Nhân nhanh in vitro giống hoa cúc nhật "rivalry" doc

Các thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô, tế bào thực vật và vườn thực nghiệm của Viện sinh học nông nghiệp, trường Đại học nông nghiệp I.. Các mẫu này được nuôi cấ

nhân nhanh in vitro giống hoa cúc Nhật “Rivalry”

Study on Micropropagation of Japan chrysanthemum “Rivalry”

Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Quang Thạch

Summmary

The experiments ware carried out on new variety of chrysanthemum from Japan: “Rivalry”

The research results showed that: HgCl2 0,2% in 7 min was the best for sterization treatment of the stem and leaf tissue of chrysanthemum;Stem tissue was better than leaf one for explants The initial and multipropagation medium was MS+1ppm BA.The MS medium without growth regulations was the best for rooting of shoot.The mix of soil, sand and burned rice husk (1:1:1) was suitable for transfering the plantlets to ambient condition.Fourteen thousand plantlets ware produced by tissue culture due to apply above research results Those plantlets grew and gave their flowers

Key words: “Rivalry”, tissue culture , multipropagation

1 mở đầu

Trong các loài hoa cắt hiện nay, chỉ đứng sau hoa hồng, hoa cúc là một trong những loại hoa

được ưa chuộng và trồng phổ biến ở nước ta (Linh Xuan Nguyen, 1998) Hoa cúc được ưa chuộng bởi sự đa dạng về chủng loại và màu sắc; phong phú về kiểu dáng, khá bền và phù hợp với nhiều mục đích sử dụng Hơn thế, cây cúc được điều kiển ra hoa để tạo nguồn sản phẩm hàng hoá liên tục

và ổn định quanh năm (John, Harold, 1999) Chính vì vậy, nhu cầu có được các giống cúc mới thông qua chọn tạo và nhập nội nhằm đáp ứng được nhu cầu của thị trường luôn được người sản xuất quan tâm, chú trọng Để góp phần làm đa dạng và phổ biến giống mới, đồng thời đáp ứng một phần nhu

cầu cây giống cho ngành sản xuất hoa cúc ở nước ta, giống cúc Nhật “Rivalry” được nghiên cứu

nhân nhanh bằng kỹ thuật nuôi cấy mô

2 Vật liệu, phương pháp nghiên cứu

Nguyên liệu cho các thí nghiệm in vitro là lá và đoạn thân của cành hoa cúc “Rivalry” (Dendranthema indicum Gr.) Đây là giống cúc có kích thước hoa lớn (đường kính hoa gấp đôi cúc

đại đoá), mầu sắc mới lạ, nguồn gốc từ Kyushu – Nhật Bản, được Viện Sinh học Nông nghiệp du

nhập vào Việt Nam năm 2000 Nguyên liệu cho các thí nghiệm ex vitro là cây con hoàn chỉnh nhận

được từ nuôi cấy in vitro

Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp nghiên cứu nuôi cấy mô hiện hành (Robert, Dennis, 2000), trên nền môi trường cơ bản MS (Murashige,Skoog, 1962) Điều kiện nuôi cấy: nhiệt

độ phòng nuôi 25- 27oC, độ ẩm phòng nuôi 70%, cường độ chiếu sáng: 3000lux, thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại, mỗi công thức 30 cá thể.Các chỉ tiêu thí nghiệm được quan sát thường xuyên với 7-10 ngày 1 lần (tuỳ theo yêu cầu của thí nghiệm)

Số liệu thực nghiệm được xử lý thống kê sinh học theo chương trình IRRISTAT Các thí nghiệm

được tiến hành tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô, tế bào thực vật và vườn thực nghiệm của Viện sinh học nông nghiệp, trường Đại học nông nghiệp I

3 Kết quả và thảo luận

3.1 Giai đoạn tạo nguồn mẫu khởi đầu

Tạo được nguồn mẫu sạch có khả năng sống cao là điều kiện tiên quyết cho sự thành công của

việc nuôi cấy in vitro Trên cơ sở của nghiên cứu đã công bố trước đây (Nguyễn Thị Lý Anh và cộng

sự, 1999), kết quả khử trùng mẫu cấy bằng HgCl2 nồng độ 0,2% trong thời gian 7 phút cho tỷ lệ mẫu

sạch, sống đối với mô lá là 76,7% và mô thân là 86,7% Các mẫu này được nuôi cấy để tái sinh chồi

Bảng 1 ảnh hưởng của BA đến sự tái sinh chồi từ mô lá (sau 4 tuần)

Công thức Tỷ lệ mẫu tạo

chồi (%)

Số chồi/mẫu cấy (chồi)

Chiều cao chồi (cm)

Số lá/chồi (lá)

MS + 0,5ppm BA 40,0 1,5 1,3 2,5

MS + 1,0ppm BA 43,3 1,6 1,5 4,4

MS + 1,5ppm BA 76,6 3,1 1,6 5,8

MS + 2,0ppm BA 66,7 2,5 1,4 3,2

MS + 2,5ppm BA 53,3 2,0 1,3 2,5

MS + 3,0ppm BA 50,0 1,2 1,2 1,8

LSD (0,05) 3,9 0,1

Sự có mặt của đơn chất BA với các nồng độ khác nhau trong môi trường nuôi cấy đã có khả năng kích thích khả năng tái sinh chồi từ mô lá (bảng 1) Chỉ các công thức bổ sung BA mới có khả năng tái sinh chồi Tuy nhiên, hiệu quả kích thích tái sinh chồi sẽ bị giảm đi khi bổ sung BA ở nồng

độ cao Khi bổ sung BA ở nồng độ 1,5ppm cho hiệu quả tái sinh chồi cao nhất Bên cạnh đó, chất lượng chồi tái sinh thể hiện qua các chỉ tiêu sinh trưởng cũng tốt nhất

Bảng 2 ảnh hưởng của BA đến sự tái sinh chồi từ đoạn thân mang 1 mắt ngủ (sau 4 tuần)

Công thức Tỷ lệ mẫu

tạo chồi (%)

Số chồi/mẫu cấy (chồi)

Chiều cao chồi (cm/chồi)

Số lá/chồi (lá/chồi)

MS + 0,5ppm BA 100 3,4 6,3 1,6

MS + 1,0ppm BA 100 4,6 6,6 1,5

MS + 1,5ppm BA 100 4,1 6,4 1,3

MS + 2,0ppm BA 100 3,8 6,7 1,2

MS + 2,5ppm BA 100 3,3 6,4 1,1

MS + 3,0ppm BA 100 3,1 7,7 1,0

Đoạn thân mang mắt ngủ cho tỷ lệ tái sinh đạt 100% trên tất cả các môi trường (bảng 2), do khả năng bật chồi của mắt ngủ ít bị ảnh hưởng bởi chất điều tiết sinh trưởng (trong giới hạn nghiên cứu) Tuy nhiên, mẫu cấy chỉ tạo cụm chồi khi được cấy trên môi trường có bổ xung BA Điều này chứng tỏ BA đã kích thích khả năng tái sinh chồi của mẫu cấy và bổ xung BA ở nồng độ 1,5mg/lít cho tỷ lệ tái sinh đạt 100%, số chồi tái sinh cao nhất (đạt 4,6 chồi/mẫu cấy), chồi tái sinh sinh trưởng mạnh (chỉ kém công thức đối chứng)

3.2 Giai đoạn nhân nhanh

Giai đoạn này được thực hiện bằng phương thức tạo cụm chồi từ các chồi tái sinh thu nhận được trong giai đoạn trên

Bảng 3 ảnh hưởng của BA đến hệ số nhân chồi trên hai nguồn mẫu (sau 4 tuần)

Chồi tái sinh từ mô lá Chồi tái sinh từ mô thân Công thức

Hệ số nhân (lần)

Chiều cao chồi (cm)

Số lá/

chồi (lá)

Hệ số nhân (lần)

Chiều cao chồi (cm)

Số lá/ chồi (lá)

Đ/C (MS) 1,0 2,5 6,3 1,0 4,4 14,5

MS + 0,5 ppm BA 3,6 1,7 5,9 4,7 3,4 6,4

MS + 1,0 ppm BA 6,0 2,0 6,0 7,1 3,2 6,3

MS + 1,5 ppm BA 4,1 1,5 5,2 5,4 3,0 6,5

LSD (0,05) 0,3 0,1 0,2 0,3 0,4 0,6

Sau 4 tuần nuôi cấy cho thấy môi trường được bổ sung BA có tác dụng kích thích khả năng đẻ

chồi của cây hoa cúc (chỉ các công thức bổ xung BA mới có khả năng đẻ chồi) trên cả hai nguồn

mẫu là chồi tái sinh từ mô lá và chồi tái sinh từ mô thân (bảng 3) Tuy nhiên, bổ sung BA ở nồng độ

cao sẽ làm giảm khả năng đẻ chồi, hệ số nhân giảm 1,7 lần (từ 7,1 xuống 5,4) khi tăng nồng độ BA

từ 1,0ppm lên 1,5ppm Hệ số nhân đối với nguồn mẫu là cây tái sinh từ đoạn thân cao hơn so với

chồi tái sinh từ mô lá (7,1 lần so với 6,0) Môi trường tối ưu để nhân nhanh cây hoa cúc trên cả hai

loại nguồn mẫu là: MS + 1mg/lít BA Trên môi trường này cho hệ số nhân là 7,1 đối với chồi tái

sinh từ mô thân và 6,0 đối với chồi tái sinh từ mô lá

3.3 Giai đoạn tạo cây in vitro hoàn chỉnh

Bảng 4 ảnh hưởng của α-NAA đến sinh trưởng và khả năng ra rễ của chồi cúc

tái sinh từ các nguồn mẫu khác nhau (sau 2 tuần)

Chồi có nguồn gốc từ mô lá (chồi tái sinh từ mô lá)

rễ (%)

Số rễ/cây (rễ)

Chiều dài rễ (cm)

Số lá/cây (lá)

chiều cao cây (cm)

MS+0,25pp mαNAA 86,7 13,5 3,0 6,5 1,9

MS+0,5ppm αNAA 100,0 15,8 3,0 6,9 2,0

Chồi có nguồn gốc từ mô thân (chồi tái sinh từ mô thân)

rễ (%)

Số rễ/cây (rễ)

Chiều dài rễ (cm)

Số lá/cây (lá)

chiều cao cây (cm)

MS+0,25ppm αNAA 100 12,0 2,8 10,3 2,7

MS+0,5ppm αNAA 100 14,8 2,2 10,5 2,8

Bổ xung α-NAA làm tăng số rễ/cây nhưng lại làm giảm chất lượng của bộ rễ khi so với môi

trường không bổ sung α-NAA (Đ/C) Mặt khác, chồi tái sinh từ mô thân có khả năng ra rễ mạnh

hơn so với chồi tái sinh từ mô lá Điều này chứng tỏ đã có một sự thay đổi lớn về sinh lý của chồi

cúc tái sinh từ mô lá, do mô lá phải qua giai đoạn tạo chồi bất định trong khi đó chồi tái sinh từ mô

thân thực chất là chồi được nhân nhanh theo phương pháp vi giâm cành nên không phải qua giai

đoạn tái sinh chồi bất định

Cây cúc có khả năng tự ra rễ rất mạnh, tỷ lệ ra rễ trên môi trường không bổ sung chất điều tiết sinh

trưởng đạt 80,0% (đối với chồi tái sinh từ mô lá) và 100% (đối với chồi tái sinh từ mô thân) Điều đó

chứng tỏ: chồi cúc có khả năng tổng hợp và tự điều chỉnh lượng chất điều tiết sinh trưởng nội sinh theo hướng tạo rễ bất định

3.4 Giai đoạn vườn ươm

Bảng 5 ảnh hưởng của giá thể đến sinh trưởng, phát triển của cây cúc cấy mô (sau 4 tuần)

Giá thể Tỷ lệ sống

(%)

Độ tăng chiều cao (cm)

Số lá mới/ cây (lá) Quan sát Trấu hun 100 3,1 4,9 Cây mập, lá to, xanh đều

Cát 100 2,2 4,3 Lá to, xanh, thân mập

Đất 36,7 2,9 4,4 Cây to, mập, khoẻ, lá to và dày, mầu

xanh đậm

Xỉ than 53,3 1,5 4,2 Cây yếu, chậm phát triển, lá vàng mỏng

Đất+cát (1:1) 80,0 3,0 4,6 Cây khoẻ, lá to xanh

Đất+cát+trấu

hun (1:1:1) 100 3,4 5,0

Cây mập, khoẻ, mọc đều, thẳng cứng lá

to xanh thẫm dày bản

Trong giai đoạn vườn ươm, giá thể có ảnh hưởng quyết định đến khả năng sống, sinh trưởng của cây cúc cấy mô Nhìn chung, các giá thể có bổ xung trấu hun sẽ cho tỷ lệ sống, sinh trưởng, phát triển của cây cúc cấy mô tốt (giá thể trấu hun, và đất + cát +trấu hun theo tỷ lệ 1:1:1 cho tỷ lệ sống đạt 100%, cây sinh trưởng mạnh) Giá thể xỉ than và đất tỏ ra không thích hợp với cây cúc cấy mô Điều này có thể do giá thể xỉ than có các đặc tính lý hoá không phù hợp với sự phát triển của bộ

rễ còn giá thể đất lại bí trong thời gian đầu tiên khi ra cây vì vậy đã làm hạn chế khả năng sinh trưởng cũng như tăng khả năng nhiễm bệnh của cây

3.5 Sự sinh trưởng, phát triển của cây cúc cấy mô trong sản xuất

Bảng 6 Sự sinh trưởng, phát triển của cây hoa cúc Nhật cấy mô và hoa cúc vàng đại đóa (trồng vụ đông 2002 tại Hải Phòng)

Chỉ tiêu theo dõi Cúc vàng đại đóa Cúc Nhật “Rivalry”

Thời gian từ trồng đến ra hoa

( à )

77 83 Chiều cao cây (cm) 48,2 86,5

Đường kính thân lúc thu hái (cm) 0,60 1,10

Tỷ lệ ra hoa (%) 100 100

Đường kính bông hoa (cm) 6,7 13,3

Đường kính cuống hoa (cm) 0,3 0,8

Chiều cao bông hoa (cm) 12,3 14,2

Mầu sắc hoa Vàng đậm Vàng tươi

Đặc điểm hình thái Cây có thân lá

cân đối

Cây có thân lá to, nặng,

dễ đổ

áp dụng các kết quả nghiên cứu nêu trên, Trung tâm ứng dụng khoa học kỹ thuật công nghệ

- Sở khoa học Công nghệ Hải Phòng đã sản xuất được 14.200 cây cúc Nhật giống “Rivalry”và trồng

thử tại Đằng Hải - Hải Phòng Các chỉ tiêu sinh trưởng của giống cúc này như chiều cao cây, đường kính thân lúc thu hái, đường kính bông hoa, đường kính cuống hoa, chiều cao bông đều cao hơn cúc

đại đóa Tỷ lệ ra hoa 100% (bảng 6)

Kết quả này khẳng định quy trình nhân giống có thể vận hành ở sản xuất đồng thời cũng giới thiệu cho sản xuất một giống hoa cúc mới lạ Do có kích thước hoa lớn, chiều cao và đường kính

bông hoa gần tương đương nhau nên nông dân gọi là “hoa cúc đèn lồng” Giống hoa này có thể sử dụng tốt vào các mục tiêu trang trí

4 Kết luận

Quy trình nhân giống cây hoa cúc Nhật “Rivalry” bằng kỹ thuật nuôi cấy mô với chế độ khử

trùng thích hợp cho mô thân và mô lá cúc là: HgCl2 0,2% trong 7 phút, ở chế độ khử trùng này mô lá cho tỷ lệ mẫu sạch, sống đạt 76,7% và mô thân đạt 86,7% Mô thân mang mắt ngủ được sử dụng làm vật liệu nuôi cấy khởi động vì cây tái sinh từ mô thân sẽ cho chất lượng cây con tốt hơn, khả năng nhân nhanh cũng như ra rễ mạnh hơn Môi trường MS + 1ppm BA được chọn nuôi cấy khởi

động, nhân nhanh in vitro Môi trường MS không bổ xung chất điều tiết sinh trưởng được chọn làm

môi trường tạo cây hoàn chỉnh, trên môi trường này chồi ra rễ 100% sau 2 tuần nuôi cấy, khả năng sinh trưởng và phát triển của cây con tốt Giá thể thích hợp cho cây cúc cấy mô ngoài vườn ươm là:

đất+ cát + trấu hun (1:1:1), giá thể này cho tỷ lệ sống đạt 100%, cây con sinh trưởng mạnh nhất Với qui trình này, đã sản xuất được hàng chục ngàn cây giống để trồng thử nghiệm ở Hải Phòng, Hà Nội, Thái Bình

Tài liệu tham khảo

Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Quang Thạch, Từ Thị Hoài Thu (1999) Nghiên cứu các phương pháp nhân nhanh một số giống hoa cúc chùm Hà lan Báo cáo khoa học Hội nghị Quốc gia về Công nghệ sinh học, tr 859-865

John M D., Harold F W., (1999) Floriculture Principles and Species, Prentice Hall, Inc., p

292-303

Linh Xuan Nguyen, (1998) Cut Flower Production in ASIA FAO, Bangkok, Thailand, p.63-67 Murashige T and Skoog F., (1962) A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco

tissue culture Physiol Plant 15 pp: 473- 497

Robert N Trigiano, Dennis J G., (2000) Plant Tissue Culture Concepts and Laboratory Excercises, CRC Press LLC, p 75-85