Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học phân tử ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc và hiệu lực của hai phác đồ điều trị tại miền Trung - Tây Nguyên (2001 - 2005)

Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học phân tử ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc và hiệu lực của hai phác đồ điều trị tại miền Trung - Tây Nguyên (2001 - 2005)

vμ hiệu lực của hai phác đồ điều trị

tại Miền Trung - Tây Nguyên

(2001 – 2005)

Chuyên ngành : Dịch tễ học Mã số : 3.01.11

Tóm tắt luận án tiến sĩ y học

hμ nội - 2007

t¹i häc viÖn qu©n y

Cã thÓ t×m hiÓu luËn ¸n t¹i:

- Th− viÖn Quèc gia

- Th− viÖn Häc viÖn Qu©n y

liên quan luận án đ∙ công bố

1 Lê Ngọc Anh, Lý Bá Lộc, Nguyễn Xuân Thành, Vũ Quốc Bình

(2004) “Tính nhạy cảm của P.falciparum với pyrimethamine và cycloguanil tại một vùng sốt rét ở Bắc miền Trung”, Tạp chí y học

dự phòng số 6 (70), tr 48-53

2 Lê Ngọc Anh, Lý Bá Lộc, Ngô Văn Lâm, Hồ Sỹ Mậu, Phạm Xuân Vinh và Vũ Quốc Bình (2005) “Nhận xét về tình hình sốt

rét tại một số đơn vị Quân đội ở khu vực Tây Nguyên (2001 –

2004)”, Tạp chí Y học Quân sự số 4 (235), tr 38-42

3 Le Ngoc Anh, Nguyen Xuan Thanh, Vu Quoc Binh, Ly Ba Loc, Bui Đai , Rieckmann KH, Edstein MD, Cooper RD

(2005) “Chloroquine may still be effective in treating P

falciparum malaria in Quangbinh Province, Central Vietnam”, 15 th Annual Asia Pacific Military Medicine Conference Hanoi, May

DHFR Men khö Dihydrofolate (Dihydrofolate Reductase)

DNA Deoxyribonucleic acid

1 Tính cấp thiết của đề tài

Theo Tổ chức Y tế thế giới hiện nay có khoảng 40% dân số thế giới

có nguy cơ bị sốt rét, ở 107 quốc gia, hàng năm ước tính khoảng 350 - 500 triệu ca sốt rét lâm sàng, trên 1 triệu người chết vì sốt rét Ký sinh trùng sốt

rét kháng thuốc, muỗi Anopheles kháng hoá chất diệt côn trùng, biến động

môi trường sinh thái và xã hội đã làm cho tình hình sốt rét thêm xấu đi

Việt Nam là một trong những nước thuộc khu vực châu á - Tây Thái Bình Dương có bệnh sốt rét lưu hành nặng, 46% dân số (2005) sống trong

vùng sốt rét lưu hành P falciparum kháng chloroquin, Fancidar, quinin,

thậm chí cả mefloquin

Miền Trung - Tây Nguyên là một địa bàn chiến lược quan trọng về Kinh tế - Quốc phòng song lại là vùng sốt rét lưu hành vừa và nặng, ký

sinh trùng sốt rét kháng thuốc cao nhất toàn quốc Muỗi Anopheles kháng

hoá chất diệt côn trùng Nhiều năm qua, miền Trung - Tây Nguyên với những biến động lớn về dân cư, môi trường, sinh thái làm cho sốt rét ở khu vực này thêm phức tạp Bệnh sốt rét đã ảnh hưởng lớn tới đời sống kinh tế

và xã hội Sức khoẻ của bộ đội tại các đơn vị đứng chân trên địa bàn miền Trung - Tây Nguyên làm nhiệm vụ bảo vệ Tổ quốc và xây dựng kinh tế bị giảm sút do sốt rét

Trong những năm gần đây những ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử cho thấy mối liên quan giữa kháng thuốc và các đột biến gen của ký sinh trùng sốt rét với một số thuốc chống sốt rét đã được Tổ chức Y tế thế giới công nhận

Trong khuôn khổ Dự án "Phòng chống sốt rét Quân đội Việt Nam -

Australia” và Hoạt động “Giám sát dịch tễ sốt rét của Viện Vệ sinh phòng dịch Quân đội” Nhằm đánh giá tình hình sốt rét, thực trạng ký sinh trùng

sốt rét kháng thuốc và đánh giá hiệu lực điều trị sốt rét kháng thuốc của phác đồ phối hợp thuốc, chúng tôi thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học phân tử ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc và hiệu lực của hai phác đồ điều trị tại miền Trung - Tây Nguyên (2001 – 2005)”

2 Mục tiêu của đề tài

- Xác định tỷ lệ ký sinh trùng sốt rét mang gen đột biến kháng thuốc và một

số đột biến trên gen kháng, tại các đơn vị Quân đội ở miền Trung - Tây Nguyên (2001 - 2005)

- Đánh giá hiệu lực hai phác đồ điều trị sốt rét kháng thuốc: Artesunat + doxycyclin và chloroquin + azithromycin

3 Những đóng góp mới về khoa học và thực tiễn của đề tài

- Luận án đã đưa ra bức tranh toàn cảnh về đặc điểm bệnh sốt rét và ký sinh trùng sốt rét (KSTSR) kháng thuốc ở mức cấu trúc gen của KSTSR (dịch tễ học phân tử), tại một số đơn vị Quân đội ở miền Trung - Tây Nguyên (2001-2005)

- Luận án đã đánh giá hiệu lực hai phác đồ điều trị sốt rét kháng thuốc: artesunat + doxycyclin và chloroquin + azithromycin bằng thử nghiệm 28 ngày (theo dõi đáp ứng lâm sàng, theo dõi đáp ứng của KSTSR bằng kính hiển vi và PCR)

- Luận án đã ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử như: PCR, PCR - RFLP, sequencing so sánh với kết quả thử nghiệm in vitro - micro Các kỹ thuật ứng dụng được thực hiện tại: Viện Vệ sinh phòng dịch quân đội và Viện Sốt rét Lục quân Australia Bằng kỹ thuật sinh học phân tử luận án đã xác

định được một số đặc điểm KSTSR mang gen đột biến kháng thuốc và một

số đột biến trên gen kháng, xác định kiểu gen của KSTSR Kết quả của kỹ thuật sinh học phân tử đã góp phần đánh giá tính nhạy cảm của KSTSR với một số thuốc sốt rét và đánh giá hiệu lực của 2 phác đồ điều trị sốt rét kháng thuốc

- Luận án đã bước đầu thể hiện là một nghiên cứu sâu về cấu trúc phân tử của một số gen đột biến, ảnh hưởng tới tính nhạy cảm của KSTSR với một

số thuốc sốt rét mà một số luận án trong nước trước đây chưa có điều kiện thực hiện

Những kết quả thu được của luận án góp phần phục vụ công tác phòng chống bệnh sốt rét, đảm bảo sức khoẻ cho Bộ đội tại các đơn vị

đóng quân ở miền Trung - Tây Nguyên thực hiện tốt nhiệm vụ Kinh tế - Quốc phòng

Tổng quan

1.1 Tình hình ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc trên thế giới

Hiện tượng ký sinh trùng sốt rét (KSTSR) kháng thuốc được phát hiện năm 1910 ở Braxin, khi một ca sốt rét điều trị bằng quinin không đạt

kết quả Tiếp đó P.falciparum kháng proguanil cũng tại Braxin (1949),

kháng pyrimethamin ở Gambia (1952), kháng chloroquin ở Colombia (1960), kháng amodiaquin ở Braxin (1961) và kháng Fancidar tại Campuchia Từ những phát hiện ban đầu có tính chất lẻ tẻ, rồi sau đó hiện

tượng P falciparum kháng thuốc phát triển mạnh trên cả 3 phương diện:

mức độ kháng, diện kháng và phạm vi kháng Tình hình sốt rét thế giới

thêm xấu đi khi P.vivax cũng trở nên kháng chloroquin, thông báo đầu tiên

vào năm 1989 ở Papua New Guinea và sau đó là Indonesia, Myanmar, Vanuatu và Solomon Đến năm 1991 đã có 73 quốc gia thông báo có

P.falciparum kháng thuốc Khu vực Đông Nam á như Thái Lan,

Campuchia và Việt Nam là những quốc gia có hiện tượng kháng phức tạp

1.2 Tình hình ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc ở Việt Nam

Việt Nam là một trong những nước có P falciparum kháng thuốc

được ghi nhận sớm trên thế giới, lần đầu tiên hiện tượng P.falciparum

kháng chloroquin được phát hiện tại Nha Trang vào năm 1961 Trong quá trình PCSR việc chỉ định dùng thuốc rộng rãi kéo dài (uống phòng) đã tạo thành “áp lực thuốc” là yếu tố quan trọng làm cho tình trạng kháng thuốc của KSTSR lan rộng ra khắp miền Trung - Tây Nguyên và cả nước

Đến những năm 1990, P.falciparum kháng thuốc tăng cao đến mức

nghiêm trọng: kháng chloroquin in vivo 78,2%, in vitro 84,6%; kháng Fancidar 73,6% và mefloquin là 3,4%, chloroquin không còn hiệu lực để

điều trị sốt rét do P.falciparum

KSTSR kháng thuốc luôn là một thách thức, và luôn là mối quan tâm lớn trong chương trình Quốc gia PCSR của Việt Nam

1.3 Một số nghiên cứu về gen kháng thuốc của ký sinh trùng sốt rét

Các nghiên cứu sequencing (giải trình tự các nucleotid) DNA của

P.falciparum đã phát hiện cấu trúc gen giữa chủng kháng và nhạy

chloroquin có những khác biệt Gen Pfcrt (P.falciparum chloroquine

resistance transporter) mã hoá tổng hợp các acid amin chủng nhạy ở dạng

tự nhiên M74, N75, K76, nhưng ở chủng kháng xuất hiện đột biến là: 74I, 75D/E, 76T Cấu trúc phân tử giữa chủng kháng và nhạy pyrimethamin

cũng có những khác biệt, gen Pfdhfr (P.falciparum dihydrofolate

reductase) mã hoá tổng hợp các acid amin ở chủng nhạy có cấu trúc dạng

tự nhiên: N51, C59, S108, ở chủng kháng xuất hiện đột biến: 51I, 59R,

108N Cấu trúc gen đa kháng Pfmdr1 (P falciparum multidrug resistant)

khi đột biến cũng liên quan đến tính nhạy cảm của P.falciparum với một số

thuốc sốt rét như: chloroquin, mefloquin, artemisinin

Việc nuôi cấy P.vivax là rất phức tạp khó đánh giá được tính nhạy

cảm bằng in vitro, kỹ thuật sinh học phân tử đã xác định được gen Pvdhfr

(P.vivax dihydrofolate reductase) Cấu trúc phân tử giữa chủng nhạy và

kháng pyrimethamin có những khác biệt, chủng nhạy gen Pvdhfr có cấu

trúc tự nhiên S117, chủng kháng xuất hiện đột biến là 117N

Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để nghiên cứu dịch tễ học bệnh sốt rét và đánh giá tính nhạy cảm của KSTSR với một số thuốc chống sốt rét là

kỹ thuật hiện đại có tỷ lệ thành công và độ tin cậy cao đã được WHO khuyến cáo sử dụng

1.4 Một số nghiên cứu về điều trị sốt rét kháng thuốc ở Việt Nam và trên thế giới

Tìm thuốc mới và sử dụng phối hợp thuốc là chiến lược điều trị sốt rét kháng thuốc của WHO

Chloroquin là thuốc kinh điển với nhiều ưu thế: dung nạp tốt và an toàn cao, thời gian bán huỷ dài và không đắt tiền Mặc dù KSTSR đã kháng

cao với chloroquin song sau một thời gian dài không sử dụng P.falciparum

đã nhạy tăng dần với chloroquin Nếu có thể phối hợp chloroquin với một thuốc khác làm tăng được hiệu lực điều trị và tránh được sự tiếp tục kháng thì hoàn toàn phù hợp?

Artemisinin và các dẫn chất là một thuốc mới có nhiều ưu thế với khả năng cắt sốt và cắt KSTSR nhanh Tuy nhiên, hạn chế của thuốc này là tình

trạng tái phát sớm của P.falciparum sau điều trị Để khắc phục nhược điểm

này, đã có một số nghiên cứu sử dụng phối hợp với một số thuốc sốt rét khác

Doxycylin tác động tới KSTSR ở giai đoạn tổ chức gan và giai đoạn hồng cầu có tác dụng điều trị tiệt căn, ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu

sử dụng phối hợp doxycyclin với artemisinin để điều trị sốt rét kháng thuốc

và SRAT do P falciparum, phác đồ này tỏ ra có hiệu lực cao

Azithromycin là một kháng sinh bán tổng hợp, có phổ tác động rộng,

an toàn cao, phân bố rộng trong cơ thể, nồng độ thuốc đạt tới đỉnh trong huyết tương chỉ sau 2 giờ và thời gian bán huỷ tới 60 giờ Thử nghiệm lâm

sàng azithromycin điều trị sốt rét do P.falciparum cho thấy nếu dùng đơn

thuần hiệu quả là 21 – 38%, phối hợp phối hợp với chloroquin thì hiệu quả

đạt tới 96% Nghiên cứu in vitro cũng cho thấy, azithromycin phối hợp với

chloroquin làm tăng hiệu lực diệt P.falciparum kháng chloroquin, song ở

Việt Nam chưa có nghiên cứu nào sử dụng azithromycin để điều trị sốt rét

Đối tượng vμ phương pháp nghiên cứu

2.1 Đối tượng, địa điểm, thời gian nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu:

- Gồm 4 đơn vị đóng quân và hoạt động tại miền Trung - Tây Nguyên: S185 - Quảng Bình, D10 - Kon Tum, D721- Gia Lai, D584 - Đắc Lắc

- Các mẫu KSTSR và mẫu DNA được thu thập tại các đơn vị nghiên cứu: + 269 mẫu DNA của KSTSR cho phân tích gen

+ 67 mẫu KSTSR cho thử nghiêm in vitro – micro

- 91 bệnh nhân sốt rét tại đơn vị ở Quảng Bình cho thử nghiệm in vivo

(Các mẫu thử nghiệm in vivo, in vitro trong số mẫu phân tích gen)

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu

- Quảng Bình, Kon Tum, Gia Lai, Đắc Lắc

2.1.3 Thời gian nghiên cứu

- Từ 1/2001 đến 12/ 2005

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Dịch tễ học mô tả

2.2.1.2 Mô tả đặc điểm bệnh sốt rét và ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc

- Đặc điểm mắc sốt rét lâm sàng (SRLS), đặc điểm nhiễm KSTSR

- Diễn biến SRLS, nhiễm KSTSR, KSTSR kháng thuốc

2.2.1.3 Mô tả đặc điểm ký sinh trùng sốt rét mang gen đột biến kháng thuốc và một số đột biến trên gen kháng

- Đặc điểm chủng loại KSTSR, đặc điểm kiểu gen của P falciparum và

- Đặc điểm P.vivax mang gen đột biến Pvdhfr kháng pyrimethamin

2.2.2 Dịch tễ học can thiệp (thử nghiệm lâm sàng)

- Đánh giá hiệu lực 2 phác đồ điều trị sốt rét kháng thuốc (thử nghiệm 28 ngày):

+ Artesunat phối hợp doxycyclin

+ Chloroquin phối hợp azithromycin

- So sánh với hiệu lực phác đồ artesunat đơn thuần

2.3 Các kỹ thuật ứng dụng trong nghiên cứu

- Kỹ thuật sinh học phân tử:

+ Xác định chủng loại ký sinh trùng sốt rét

+ Xác định kiểu gen P.falciparum: MSP1, MSP2, GLURP

+ Xác định kiểu gen của P vivax: PvMSP1, PvMSP 3

+ Tìm những dấu ấn phân tử liên quan đến tính kháng thuốc:

• Xác định P.falciparum mang gen Pfcrt đột biến kháng chloroquin

bằng kỹ thuật PCR - RFLP và sequencing DNA

• Xác định P.falciparum mang gen Pfdhfr đột biến kháng

pyrimethamin bằng kỹ thuật PCR - RFLP và sequencing DNA

• Xác định P.falciparum mang gen Pfmdr1 đột biến đa kháng thuốc

bằng kỹ thuật sequencing DNA

• Xác định P.vivax mang gen Pvdhfr đột biến kháng pyrimethamin

bằng kỹ thuật PCR - RFLP và sequencing DNA

- Kỹ thuật thử nghiệm in vitro - micro đánh giá tính nhạy cảm của

P.falciparum với các thuốc: CQ, MEF, AS, PYR, CYC bằng sử dụng

microscoper test (soi kính hiển vi), isotopic test (đồng vị phóng xạ)

- Kỹ thuật thử nghiệm in vivo đánh giá hiệu lực phác đồ điều trị (thử nghiệm 28 ngày)

2.5 Giới hạn phạm vi nghiên cứu của đề tài luận án

Đặc điểm dịch tễ học phân tử KSTSR kháng thuốc là một vấn đề rộng lớn, điều trị KSTSR kháng thuốc là một nghiên cứu rộng Do điều kiện thời gian và kinh phí, đề tài luận án khu trú nghiên cứu:

- Xác định tỷ lệ KSTSR mang gen đột biến kháng thuốc và một số đột biến trên gen kháng: Pfcrt, Pfdhfr, Pfmdr1, Pvdhfr và so sánh với kết quả thử

nghiệm in vitro - micro đáp ứng của P.falciparum với: CQ, MEF, AS,

PYR, CYC

- Đánh giá hiệu lực hai phác đồ điều trị sốt rét kháng thuốc:

+ Artesunat phối hợp doxycyclin

+ Chloroquin phối hợp azithromycin

Kết quả

3.1 Đặc điểm ký sinh trùng sốt rét mang gen đột biến kháng thuốc và một số đột biến trên gen kháng, tại một số đơn vị Quân đội ở miền Trung - Tây Nguyên (2001 - 2005)

3.1.1 Đặc điểm bệnh sốt rét và ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc

- Tỷ lệ mắc SRLS tại các đơn vị khác nhau: S185 là đơn vị làm đường có tỷ

lệ mắc cao, sau đó là D721 đơn vị bảo vệ biên giới, D10 là đơn vị hoạt

động tĩnh tại - doanh trại kiên cố có tỷ lệ mắc thấp

3.1.1.3 Đặc điểm nhiễm ký sinh trùng sốt rét

Bảng 3.2: Tỷ lệ (%) nhiễm ký sinh trùng sốt rét (2001 - 2005)

(theo điều tra cắt ngang mỗi năm 2 đợt vào tháng 5 và tháng 10)

Lam điều tra Phân loại

Chung cả vùng 18768 269 1,43 198 73,61 71 26,39

- Tỷ lệ nhiễm KSTSR tại một số đơn vị trung bình trong 5 năm là 1,43%,

P.falciparum chiếm ưu thế là 73,61%, P.vivax là 26,39%

- Tỷ lệ nhiễm KSTSR cao ở S185 đơn vị làm đường và D721, thấp ở D10

đơn vị hoạt động tĩnh tại - doanh trại kiên cố

3 Chưa phát hiện thấy P.malariae và P.ovale bằng soi kính hiển vi

3.1.1.5 Diễn biến P falciparum kháng chloroquin

Bảng 3.4: Diễn biến P falciparum kháng chloroquin - in vitro

8/18 (44,44%)

6/15 (40,00%)

3.1.1.6 Diễn biến P falciparum kháng pyrimethamin

Bảng 3.5: Diễn biến P falciparum kháng pyrimethamin - in vitro

15/19 (78,95%)

11/15 (73,33%)

và một số đột biến trên gen kháng

3.1.2.1 Đặc điểm chủng loại ký sinh trùng sốt rét

Bảng 3.6: Kết quả xác định chủng loại Plasmodium

- P.falciparum chiếm ưu thế với tỷ lệ 68,40%, P vivax là 25,27%

- Nhiễm phối hợp P falciparum và P vivax là 6,33%

3 Chưa phát hiện được P malariae và P.ovale bằng PCR trên bệnh nhân nhiễm KSTSR tại địa điểm nghiên cứu

3.1.2 2 Đặc điểm kiểu gen của P falciparum

Bảng 3.7: Tỷ lệ kiểu gen khác nhau trong một quần thể P falciparum

và hiện tượng nhiễm P.falciparum trên một bệnh nhân

Số kiểu gen

Đơn vị SL

Đa nhiễm (%)

Đơn nhiễm (%)

- Tỷ lệ P.falciparum mang kiểu gen khác nhau trong một quần thể, thể

hiện tính đa dạng của chúng Tính đa dạng về kiểu gen gián tiếp thể hiện khả năng lan truyền sốt rét của vùng sốt rét lưu hành Kết quả cho thấy:

P.falciparum có khả năng lan truyền cao ở Gia Lai (tỷ lệ kiểu gen khác

nhau 65,62%), thấp Quảng Bình (tỷ lệ kiểu gen khác nhau là 52,63%)

- Tỷ lệ P.falciparum đa nhiễm trên một bệnh nhân gián tiếp thể hiện mức

độ phơi nhiễm của cộng đồng trong vùng sốt rét lưu hành Kết quả cho thấy: S185 ở Quảng Bình là đơn vị làm đường mức độ phơi nhiễm cao (tỷ

lệ đa nhiễm 26,31%) S10 ở Kon Tum hoạt động tĩnh tại - doanh trại kiên

cố nên mức độ phơi nhiễm thấp (tỷ lệ đa nhiễm là 10,25%)