nước trái cây, hàm lượng đường và axit mà còn phải chú trọng đến các đặc tính chức năng như anthocyanins, phenolics, tannin, v.v Không chỉ hàm lượng tổng số anthocyanins, phenol và tannin, thành phần của chúng cũng có một vai trò quan trọng trong việc quyết định chất lượng rượu

Vì các điều kiện trồng nho có vai trò quyết định hàm lượng của phenol trong nho, nên cuộc điều tra hiện tại đã được thực hiện để xác định hàm lượng phenol trong nho làm rượu Nó sẽ dẫn đến việc định lượng thành phần phenolic ở giai đoạn thu hoạch và thiết lập cơ sở để phân biệt các giống nho làm rượu dựa trên thành phần phenolic cũng như độ chín của phenolic của nho

5 Các phương pháp xác định polyphenol

Việc lựa chọn các phương pháp phù hợp và hiệu quả để tách lớn các hợp chất phenolic có hoạt tính sinh học từ các mô thực vật luôn là một vấn đề quan trọng trong cộng đồng khoa học

Các phương pháp tách truyền thống cho polyphenol như chiết lỏng-lỏng, sắc ký lớp mỏng(thin layer chromatography – TLC), sắc ký lỏng hiệu năng cao(HPLC)

6 Giới thiệu chung về phương pháp sắc ký

Trang 6

6.1 Lịch sử phương pháp sắc ký:

Nhà thực vật học người Nga Mikhail Tsvet (Mikhail Semyonovich Tsvet) phát minh

ra kĩ thuật sắc ký vào năm 1903 khi ông đang nghiên cứu về chlorophyl Năm 1952 Archer John Porter Martin và Richard Laurence Millington Synge được trao giải Nobel Hoá học cho phát minh của họ về sắc ký phân bố Kĩ thuật sắc ký phát triển nhanh

chóng trong suốt thế kỉ 20 Các nhà nghiên cứu nhận thấy nguyên tắc nền tảng của sắc

ký Tsvet có thể được áp dụng theo nhiều cách khác nhau, từ đó xuất hiện nhiều loại sắc

ký khác nhau Đồng thời, kĩ thuật thực hiện sắc ký cũng tiến bộ liên tục, cho phép phân tích các phân tử tương tự nhau

6.2 Nguyên lí cơ bản của phương pháp sắc ký:

Sắc ký là một phương pháp vật lý để phân tách, phân li, phân ích các chất dựa trên sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và pha tĩnh Có nhiều nguyên nhân đưa đến

sự phân bố khác nhau giữa các chất, nhưng chính sự lặp đi lặp lại hiện tượng hấp phụ

- phản hấp phụ của các chất khi dòng pha động chuyển động qua pha tĩnh là nguyên nhân chủ yếu của việc tách sắc ký Hầu hết các phương pháp sắc ký đều dựa trên nguyên tắc trên, và hiệu quả của từng phương pháp phụ thuộc vào sự lựa chọn giữa pha động và pha

Pha động Mẫu

Pha tĩnh Phân tách các chất

Sơ đồ 1 Nguyên lí cơ bản của phương pháp sắc kí

tĩnh

6.3 Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Năm 1967, giáo sư Csaba Horváth là tác giả tạo ra máy HPLC để nghiên cứu

nucleotide Phương pháp có các ưu điểm như áp suất cao, độ phân giải cao, vận tốc sắc

ký nhanh, HPLC được áp dụng trong rất nhiều lĩnh vực nghiên cứu đa dạng như phân tích dược phẩm, các dung dịch sinh lý, polymer thiên nhiên hoặc tổng hợp, các loại dư lượng trong môi trường, các hợp chất vô cơ,… Phương pháp HPLC không làm hư hại mẫu phân tích nên có tỉ lệ thu hồi mẫu cao, thường từ 90-100%, mẫu thu hồi có thể thực hiện các loại nghiên cứu khác như phân tích phổ, thử nghiệm hoạt tính sinh học

Trang 7

Pha động

Hệ thống chuyển dung môi

Hệ thống bơm mẫu

Chuẩn bị mẫu

Cột sắc

Hệ thống xử lý

dữ liệu

Sơ đồ 2 Nguyên lí của phương pháp Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

HPLC dựa vào pha động (dạng lỏng) để phân tách các thành phần trộn lẫn vào nhau Những thành phần này đầu tiên được hoà tan vào trong dung môi và sau đó dưới tác dụng của áp suất cao, chúng sẽ bị lôi kéo di chuyển qua cột sắc ký Trong cột, hỗn hợp sẽ được phân tác thành những cấu tử

Sự tương tác giữa chất tan với pha động và pha tĩnh có thể phụ thuộc và sự chọn lựa khác nhau của dung môi, pha tĩnh HPLC cho kết quả thu được nhiều cấu tử khác nhay mà các kỹ thuật sắc ký khác không thực hiện được và dễ dàng phân tách số lượng lớn các chất hoá học trộn lẫn vào nhau

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1 Điều kiện chạy máy HPLC

Dụng cụ Máy dò mảng diode (1260 infinity, Agilent Technologies)

Pha động A (0,2% axit axetic trong 10% axetonitril-99%) và B (0,2% axit

axetic trong axetonitril-1%)

Thời gian chạy sắc ký 20 phút/lần tiêm

6

Trang 8

TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com

2 Phương pháp thực nghiệm

2.1.Thu thập và chuẩn bị mẫu

Từ mỗi giống, một kg mẫu quả mọng được thu thập ngẫu nhiên từ phần

trên, dưới và giữa của các chùm từ những

cây nho được xác định khác nhau từ mỗi lần

nhân rộng Các chùm được thu hoạch ở độ

chín kỹ thuật khi quả đạt được tổng chất rắn

hòa tan (TSS) trong khoảng 22–24 độ C

Các mẫu quả mọng thu thập được được

đóng gói trong túi polythene cấp thực phẩm

và được bảo quản ở - 20 -C để nghiên cứu

thêm Các quả mọng đã được làm sạch và

sau đó đồng nhất

Để chiết các hợp chất phenolic, 1 g mẫu đồng nhất được hút vào ống

polypropylene 15 ml chứa 5 ml axit formic

0,1% trong metanol 20% Hỗn hợp được

quay xoáy trong 1 phút sau đó được ly tâm

ở tốc độ 5000 vòng / phút trong 5 phút Một

ml phần nổi phía trên được chuyển vào một

ống siêu nhỏ và lại được ly tâm ở tốc độ

10.000 vòng / phút ở 4C trong 10 phút

Phần nổi phía trên được lọc qua màng lọc

0,2μm và dịch lọc được sử dụng để phân

tích

1 gam mẫu

5ml axit fomic 0,1% trong metanol

20%

Quay xoáy trong vòng 1

phút

Li tâm hỗn hợp tốc độ 5000 vòng/phút,

nhiệt độ phòng

Ly tâm dịch nổi ở tốc độ 10

000 vòng/phút, ở 4°C trong 10 phút

Lọc dịch nổi lên trên qua bằng màng

lọc 0,2μm

2.2 Chuẩn bị các dung dịch tiêu chuẩn

Các chất chuẩn đối chiếu được chứng nhận riêng lẻ của tất cả các hợp chất thử nghiệm được mua từ Sigma- Aldrich với độ tinh khiết hơn 90% Metanol (loại HPLC) được cung cấp bởi Sigma-Aldrich, và các thuốc thử khác được lấy từ Thomas Baker

Dung dịch gốc chuẩn của mỗi hợp chất phenol được chuẩn bị bằng cách hòa tan 10 mg chất phân tích riêng lẻ trong 10 ml metanol và được bảo quản ở - 20°C Dung dịch làm việc trung gian 10 mg / L được chuẩn bị bằng cách trộn thể tích thích hợp của từng dung dịch gốc trong metanol

3 Kết quả

Bảng 1: Các hợp chất phenolic từ các giống nho làm rượu vang đỏ

Trang 9

Trang 10

Bảng 2Các hợp chất phenolic từ các giống nho làm rượu vang trắng

Trang 11

Hình 1: Sắc ký đồ của phenol chuẩn ở mức độ tập trung 100lg/ml((1: Axit gallic; 2: Axit chlogenic; 3: Axit caftaric; 4: Axit vanilic; 5: Catechin; 6: Epicatechin; 7: Quercetin; 8: Kampherol và 9: Resveratro)

Trang 12

Hình 2: Hình 2Sắc ký đồ của phenol trong mẫu (Cabernet Sauvignon) (1: Axit gallic; 2: Axit chlogenic; 3: Axit caftaric; 4: Axit vani; 5: Catechin; 6 và Epicatechin;

Nhận xét:

Trong số các hợp chất không phải flavonoid, axit gallic là hợp chất chính được tìm thấy trong nho làm rượu vang đỏ, dao động từ 1,846 mg / kg ở Petit Verdot đến 0,635 mg / kg ở giống Caladoc (Bảng1) Các giống rượu vang trắng cho thấy nồng độ axit gallic hơi thấp so với các giống rượu vang đỏ, dao động từ 0,780 mg / kg ở giống Gros Meseng đến 0,537 mg / kg ở giống Vermentino Gros Meseng chứa nồng độ catechin cao nhất (10,304 mg / kg) trong khi nồng độ catechin thấp nhất được ghi nhận ở Vermentino

Flavan-3-ol được tìm thấy trong hạt nho Hàm lượng flavan-3-ol trong hạt cao hơn quả mọng Điều này chỉ ra rằng tổng số hạt trong quả nho đóng một vai trò quan trọng trong tổng hàm lượng catechin và epicatechin trong toàn bộ quả nho

Trong các giống nho làm rượu được nghiên cứu, piceatannol nằm trong khoảng từ 16,86 mg /

kg ở Caladoc đến 0,52 mg / kg ở Niellucio Các loại quả mọng màu đỏ chứa tỷ lệ piceatannol cao hơn so với nho làm rượu vang trắng Trong các giống rượu vang trắng, nồng độ dao động từ 0,61

mg / kg ở Muscat White đến mức thấp nhất ở Colombard (0,15 mg / kg) Taware và cộng sự ( 2010) báo cáo sự tích tụ piceatannol tăng lên trong lá và quả ở giai đoạn sau nhiễm bệnh Do đó,

sự thay đổi về nồng độ của piceatannol có thể là do khả năng phát triển hệ thống miễn dịch của cây nho chống lại các mầm bệnh (Hình1và2)

4 Tổng kết

Để phân biệt các giống nho làm rượu dựa trên hàm lượng phenolic của chúng, Sự khác biệt của các giống rượu vang bằng cách sử dụng phân tích thống kê có thể được sử dụng để lựa chọn các loại nho làm rượu thích hợp cho việc chuẩn bị các loại rượu vang có chất lượng cụ thể Trong nghiên cứu này, phân tích thành phần chính cho phép tách các loại rượu theo hàm lượng polyphenol Hiệu suất của sự đa dạng trong mỗi nhóm là khác nhau về hợp chất phenolic có sẵn Dựa trên các hợp chất phenolic và cấu trúc của chúng, các giống nho làm rượu vang có thể được phân biệt Trên cơ sở dữ liệu thu được từ nghiên cứu hiện tại, có thể kết luận rằng đặc tính cơ bản của giống chịu trách nhiệm cho sự biểu hiện của các hợp chất phenolic chính trong quả nho Các

Trang 13

biểu thức đã được ghi lại dưới dạng các biến thể phenolic Thông tin được tạo ra có thể hữu ích cho việc tối ưu hóa quy trình làm rượu để tạo ra rượu chất lượng từ điều kiện khí hậu nhiệt đới

TÀI LIỆU THAM KHẢO

https://123docz.net/document/193216-flavonoids-la-polyphenols.htm

https://tailieumienphi.vn/doc/nho-chong-lai-hoi-chung-chuyen-hoa-ffm6tq.html

https://sci-hub.se/10.1016/j.foodchem.2015.06.101

https://sci-hub.se/10.1016/s0021-9673(99)01225-x

https://sci-hub.se/10.1016/j.chroma.2003.08.034

https://sci-hub.se/10.1007/s13197-018-3438-x

https://vi.wikipedia.org/wiki/S%E1%BA%AFc_k%C3%BD_l%E1%BB%8Fng_hi%E1%BB%87u_n

%C4%83ng_cao

https://nhathuocngocanh.com/phuong-phap-sac-ky-long-hieu-nang-cao-hplc/

https://hellobacsi.com/an-uong-lanh-manh/thong-tin-dinh-duong/tac-dung-cua-polyphenol/

https://en.wikipedia.org/wiki/Polyphenol

Định dạng
Số trang	13
Dung lượng	1,16 MB