Căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện tại Hà Nội và dịch tễ học phân tử của Pseudomonas aeruginosa đa kháng thuốc

Căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện tại Hà Nội và dịch tễ học phân tử của Pseudomonas aeruginosa đa kháng thuốc

VIÖN VÖ SINH DÞCH TÔ TRUNG ¦¥NG

**************

NGUYÔN V¡N HIÕU

C¨n nguyªn vi khuÈn g©y nhiÔm trïng bÖnh viÖn t¹i Hμ Néi

®a kh¸ng thuèc

Chuyªn ngµnh : Vi khuÈn häc M· sè : 62 72 68 01

tãm t¾t luËn ¸n tiÕn sü y häc

Hμ néi - 2009 c«ng tr×nh ®−îc hoμn thμnh t¹i : ViÖn VÖ sinh dÞch tÔ trung −¬ng

- PGS.TS §Æng §øc Anh

- PGS.TS TrÇn Thuý H¹nh

Ph¶n biÖn 1 : GS.TSKH NguyÔn V¨n DÞp

Ph¶n biÖn 2 : GS.TS TrÇn quþ

Ph¶n biÖn 3 : PGS.TS Bïi Kh¾c HËu

Vµo håi : 9 giê 00 ngµy 15 th¸ng 7 n¨m 2009

cã thÓ t×m hiÓu luËn ¸n t¹i :

- Th− viÖn ViÖn VÖ sinh dÞch tÔ trung −¬ng

- Th− viÖn Quèc gia

- ViÖn Th«ng tin – Th− viÖn Y häc trung −¬ng

liên quan đến luận án

1 Nguyễn Văn Hiếu, Hoàng Thuỷ Long, Đinh Hữu Dung (2002), “Tìm hiểu về vai trò lây

truyền vi khuẩn bệnh viện trên máy trợ hô hấp”, Tạp chí Y học dự phòng, tập XII, 4(55), tr

17-21

2 Nguyễn Văn Hiếu, Hoàng Thuỷ Long (2004), “Cơ cấu và sự nhạy cảm kháng sinh của vi

khuẩn gây viêm phế quản phổi bệnh viện trên bệnh nhân thông khí nhân tạo”, Tạp chí Y học

dự phòng, tập XVI, 2+3 (66), tr 55-58

3 Nguyễn Văn Hiếu, Đặng Đức Anh, Trần Thuý Hạnh, Nguyễn Gia Bình (2007), “Tình trạng

đa kháng thuốc của một số chủng Pseudomonas aeruginosa phân lập đ−ợc tại bệnh viện Bạch Mai”, Y học thực hành, 564, tr 14-15

4 Nguyễn Văn Hiếu, Đặng Đức Anh, Trần Thuý Hạnh, Nguyễn Gia Bình (2008), “Tình trạng

đa kháng kháng sinh của các chủng Acinetobacter spp gây nhiễm trùng bệnh viện”, Tạp chí Y

học dự phòng, 5(97), tr 18-23

5 Nguyễn Văn Hiếu, Đặng Đức Anh, Trần Thuý Hạnh, Nguyễn Gia Bình (2008), “Tình trạng

đa kháng thuốc của các chủng Pseudomonas aeruginosa phân lập đ−ợc tại bệnh viện ở Hà Nội”, Tạp chí Y học dự phòng, 5(97), tr 65-70

6 Nguyễn Văn Hiếu, Đặng Đức Anh, Trần Thuý Hạnh, Đinh Duy Kháng (2009), “Tính đa

hình RAPD của các chủng P.aeruginosa đa kháng thuốc gây nhiễm trùng bệnh viện tại Hà Nội”, Tạp chí Y học lâm sàng, tr 33 – 39

Danh môc ch÷ viÕt t¾t

ATCC American Type Culture Collection, Mü CDC Trung t©m kiÓm so¸t vµ phßng chèng bÖnh tËt

Hoa Kú (Centers for Diseases Control and Prevention)

§TTC §iÒu trÞ tÝch cùc MRSA Tô cÇu vµng kh¸ng methicillin

(Methicillin-resistant Staphyloccus aureus)

NTBV NhiÔm trïng bÖnh viÖn NTP NhiÔm trïng phæi NTVM NhiÔm trïng vÕt mæ NTB NhiÔm trïng báng NCCLS ñy ban quèc gia vÒ tiªu chuÈn phßng thÝ

nghiÖm l©m sµng (National Committee for Clinical Laboratory Standards

RAPD Ph©n tÝch ®a h×nh ADN genom b»ng nh©n b¶n

ngÉu nhiªn (Random Amplified Polymorphic DNA)

VSV Vi sinh vËt VRE CÇu khuÈn ®−êng ruét kh¸ng Vancomycin

(Enterococcus Resistance Vancomycin) WHO Tæ chøc Y tÕ thÕ giíi (World Health

Organization)

Mở đầu

1 Đặt vấn đề:

Nhiễm trùng bệnh viện đang có xu hướng gia tăng trên toàn cầu ở thế kỷ 21 và thậm chí ở mức báo động khi mà tình trạng kháng kháng sinh của các vi sinh vật ngày càng gia tăng và lan rộng Nhiễm trùng bệnh viện đã làm ảnh hưởng đáng kể chất lượng sống của bệnh nhân, tăng gánh nặng về chi phí cho chăm sóc và điều trị

Việc lựa chọn vội vã các kháng sinh có phổ tác dụng rộng và thay đổi thuốc liên tục trong

điều trị, việc quá tải bệnh nhân ở các bệnh viện đã làm nổi lên áp lực chọn lọc với các chủng vi khuẩn đa kháng thuốc và làm xuất hiện những cơ hội mới cho nhiễm trùng phát triển

Nguồn vi sinh vật do từ môi trường bên ngoài xâm nhập vào cơ thể và do các VSV gây bệnh ký sinh ở người Những chủng vi khuẩn bệnh viện theo quy luật có tính kháng kháng sinh cao

và thường là đa kháng Ngày nay các vi khuẩn gây bệnh chủ yếu là Staphylococci và các trực khuẩn

Gram (-), đang trở thành một tai hoạ thực sự cho các bệnh viện ngoại khoa; tiết niệu; các Khoa hồi sức và điều trị tích cực; các Khoa chuyên nuôi dưỡng trẻ đẻ non và những trung tâm bỏng

Một trong những loài vi khuẩn Gram (-) gây nhiễm trùng bệnh viện phổ biến và nguy hiểm

hiện nay là Pseudomonas aeruginosa Tốc độ kháng của vi khuẩn này với các nhóm kháng sinh

cũng tăng nhanh và lan rộng ở hầu hết các cơ sở y tế trên toàn cầu, trong đó có Việt Nam

Với ý nghĩa thực tiễn trên chúng tôi tiến hành đề tài “Căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm

trùng bệnh viện tại Hà Nội và Dịch tễ học phân tử của Pseudomonas aeruginosa đa kháng thuốc”

2 Mục tiêu nghiên cứu:

2.1 Xác định cơ cấu các loài vi khuẩn đa kháng thuốc gây nhiễm trùng bệnh viện tại Hà Nội

2.2 Xác định tính đa dạng chủng Pseudomonas aeruginosa đa kháng thuốc

3 Nội dung nghiên cứu:

3.1 Phân lập và định danh các loài vi khuẩn gây nhiễm trùng cơ hội bệnh viện

3.2 Xác định tính nhạy cảm kháng sinh của các vi khuẩn phân lập được với kháng sinh thông dụng

3.3 Xác định sự phân bố các typ huyết thanh và tính đa dạng kiểu gen của các chủng P.aeruginosa

đa kháng thuốc phân lập được

4 Những đóng góp mới của luận án:

4.1 Xác định tính đa dạng kiểu hình và kiểu gen các loài P.aeruginosa đa kháng thuốc tại Hà Nội 4.2 Đề xuất lựa chọn chủng P.aeruginosa phân lập được trong nước để nghiên cứu sản xuất vắc xin

và huyết thanh

4.3 Về mặt khoa học, đây là nghiên cứu có sự phối hợp giữa Miễn dịch học - Sinh học phân tử - RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), để tìm ra sự phân bố và mối quan hệ di truyền giữa các serotyp

và genotyp chủng P aerugonosa phân lập được ở Hà Nội

5 Bố cục luận án:

Luận án gồm 138 trang, 4 chương, 238 tài liệu tham khảo, 31 bảng, 7 hình và 8 biểu đồ (không kể phần phụ lục, mục lục và danh mục các chữ viết tắt)

Chương 1 Tổng quan 1.1 Khái niệm và định nghĩa nhiễm trùng bệnh viện

Nhiễm trùng bệnh viện là một nhiễm trùng mắc phải (Acquired infection) tại bệnh viện và

được coi như một nhiễm trùng cục bộ, nó không có mặt vào thời điểm bệnh nhân được nhập viện Dựa trên những tiêu chuẩn lâm sàng và sinh học, có khoảng 50 loại nhiễm trùng khác nhau xảy ra tại bệnh viện

Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), nhiễm trùng bệnh viện được định nghĩa như sau: "

Nhiễm trùng bệnh viện là những nhiễm trùng mắc phải trong thời gian điều trị tại bệnh viện mà thời điểm nhập viện hoặc trước đó không thấy có yếu tố nhiễm khuẩn hay ủ bệnh nào Nhiễm trùng xuất hiện sau 48 giờ sau khi nhập viện thường được coi là nhiễm trùng bệnh viện "

Tỉ lệ nhiễm trùng bệnh viện đang gia tăng ở hầu hết các Châu lục và đang là vấn đề thách thức về chất lượng khám chữa bệnh tại các bệnh viện Theo báo cáo của WHO, hiện các nước phát triển có tới 5 - 10% bệnh nhân nằm viện mắc ít nhất một loại nhiễm trùng bệnh viện Tỷ lệ này ở các nước đang phát triển cao gấp từ 2 - 20 lần và đã làm tăng đáng kể tỷ lệ tử vong, chi phí cho chăm sóc và thuốc điều trị

1.2 Dịch tễ học

1.2.1 Các tác nhân gây nhiễm trùng bệnh viện

Nguyên nhân nhiễm trùng bệnh viện thường là do vi khuẩn gây nên và cũng có thể do vi rút, nấm và ký sinh trùng, nhưng căn nguyên do ký sinh trùng thường ít Vi khuẩn gây NTBV trong vài thập kỷ qua đã có nhiều thay đổi cơ cấu về chủng loài, các vi khuẩn gây bệnh chủ yếu hiện nay

là S.aureus và các trực khuẩn Gram (-) Nhiễm trùng bệnh viện do nấm thường xuất hiện do điều trị

kháng sinh kéo dài và bệnh nhân suy yếu hệ miễn dịch

Vi sinh vật xâm nhập vào cơ thể có thể từ môi trường bên ngoài và vi sinh vật ở người là những VSV gây bệnh cơ hội và chủ yếu là vi khuẩn Gram (-)

Các trực khuẩn Gram (-) gồm Acinetobacter spp, Klebsiella spp, P.aeruginosa, E coli

thường có liên quan đến NTBV và phổ biến ở những bệnh nhân nhiễm trùng phổi tại Khoa ĐTTC

Và khả năng kháng kháng sinh đã tăng lên đáng kể đối với một số liệu pháp điều trị phối hợp kháng sinh

1.2.2 Các yếu tố nguy cơ

- Môi trường: gồm có không khí, nước và môi trường phục vụ Vi khuẩn trong không khí chủ yếu

là các cầu khuẩn Gram (+) và các vi rút lây truyền qua đường không khí như vi rút cúm, vi rút

đường hô hấp vi khuẩn lao và thuỷ đậu Bào tử nấm Aspergillus có thể lan truyền trong không khí,

và dễ bị hít phải Nước là nơi chứa một số loại vi sinh vật gồm vi khuẩn, vi rút và nấm, nếu hệ thống thoát nước không kín gây rò rỉ sẽ làm ô nhiễm môi trường

- Bệnh nhân: Con người đóng vai trò như nguồn vi sinh vật, truyền vi sinh vật và cảm thụ vi sinh

vật, nhiễm trùng có thể từ người này sang người khác trong bệnh viện thông qua các đồ vật mới bị

nhiễm bẩn hoặc có thể do vi sinh vật ký sinh của chính bệnh nhân

- Khám và điều trị: Tỷ lệ các nhiễm trùng bệnh viện liên quan đến qui trình điều trị xâm nhập hoặc

dụng cụ xâm nhập chiếm xấp xỉ 80% tổng số các nhiễm trùng

- Kháng sinh: Sử dụng kháng sinh không hợp lý sẽ làm tăng chủng vi khuẩn kháng thuốc do có sự

phối hợp chọn lọc tự nhiên và thay đổi các thành phần gen kháng thuốc của vi sinh vật

1.2.3 Các loại nhiễm trùng

Ngày nay hầu hết các nghiên cứu về nhiễm trùng bệnh viện đều cho thấy nhiễm trùng bệnh viện thường liên quan đến Khoa ĐTTC trong đó phổ biến là nhiễm trùng phổi, sau đó là nhiễm

trùng huyết, nhiễm trùng tiết niệu và nhiễm trùng vết mổ Bệnh nhân suy giảm hệ miễn dịch, phải

sử dụng ống thở, phẫu thuật khí quản, tuổi cao và bệnh mạn tính là những yếu tố thuận lợi dẫn đến nhiễm trùng

Chương 2

đối tượng vμ phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Bệnh nhân nhiễm trùng phổi (NTP) do thở máy tại bệnh viện Bạch Mai

- Bệnh nhân nhiễm trùng bỏng (NTB) tại Viện Bỏng quốc gia

- Bệnh nhân nhiễm trùng vết mổ (NTVM) tại bệnh viện Việt Đức

- Các chủng vi khuẩn phân lập được từ bệnh phẩm nhiễm trùng

Thời gian nghiên cứu: + từ 12/2005 đến 3/2007 : đọc tài liệu

+ từ 4/2007 đến 6/2008 : thu thập và xử lý bệnh phẩm, xử lý số liệu

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Vật liệu nghiên cứu

- Thiết bị phòng thí nghiệm; môi trường MacConkey, Pseudocel Agar, thạch máu, Endo

- Sinh phẩm định danh vi khuẩn : API 20 NE, API 20E

2.2.2 Phương pháp chọn mẫu

- Nghiên cứu ngang mô tả; cỡ mẫu nghiên cứu theo công thức:

n = Z2

α/2 pq/d 2

+ Cỡ mẫu trên bệnh nhân nhiễm trùng phổi : 94 bệnh phẩm

+ Cỡ mẫu trên bệnh nhân nhiễm trùng bỏng : 89 bệnh phẩm

+ Cỡ mẫu được trên bệnh nhân nhiễm trùng vết mổ : 52 bệnh phẩm

- Tổng số bệnh phẩm cần cho nghiên cứu là: 235 bệnh phẩm

2.2.4 Kỹ thuật định danh vi khuẩn

- Sử dụng kít API 20 E: để định danh vi khuẩn đường ruột hoặc các trực khuẩn Gram âm dễ mọc

- Sử dụng kít API 20 NE: để định danh vi khuẩn không thuộc họ vi khuẩn đường ruột hoặc các trực

khuẩn Gram âm khác

2.2.5 Kỹ thuật ngưng kết kháng huyết thanh kháng P.aeruginosa

Sử dụng bộ huyết thanh miễn dịch P.aeruginosa kháng O đặc hiệu, gồm 16 typ từ O1->

O16 (P1-> P16) và hiện nay đang được sử dụng rộng rãi tại các quốc gia, do Sanofi cung cấp

2.2.6 Kỹ thuật kháng sinh đồ khoanh giấy khuếch tán

- Môi trường làm kháng sinh đồ: Mueller-Hinton Agar; Mueller-Hinton-Chocolate

- Khoanh giấy kháng sinh thử nghiệm do hãng Sanofi cung cấp

- Chủng vi khuẩn được hoà vào nước muối 0,9% tạo huyền dịch có độ đục 0,5 McFland Láng huyền dịch lên mặt đĩa môi trường Mueller-Hinton, đặt khoanh giấy kháng sinh, ủ ấm 37 0

C, 18 -

24 giờ

- Đọc kết quả: đo đường kính vùng ức chế của vi khuẩn với các khoanh giấy kháng sinh thử nghiệm So sánh với bảng giới hạn độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh, theo tiêu chuẩn của NCCLS (National Commitee for Clinical Laboratory Standards)

2.2.7 Kỹ thuật RAPD

- Chỉ thị ADN (Invitrogen); enzym hạn chế; Taq ADN polymeraza

- Các mồi dùng để phát hiện tính đa hình bằng nhân bản ngẫu nhiên ADN genom (OPA4, OPA10,

OPL12) do hãng Invitrogen cung cấp

- Nồng độ ADN được xác định bằng đo độ hấp phụ ở bước sóng 260nm (A260) nhờ máy quang phổ Hewlett Packard (Mỹ)

- Mức độ sạch của ADN đã tách chiết Độ tinh sạch được xác định bằng tỉ số A260/A280≥ 1,8

2.2.7.4 Chu trình phản ứng RAPD

Chu trình nhiệt : 950

- 3 phút, 950

C - 1 phút, 310

C -1 phút, 720

C - 2 phút (45 chu kỳ -từ bước 2 đến bước 4), 720

C - 7 phút, kết thúc ở 40

C

2.3 Xử lý số liệu

- Phần mềm máy tính MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis), version 3.1 và NTSYSpc 2.0 được sử dụng để phân tích số liệu trình tự và kết quả của phản ứng RAPD

- Xử lý thống kê t-test bằng phần mềm STATA

- Kết quả khác trong nghiên cứu được xử lý bằng phần mềm Excel

Chương 3 Kết quả nghiên cứu 3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn

Bảng 3.1 Tỷ lệ bệnh phẩm phân lập có nhiễm khuẩn

nhiễm khuẩn

Không

( 87,3)

15 ( 12,7)

118 (100)

(100)

0 ( 0,0)

126 (100)

( 71,3)

23 ( 28,7)

80 (100)

(88,3)

38 (11,7)

324 (100)

Kết quả (Bảng 3.1) cho thấy tỷ lệ bệnh phẩm phát hiện có nhiễm khuẩn là 88,3% và không nhiễm khuẩn là 11,7% Số bệnh phẩm NTB có tỷ lệ phát hiện nhiễm khuẩn cao chiếm 100%; NTP

có tỷ lệ phát hiện nhiễm khuẩn là 87,3% và NTVB là 71,3%

Bảng 3.2 Sự phân bố các vi khuẩn Gram (-)

Kết quả phân lập

Bệnh

phẩm

n % n % n % N %

Kết quả (Bảng 3.2) cho thấy các trực khuẩn Gram (-) gây nhiễm trùng bệnh viện thường chiếm tỷ lệ cao ở hầu hết các loại nhiễm trùng bệnh viện và chiếm tỷ lệ cao nhất 78,5%; sau đó là

vi khuẩn Gram (+) là 17,7% và nấm là 3,8%.

Bảng 3.3 Sự phân bố các loại vi sinh vật phân lập được

Nguồn bệnh phẩm NTP

(n = 162)

NTB (n = 174)

NTVM (n = 83)

Tổng (N = 419)

Vi sinh vật phân lập được

Gram

(-)

Gram

(+)

Kết quả (Bảng 3.3 ) cho thấy một số tác nhân vi khuẩn đa kháng thuốc gây NTBV thường

gặp là: P.aeruginosa 32,9%; Acinetobacter spp, 16,5%; S.aureus 11,5%, và gặp chủ yếu ở nhiễm trùng bỏng (10,5%); E.coli 8,1%, chủ yếu ở nhiễm trùng vết mổ (4,8%)

3.2 Kết quả Định typ huyết thanh chủng P.aeruginosa

Bảng 3.4 Sự phân bố typ huyết thanh đơn giá của P.aeruginosa phân lập đ−ợc

Các typ huyết thanh đơn giá của chủng P.aeruginosa

Số chủng

O1 O2 O4 O5 O6 O8 O11 O12 O15 O16

Khỏc Tổng (N)

n 0 3 2 2 2 0 15 14 2 13 14 67

NTB

% 0,0 4,4 3,0 3,0 3,0 0,0 22,4 20,9 3,0 19,4 20,9 100

n 4 3 2 3 2 2 6 16 0 0 2 40

NTP

n 0 0 0 2 0 2 0 1 0 0 2 7

NTVM

% 0,0 0,0 0,0 28,6 0,0 28,6 0,0 14,3 0,0 0,0 28,6 100

N 4 6 4 7 4 4 21 31 2 13 18 114

Tổng

% 3,5 5,3 3,5 6,1 3,5 3,5 18,4 27,2 1,8 11,4 15,8 100

Kết quả (Bảng 3.4) cho thấy typ huyết thanh O12 chiếm tỷ lệ cao nhất (27,2%); sau đó là O11 (18,4%); O16 (11,4%) và O5 (6,1%) Typ huyết thanh O12 xuất hiện ở tất cả các loại bệnh phẩm nghiên cứu, nh−ng gặp chủ yếu ở bệnh nhân NTP do thở máy (14%); sau đó là NTB (12,3%) Typ huyết thanh O16 xuất hiện duy nhất ở bệnh phẩm NTB

3.3 Kết quả nhạy cảm kháng sinh

3.3.1 Tính nhạy cảm kháng sinh của các vi khuẩn Gram (-)

78.7

68.4 67.9

57.7

70.8

61.8 69.3

25. 29.

67.7 60.3

39.0

74.7

56.2

58.2

56.6

45.7

0

10

20

30

40

50

60

70

80

TIC PIP TZP TCC CTX CAZ IMP TM NET GM AN CIP NOR ATM

Kháng sinh thử nghiệm

Nhạy Kháng

Biểu đồ 3.1 Tỷ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn Gram (-)

Khả năng kháng các kháng sinh của các vi khuẩn Gram (-) đối với kháng sinh thử nghiệm

là khá cao, kết quả (Biểu đồ 3.1) cho thấy, tỷ lệ kháng với các nhóm kháng sinh aminoglycosides từ 39,0% đến 74,7%; dòng cephalosporin 3 là cefotaxim và ceftazidine kháng là 70,8% và61,8%; nhómquinolones từ 56,6% đến 58,2%

3.3.2 Tính nhạy cảm với kháng sinh của P.aeruginosa

69.5

55.0

70.2

57.6

74.4

64.1 65.7

72.0

58.1

74.6

63.6

56.1

0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

60.0

70.0

80.0

TIC PIP TZP TCC CTX CAZ IMP TM NET GM AN CIP NOR ATM

Kháng sinh thử nghiệm

Nhạy Kháng

Biểu đồ 3.2 Tỷ lệ nhạy cảm kháng sinh của P.aeruginosa