Bước đầu nghiên cứu nhân nhanh in vitro giống lan thạch hộc thiết bì (dendrobium officinale kimura et migo)

2 Thông tin chung về cây lan Dendrobium làm dược liệu...12 2.3 Đặc điểm hình thái và giá trị sử dụng của loài Dendrobium officinaleKimura et Migo thạch hộc thiết bì...13 2.4 Các nghiên c

Em xin chân thành cảm ơn ban chủ nhiệm khoa, các thầy giáo, cô giáo khoacông nghệ sinh học đã tạo điều kiện và giúp đỡ em được báo cáo khóa luận tốtnghiệp đợt 1 cũng như trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp.

Em xin được gửi lời cảm ơn tới ban lãnh đạo cùng toàn thể các thầy giáo, côgiáo, anh, chị trong viện sinh học nông nghiệp đã tạo điều kiện giúp đỡ, hỗ trợ emtrong thời gian thực hiện đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới gia đình, bạn bè

và người thân của em đã động viên, ủng hộ, giúp đỡ em trong suốt thời gianlàm khóa luận

Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Sinh viên

ĐỖ THỊ HIỀN

MỤC LỤC

Lời cảm ơn i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

1.2 Mục đích, yêu cầu 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

1.3 Ý nghĩa 3

1.3.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1.2Đặc điểm hình thái của chi lan Hoàng Thảo: 8

2.1.3 Đặc điểm sinh thái học chi Dendrobium-Hoàng Thảo 10

2 2 Thông tin chung về cây lan Dendrobium làm dược liệu 12

2.3 Đặc điểm hình thái và giá trị sử dụng của loài Dendrobium officinaleKimura et Migo (thạch hộc thiết bì) 13

2.4 Các nghiên cứu nhân giống lan Hoàng Thảo bằng kỹ thuật nuôi cấy mô trên thế giới và ở Việt Nam 15

2.4.1 Tình hình nuôi cấy mô lan Hoàng Thảo trên thế giới 15

2.2.2 Tình hình nuôi cấy mô lan Hoàng Thảo ở Việt Nam 18

II VẬT LIỆU NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 24

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1.Nội dung nghiên cứu 24

2.3 Phương pháp nghiên cứu 25

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu nội dung 1: 26

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu nội dung 2: 28

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu nội dung 3: Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh 29

2.3.4 Phương pháp nghiên cứu nội dung 4: 30

2.4 Điều kiện thí nghiệm: 31

2.5 Các chỉ tiêu theo dõi 31

2.5.1 Các chỉ tiêu theo dõi trong nuôi cấy in vitro 31

2.5.2 Các chỉ tiêu theo dõi trong vườn ươm 31

2.6 Xử lí số liệu: 31

III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Nhân giống lan Dendrobium officinale Kimura et Migo từ hạt 32

3.1.1 Ảnh hưởng của môi trường nền đến giai đoạn khởi động mẫu tạo vật liệu ban đầu trong gieo hạt lan Dendrobium officinale Kimura et Migo 32

3.1.2 Ảnhhưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh protocorm loài lan Dendrobium officinale Kimura et Migo 33

3.1.3 Ảnhhưởng nồng độ Kinetin đến khả năng nhân nhanh protocorm loài lan Dendrobium officinale Kimura et Migo 36

3.1.4 Ảnhhưởng nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh protocorm loài lan Dendrobium officinale Kimura et Migo 37

3.2 Nhân giống vô tính lan Dendrobium officinale Kimura et Migo thông qua nuôi cấy đoạn thân 39

3.2.1 Ảnhhưởng nồng độ BA kết hợp αNAA đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân của đoạn thân mang mắt ngủ lan Dendrobium officinale Kimura et Migo 39

3.2.2 Ảnhhưởng nồng độ BA kết hợp IBA đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân của đoạn thân mang mắt ngủ giống lan Dendrobium officinale Kimura et Migo 42

3.3 Tạo cây hoàn chỉnh 44

3.3.1Ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh rễ chồi loài lan Dendrobium officinale Kimura et Migo 45

3.3.2 Ảnh hưởng của IAA đến khả năng sinh rễ chồi loài lan Dendrobium officinale Kimura et Migo 46

3.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến sinh trưởng của cây in vitroDendrobium officinale Kimura et Migo ngoài vườn ươm 47

IV KẾT LUẬN 50

4.1 Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu, chúng tôi rút ra một số kết luận sau 50 4.2 Đề nghị 51

V TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC

MS Murashige & Shoog, 1962

LSD Sai khác tối thiểu có ý nghĩa ở P = 0.5

(Least Significant Difference)

VW Vacin & Went, 1949

RE Robert Ernst, 1979

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.1.1 Ảnh hưởng của môi trường nền đến giai đoạn khởi động mẫu tạo vật liệu ban đầutrong gieo hạt lan Dendrobium officinale Kimura et Migo 33Bảng 4.1.2 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh protocorm loàilan Dendrobium officinale Kimura et Migo 35Bảng 4.1.4Ảnh hưởng nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh protocorm loài lanDendrobium officinale Kimura et Migo(sau 8 tuần nuôi cấy) 37Bảng 4.2.1 Ảnh hưởng nồng độ BA kết hợp αNAA đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân củađoạn thân mang mắt ngủ lan Dendrobium officinale Kimura et Migo 40Bảng 4.2.2Ảnh hưởng nồng độ BA kết hợp IBA đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhâncủa đoạn thân mang mắt ngủ giống lan Dendrobium officinale Kimura et Migo 43Bảng 4.3.1Ảnh hưởng của nền môi trường đến khả năng ra rễ của chồi của loàiDendrobium officinale Kimura et Migo(sau 4 tuần nuôi cấy) 45Bảng 4.3.2.Ảnh hưởng của IAA đến khả năng sinh rễ chồi loài lan Dendrobium officinaleKimura et Migo 45Bảng 4.4Ảnh hưởng của giá thể đến sinh trưởng của cây in vitro Dendrobium officinaleKimura et Migo ngoài vườn ươm 48

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1 Lan Thạch Hộc 19Hình 2 Lan Thạch Hộc 22Hình 3 Đoạn thân mang mắt ngủ 28Hình 4 : ảnh hưởng của môi trường nền VW, MS, H đến giai đoạn khởi tạo vật liệuban đầu trong gieo hạt lan Dendrobium officinale Kimura et Migo 32Hình 5: ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh prptocorm loài lanDendrobium officinale Kimura et Migo (sau 8 tuần nuôi cấy) 34Hình 6: Ảnh hưởng nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh protocorm loài lanDendrobium officinale Kimura et Migo(sau 8 tuần nuôi cấy) 37Hình 7: Ảnh hưởng nồng độ BA kết hợp αNAA đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhâncủa đoạn thân mang mắt ngủ lan Dendrobium officinale Kimura et Migo 39Hình 8: môi trường CT7 (Môi trường MS + 20g sacaroza/lít môi trường + 6g agar/lít môitrường + 10% nước dừa (ND) + 0,5ppmBA+0,1 ppm αNAA là môi trường tốt nhất để táisinh chồi cho đoạn thân mang mắt ngủ của loài lan nghiên cứu 41Hình 9: Ảnh hưởng nồng độ BA kết hợp IBA đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhâncủa đoạn thân mang mắt ngủ giống lan Dendrobium officinale Kimura et Migo 42Hình 10: Ảnh hưởng của IAA đến khả năng sinh rễ chồi loài lan Dendrobiumofficinale Kimura et Migo 46Hình 11: 4 loại giá thể trồng lan 49Hình 12: Giá thể mùn dừa 50

MỞ ĐẦU

Đặt vấn đề

Thạch hộc Thiết bì có tên gọi khác là Thạch hộc rỉ sắt, Hắc tiết thảo, Thiết

bì lan, Lí thụ thảo là cây thảo lâu năm thuộc Chi Thạch hộc họ Lan, thường sinhtrưởng ở các vách đá, khe đá, hoặc phụ sinh trên cây cổ thụ, ở vùng cao núi đá,nhiệt đới, Á nhiệt đới, độ cao từ 800 – 1000 m.Theo “Dược điển nước cộng hòaTrung Hoa” xuất bản năm 2005 đã ghi nhận ở Trung Quốc có 5 Chi Thạch hộc là:Thạch hộc hoàng thảo, Thạch hộc bờm ngựa, Thạch hộc vỏ tím, Thạch hộc rỉ sắt,Thạch hộc Kim thoa, trong đó Thạch hộc rỉ sắt là quý nhất được đánh giá là tuyệtphẩm của Thạch hộc

Lan Hoàng Thảo (Dendrobium) là một trong những chi lớn nhất của họ lan(Orchidaceae) Theo A Takhajan (1966) chi Hoàng Thảo trên thế giới có khoảng

1400 loài, chủ yếu phân bố ở lục địa Đông Nam Á và các đảo thuộc Philippin,Malaixia, Inđônêxia, Ghinê, Đông Bắc Ôxtrâylia (Dương Đức Huyến, 2007)

Dendrobium officinale Kimura et Migo (Thạch hộc Thiết bì) là loài lan đặc

hữu, phân bố chủ yếu ở một số vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Trung Quốc Đây làloài lan đựơc dùng để chế biến ra loại thuốc bổ có một số tác dụng trị bệnh nhưdưỡng âm, thanh trừ nhiệt, lợi tiêu hóa, tăng cường sản xuất dịch tiết cơ thể, ngănngừa ung thư và kéo dài tuổi thọ…Nhờ hiệu quả trị bệnh không có gì sánh bằng đã

đưa D officinale vượt lên đứng đầu trong bảng xếp hạng 9 loại cỏ thuốc siêu nhiên của Trung quốc D Officinale là một loài thực vật biểu sinh thường sống bám trên

những vách đá hay lủng lẳng trên các thân cây to phủ đầy mùn và rêu ở độ caokhoảng từ 800m đến 1500m so với mực nước biển Do sống ở môi trường đặc biệt

như thế nên D officinale trở nên rất nhạy cảm khi lãnh địa của chúng bị tàn phá Hiện nay D officinale phân bố rất phân tán và không liên tục do hậu quả của sự tàn

phá môi trường sống bởi các họat động đốn gỗ và khai thác quá mức của con người

đã khiến cho D officinale đứng trên bờ vực tiệt chủng, trở thành loài có nguy cơ liệt

vào danh sách các loài cần được bảo vệ (S.Gu, 2007) Ở Trung Quốc đã có nhiềusản phẩm thuốc từ Thạch hộc bán ra thị trường trong và ngoài nước Thạch hộc chế

biến thành phong đấu, giá xuất khẩu vào những năm 80 thế kỷ trước đạt mức 3.000USD/kg Ở Đài Loan giá phong đấu từ 1.000-3.000USD/kg Nhu cầu của TrungQuốc và các nước trên thế giới về Thạch hộc còn rất lớn với giá cao, đem lại siêulợi nhuân cho những người trồng và chế biến thạch hộc Nhu cầu thị trường TrungQuốc hiện nay cần khoảng 2000 tấn/năm, nhưng mới sản xuất được 200 tấn/năm.

Dự báo trong 10 năm tới thị trường nội địa cần tới 15000 tấn/năm tương đươnghàng chục tỉ USD

Trong 3 năm gần đây Viện Sinh học Nông nghiệp đã thành công khi áp dụngcông nghệ nuôi cấy mô nhân giống một số loài lan bản địa làm dược liệu thuộc chiHoàng Thảo có nguy cơ bị tuyệt chủng (Nguyễn Thị Sơn và cs, 2012 và NguyễnThị Sơn và cs, 2013)

Tuy nhiên, tại Việt Nam chưa có đơn vị, công ty nào nhân giống, nuôi trồngsản xuất và cung ứng nguồn cây giống lan Thạch hộc Thiết bì mà hoàn toàn phảinhập từ Trung Quốc Để chủ động nguồn cây giống có chất lượng cao, sạch bệnhphục vụ cho phát triển sản xuất phục vụ nhu cầu nội tiêu cũng như xuất khẩu thìnhiệm vụ nhân giống lan bằng phương pháp nuôi cấy mô là hướng đi đúng đắnnhằm bổ sung thêm giống lan thuốc, đẩy mạnh phát triển loại lan dược liệu quýhiếm cho Việt Nam là vấn đề cấp thiết hiện nay nên chúng tôi thực hiện đề tài

“Bước đầu nghiên cứu nhân nhanh in vitro giống lan Thạch hộc Thiết bì

(Dendrobium officinale Kimura et Migo)”.

I.2 Mục đích, yêu cầu

1.2.1 Mục đích

Nghiên cứu xây dựng được các khâu cơ bản trong nhân nhanh in vitro giốnglan Thạch hộc thiết bì làm cơ sở để xây dựng quy trình nhân giống bằng phươngpháp gieo hạt và nhân giống vô tính hướng tới sản xuất lượng lớn cây lan nhằmcung cấp dược liệu bổ sung vào thực phẩm, nâng cao chất lượng sản phẩm

1.2.2 Yêu cầu

 Các thí nghiệm nhân giống bằng phương pháp gieo hạt

_Xác định được môi trường thích hợp gieo hạt cho giống lan Thạch hộc thiết

bì thu thập được

_Xác định được môi trường thích hợp nhân nhanh protocom của hạt sau khi gieo

 Các thí nghiệm nghiên cứu nhân giống vô tính

_ Xác định được ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng đến phát sinh hìnhthái và hệ số nhân của đoạn thân mang mắt ngủ

_Xác định được môi trường tạo rễ tối ưu cho chồi lan được tái sinh từ mắt ngủ._Xác định được giá thể thích hợp cho cây lan hoàng thảo Thạch Hộc Thiết

Bì cấy mô khi đưa ra vườn ươm

I.3 Ý nghĩa

I.3.1 Ý nghĩa khoa học

Cung cấp những dẫn liệu khoa học về ảnh hưởng của môi trường nền, cácchất điều tiết sinh trưởng đến quá trình phát sinh hình thái và nhân nhanh của giốnglan Thạch Hộc Thiết Bì, một giống lan làm dược liệu quý còn chưa được nghiêncứu ở Việt Nam

I.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Xác định được những khâu cơ bản của quy trình nhân giống nuôi cấy mô củagiống lan Thạch Hộc Thiết Bì làm cơ sở xây dựng quy trình nhân giống invitrogiống lan Thạch Hộc Thiết Bì phục vụ phát triển dược liệu

I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium),

2.1.1 Vị trí phân bố và phân loại lan chi Hoàng Thảo (Dendrobium)

 Phân bố : Dendrobium là một chi lớn trong họ Phong lan với trên

1.600 loài và đã được lai tạo thêm rất nhiều loại mới Chi Dendrobium được phân

bố rộng rãi nhiều ở Nam Á, Đông Á và Đông Nam Á cho đến Philippines, Borneo,nước Úc, Tân Gui-nê, Quần đảo Solomon và New Zealand Dendrobium mọc nhiều

nhất ở vùng Đông Nam Á (nguồn http://vi.wikipedia.org )

Theo Dương Đức Huyến (2007) xây dựng hệ thống phân loại lan Hoàng Thảo ở Việt Nam chủ yếu dựa trên hệ thống của Seidenfaden (1985)

thành 15 sectio

Sectio 1: Grastidium (Blume) J J Smith - Trúc lan

Những loài thuộc sectio này mang các đặc điểm: thân rất mảnh, lá mảnh dạng lưng-bụng; bẹ lá nhẵn; gốc môi tự do không có cựa

Sectio này có khoảng 100 – 120 loài Phân bố ở lục địa Đông Nam Á, Inđônexia, Đông bắc Oxtraylia, ưu thế ở Niu Ghinê Ở Việt Nam có 3 loài.

Sectio 2: Conostalix Kraenzl

Thuộc về sectio này gồm các loài có đặc điểm gần với sect Grastidium

(thân rất mảnh, lá mảnh dạng lưng-bụng) nhưng khác là bẹ lá có phủ lông dài màu

đen Gốc cánh môi có mép dính với mép bên của chân cột tạo thành cựa ngắn.

Có 14 loài phân bố ở lục địa Đông Nam Á, Malayxia, Singapo, Inđônêxia, Đông Nam Ôxtrâylia Ở Việt Nam có 3 loài.

Sectio 3: Formonsae (Benth & Hook F.) Hook.f.

Đặc điểm: lá mỏng dạng lưng-bụng; lá non và bẹ lá mang lông ngắn màu đen hoặc nâu giống với sect Conosatlix Tuy nhiên thân các loài của tông này dày mập lên hình trụ hoặc hình con suốt; hoa to màu trắng hoặc vàng nhạt.

Sect này có khoảng 30 – 35 loài ở lục địa nhiệt đới châu Á, Inđônêxia, Philippin Việt Nam có 10 loài.

Sectio 4: Dendrobium – Hoàng thảo

Đây là sectio khá lớn có nhiều loài hơn cả Chúng mang đặc điểm khá

giống với sect Formosae bởi thân mập, hình trụ hoặc hình con suốt Cụm hoa ngắn, nhiều hoa, hoa to So với sect Formosaei thì nó có một số đặc điểm

khác biệt ở chỗ hoa thường có cằm ngắn dạng túi, cánh môi hơi cuộn lại thành hình phễu, tận cùng có chai dày.

Sectio này có khoảng gần 300 loài phân bố ở lục địa nhiệt đới châu Á, Trung Quốc (Hải Nam), đảo Đài Loan, Inđônêxia Việt Nam có 30 loài.

Sectio 5: Breviflores Hook f

Đây là một sectio không lớn, mang những đặc điểm phần nào giống với

sect Dendrobium như: thân ít nhiều dày mập lên, lá mỏng dạng lưng-bụng, gốc

môi có chai dày Tuy nhiên cánh môi ở sectio này có hình chén và vách có phủ lông chia môi thành 2 phần.

Sectio này có khoảng 18 loài ở các lục địa châu Á, Hải Nam, Inđônêxia Việt Nam có 8 loài.

Sectio 6: Distichophyllum Hook F

Sectio này có số loài tương đối ít và mang những đặc điểm gần với sect Grastidium và sect Conostalix ở chỗ thân còn mảnh; có dày lên ở một vài đại diện nhưng không mập hẳn; hoa không lớn; lá dẹt dạng lưng-bụng Điều khác là lá xếp dày xít và hơi dày lên; cằm hơi dài so với kích thước của hoa.

Trên thế giới có khoảng 15 loài phân bố ở Đông Nam Á Việt Nam có 3 loài gồm:

Sectio 7: Superbientia Kraenzl.

Đặc điểm khá giống với sect Chrysotoxae ở chỗ thân mập hình con

suốt; lá dày dạng da, mọc cụm ở phần đỉnh; chùm hoa dài Tuy vậy nó cũng khác biệt căn bản ở chỗ hoa thường xếp thưa chứ không dày như ở sect.

Chrysotoxae Hơn nữa, gốc cánh môi không có các u lồi lớn Điều đặc biệt là

sectio này có cằm kép tạo thành khớp do sự dính lại của gốc môi, chân cột và mép trong gốc lá đài bên.

Thế giới có khoảng 13 loài phân bố ở lục địa châu Á, Inđônêxia, Đông Bắc Ôxtrâylia Việt Nam có 1 loài.

Sectio 8: Pedilonum (Blume)

Đặc điểm của các loài trong sectio khá giống với sect Distichophyllum

ở chỗ thân thường hình trụ, lá hình mác, ít nhiều mảnh Hoa của sectio này có cằm khá dài, thường hình trụ và cong, cụm hoa nhiều hoa hơn sect.

Distichophyllum.

Thế giới có 160-180 loài phân bố ở lục địa Đông Nam Á, Phylippin, Indonexia, Đông Bắc Ôxtrâylia, các đảo ở phía tây thái Bình Dương Việt Nam có 3 loài.

Sectio 9: Stachyobium Lindl

Gồm các loài mang những đặc điểm khá gần với sectio Dendrobium là

có thân mập hình trụ và gần với sect Chrysotoxae có thân hình con suốt; lá mảnh giống với sectio Dendrobium nhưng lại thường mọc tập trung ở phía đỉnh giống với sectio Chrysotoxae, hoa cả hai sectio kể trên ở chỗ có mép

cánh môi uốn lượn và xẻ răng, không có u lồi rõ rệt

Trên thế giới có 40 – 50 loài phân bố ở lục địa nhiệt đới châu Á, Trung Quốc (Đài Loan), Indonexia Việt Nam có 6 loài.

Sectio 10: Chrysotoxae Kraenzl

Sectio này bao gồm các loài mang những đặc điểm là có cánh hoa to, cánh môi thường phủ lông rậm, có u lồi, thân mập hình con suốt; lá tập trung

ở đỉnh; cụm hoa thường nhiều hoa.

Thế giới có 10 loài, phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới châu Á, Việt Nam

có 6 loài.

Sectio 11: Bolbidium Lindl Ex Lindl

Đây là một sectio nhỏ Mặc dù thân của các đại diện dày mập lên hình

con suốt giống với sect Chrysotoxae nhưng chỉ gồm một lóng trên một cuống

ngắn gồm vài đốt dưới lóng cùng của thân Hoa có cằm dài, cong và có cựa

mật; cụm hoa ở đỉnh gồm một hoa ở giữa 2 lá là điểm khác biệt căn bản so

với sect Chrysotoxae.

Thế giới có 7 – 8 loài phân bố ở lục địa châu Á, Philippin, Indonexia Việt Nam có 3 loài.

Sectio 12: Crumenatae Pfitz

Các loài thuộc sectio này có thân mảnh; hoa nhỏ giống như sect.

Grastidium nhưng 2 – 3 lóng ở gốc phình lên thành bọng mập Một số loài có

lá hình trụ, đỉnh nhọn; cánh môi chia thùy, khác hẳn với sect Grastidium.

Thế giới có 40 – 50 loài phân bố ở lục địa châu Á, một số đảo như Hải Nam (Trung Quốc), Đài Loan, Indonexia, Philippin Việt Nam có 8 loài.

Sectio 13: Strongyle Lindl

Sectio này có các loài mang nhiều đặc điểm của sect Grastidium là

thân mảnh không bao giờ dày mập lên, hoa nhỏ nhưng lại mang đặc điểm khác hẳn là có lá hình trụ, hơi cong giống với các đại diện của sect.

Crumenatae.

Sectio này có khoảng 20 loài phân bố ở lục địa châu Á, Philippin, Indonexia Việt Nam có 2 loài.

Sectio 14: Aporum (Blume) Lindl

Đặc điểm của các loài thuộc sectio này tương đối giống với sect.

Strongyle ở chỗ thân mảnh, hoa nhỏ, lá không còn dạng lưng-bụng nữa nhưn khác sect Strongyle căn bản là thân và lá đều dẹp bên; lá ngắn, mọng nước,

xếp xít lợp gốc lên nhau.

Thế giới có khoảng 40 loài phân bố ở lục địa châu Á, Trung Quốc (Hải Nam), Indonexia Việt Nam có 12 loài.

Sectio 15: Oxystophyllum (Blume) Miq

Sectio này mang các đặc điểm khá giống với sect Aporum là có lá và

thân dẹp bên, lá mọng nước và có gốc lợp xếp xít lên nhau, hoa nhỏ Đặc

điểm khác biệt so với sect Aporum là sectio này có 5 – 7 lá bắc xếp dạng vẩy

lợp, cánh môi có 1 u lồi hình côn ở mặt dưới.

Thế giới có khoảng 25 loài phân bố ở lục địa Đông Nam Á, Indonexia Việt Nam có 1 loài.

2.1.2Đặc điểm hình thái của chi lan Hoàng Thảo:

a.Thân

Các đại diện của chi Hoàng thảo (Dendrobium) rất dễ nhận biết ngoài thiên

nhiên Đó là các cây thân thảo mọc cụm, đứng thẳng hoặc rủ thõng, phân đốt, sốngphụ sinh trên các cây gỗ hoặc ít gặp các loài sống bám trên đá, trong rừng ẩm Chilan Hoàng Thảo thuộc nhóm đa thân (sympodial) với nhiều giả hành Đây là nhómbao gồm các cây tăng trưởng liên tục nhưng có chu kỳ nghỉ sau những mùa sinhtrưởng Chi này vừa có thân thật vừa có giả hành Giả hành tuy là thân nhưng lạichứa diệp lục, dự trữ nước và nhiều chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển giảhành mới Cấu tạo giả hành gồm nhiều mô mềm chứa đầy dịch nhầy, phía ngoài cólớp biểu bì với vách tế bào dày, nhẵn bóng bảo vệ để tránh sự mất nước do sức nóngcủa mặt trời Đa số các củ giả hành có màu xanh nên nó đã cùng với lá làm nhiệm

vụ quang hợp (Trần Hợp, 2000)

Thân của các đại diện chi Hoàng Thảo đều phân đốt, hình trụ, hình con suốt,hình chùy, hình trứng…có chiều dài thay đổi từ 2-3cm đến 120 cm hoặc đôi khihơn, kích thước phổ biến là 20-50cm Lát cắt ngang thân có thể là hình tròn, bầudục, đôi khi hình 4 cạnh nhưng được gọi chung theo kích thước ngang này là chiềudày, thay đổi từ 0,3-1,5cm nhưng đa số hay gặp là khoảng 0,5-1cm Thân có thểmảnh, đôi khi dẹp bên hoặc là dày mập lên Phần dầy mập lên của thân gồm một vàilóng ở sát gốc hoặc ở sát đỉnh, còn thì đa số là ở giữa thân đều dần lên đến đỉnh vàxuống phía gốc Đôi khi phần dày lên theo hình con suốt có 4 gờ sắc Ở cá biệt vàiloài chỉ có các mấu dày lên, còn lóng thì hầu như không làm thân có tràng hạt hoặc

sự dày lên là dần dần độc lập ở mỗi lóng làm thành dạng đùi gà nối tiếp Phần tậncùng là gốc, nơi xuất phát của rễ, thường là nhỏ mảnh nhưng cũng không ít trườnghợp phình to ra (Dương Đức Huyến, 2007)

b Rễ

Sự đa dạng về hình thái và cấu trúc rễ đã làm cho chi lan hoàng thảo phù hợpvới điều kiện sống như khi sống trong đất thì rễ mập, thân rễ bò dài (Trần Hợp,2000) Rễ của các đại diện chi Hoàng Thảo là rễ khí sinh, mảnh, hình trụ, màu xanh

và chuyển thành nâu khi già, chúng thường ôm lấy giá thể hoặc buông thõng xuống.

Ở một số loài sống bám lơ lửng trên vỏ thân cây gỗ làm nhiệm vụ lấy nước, muốikhoáng, hấp thụ dinh dưỡng, chúng được bao bọc bởi lớp mô hút ẩm dày bao gồm

cả những lớp tế bào chết chứa đầy không khí do đó nó ánh lên màu xám bạc Chiềudài của rễ từ 0,1- 0,3cm; rễ thường mọcra từ phần gốc của thân hoặc đôi khi có thể

ở mấu thân của một vài loài

là tròn lệch nhau Chiều dài của lá thay đổi từ 1-19 cm và chiều rộng từ 0,3-3,5cm

Lá hình trụ thường có bề dày (từ 0,2-0,4cm) (Dương Đức Huyến, 2007)

d Cụm hoa

Cụm hoa chùm thường nhiều hoa, đôi khi ít hoa hoặc đơn độc Cụm hoa dàithường rủ thõng xuống, nhiều loài có cụm hoa đẹp có giá trị làm cảnh (Dương ĐứcHuyến, 2007)

e Hoa

Hoa lưỡng tính, đối xứng hai bên Màu sắc hoa đa dạng, sặc sỡ Hoa đa số cácloàicó hương thơm, Bao hoa chia 2 vòng Vòng ngoài gồm 1 lá đài giữa và 2 lá đài bên.Vòng trong gồm có 2 cánh hoa và một cánh môi (Dương Đức Huyến, 2007)

* Cằm

Là một bộ phận được hình thành nhờ mép phần gốc 2 lá đài bên dính nhau vàdính với chân cột Cằm có các hình bán cầu, hình túi đến hình cựa, hình trụ cong ítnhiều (Dương Đức Huyến, 2007)

* Cánh môi

So với lá đài, cánh hoa ít nhiều có kích thước và màu sắc khác biệt Tuynhiên, ngay trong các cánh hoa thì cánh môi khác nhiều so với các thành phần cònlại của bao hoa cả về màu sắc, kích thước lẫn trang trí Trang trí đa dạng trên cánhmôi như đốm, vạch, diềm tua, u lồi, đường sống, lông phủ chiếm vị trí khá quantrọng trong phân loại Nhiều đại diện có gốc cánh môi dính với chân cột tạo thànhcựa (Dương Đức Huyến, 2007)

* Cột (trụ nhị-nhụy)

Cột hay còn gọi là trụ nhị-nhụy, thường thấp, mặt trước hơi lõm lòng máng;đỉnh cột lõm để chứa khối phấn, hai mép đỉnh cột có 2 răng cột; phủ lên đỉnh cộtnắp bao phấn (thường gọi đơn giản là nắp) Ở gốc cột có mỏ, thường là một phầnphụ dạng màng nhô ra nhằm ngăn cách bao phấn với nhụy (hốc đặt phấn) Chỗ thấpnhất phía dưới cột là chân cột, thường hình tam giác thuôn và có tuyến mật Baophấn hình mũ, bề mặt thường nhẵn hoặc có nhũ mịn, đôi khi có lông nạc bao phủ.Khối phấn hình chùy, không có chuôi, số lượng là 4, xếp thành 2 cặp Bầu hạ,thường nhỏ và thon dần xuống cuống hoa, ranh giới giữa bầu và cuống hoa không

rõ rệt, bầu 3 ô, rất nhiều noãn (Dương Đức Huyến, 2007)

f Quả

Quả nang thường hình chùy hoặc hình con suốt, chứa rất nhiều hạt nằm xenlẫn những sợi lông mảnh Khi quả già, gặp trời ẩm sợi này sẽ hút nước và trươnglên, phá vỡ vỏ quả giải phóng hạt ra ngoài Hạt rất nhỏ, hầu như không trọng lượng,bao quanh hạt là lớp màng dạng mắt võng, trong suốt chứa đầy không khí dễ dàngbay cùng hạt trong không khí nhờ gió (Dương Đức Huyến, 2007)

2.1.3 Đặc điểm sinh thái học chi Dendrobium-Hoàng Thảo

a Nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng nhiều đến sự tăng trưởng phát triển của lan Dendrobium

thông qua con đường quang hợp và hoạt động trao đổi chất Nhiệt độ thích hợp câyquang hợp tốt, khả năng tích luỹ chất khô cao nên sinh trưởng và phát triển của câytốt Ngược lại nếu nhiệt độ quá cao hoặc thấp sẽ ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng vàphát triển của lan

Lan Hoàng Thảo thuộc loại cây ưa nóng, sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 24-330C

Dưới 120C và trên 370C đều làm chậm và ảnh hưởng lớn đến sự ra hoa của cây.

Trong thực tế sản xuất tại miền Bắc có mùa đông lạnh và mùa hè nóng thìcần hạn chế tác động xấu của nhiệt độ bằng cách vào mùa đông thì che phủ nilonquanh nhà trồng lan hoặc thắp điện còn mùa hè che lưới phản quang, có hệ thốngphun tưới thích hợp và tạo điều kiện thông thoáng trong nhà lan sẽ đem lại hiệu quả

rõ rệt (Nguyễn Thị Kim Lý, 2009)

b Ẩm độ

Độ ẩm thích hợp giúp cho cây được phát triển nhanh hơn hoa tươi và lâu tàn

Dendrobium cũng như đa số các giống lan khác chỉ phát triển tốt trong điều kiện

không khí ẩm nhưng thoáng khí, vào ban ngày cây cần độ ẩm khoảng từ 40-60%,vào ban đêm độ ẩm thích hợp từ 60-90% thì cây sẽ phát triển tốt hơn Loại giá thể

quá ẩm và úng sẽ là điều kiện bất lợi cho sự sinh trưởng của giống Dendrobium vì

có thể bị thối toàn bộ rễ và biểu hiện là các cây con mọc từ phần ngọn của thân (BùiThị Thu Hiền, 2009)

c Ánh sáng

Dendrobium là giống ưa sáng, có thể trồng trong điều kiện ánh sáng trực tiếp

hay khuếch tán Ánh sáng hữu hiệu cho giống Dendrobium là 70%, vì thế giàn che

với độ che sáng 30% dưới đất và 40% ở trên cao với cường độ ánh sáng từ

15.000-30.000 lux rất thích hợp cho sự phát triển của Dendrobium

Mùa hè của miền Bắc cường độ ánh sáng mạnh, nhu cầu ánh sáng của lanHoàng Thảo khoảng 70-80% ánh sáng trực tiếp Trong điều kiện râm mát câythường yếu, mọng nước, rất dễ nhiễm bệnh Về mùa đông cường độ ánh sáng yếu

và thời gian chiếu sáng ngắn, để lan Hoàng Thảo sinh trưởng và phát triển tốt và

ra hoa được thì cần bổ sung ánh sáng bằng cách thắp điện cho vườn lan (Bùi ThịHiền, 2009)

d Dinh dưỡng

Lan Hoàng Thảo yêu cầu một lượng dinh dưỡng nhất định để sinh trưởng vàphát triển Tuy không đòi hỏi số lượng lớn nhưng phải đầy đủ các thành phần dinhdưỡng N, P, K và các nguyên tố trung, vi lượng Tuỳ từng giai đoạn sinh trưởng mànhu cầu đối với các thành phần dinh dưỡng có khác nhau (Đào Thanh Vân, ĐặngThị Tố Nga, 2008)

d Giá thể

Giá thể của Dendrobium cần chậu phải thật thoáng và không úng nước Tuy

nhiên do bản năng sinh học và cấu trúc thực vật với giả hành có thân, các loài thuộc

giống Dendrobium cần giá thể hơi ẩm chút ít nhưng không được làm thối căn hành.

Vì thế một số loài Dendrobium có thể phát triển trên các giá thể là xơ dừa hay cả

quả dừa, dùng như một cái chậu chứa sẵn giá thể Tuy nhiên nếu giá thể là xơ dừaphải hạn chế số lần tưới nước, nếu chậu là quả dừa nguyên phải cưa phần đáy, nếu

không cây bị thối vì quá ẩm Cũng có thể trồng cây lan Dendrobium với căn hành

cách đáy chậu khoảng 3cm, rồi rải thật thoáng xung quanh căn hành là một số rễ lụcbình giặt sạch Với cách trồng này thì kích thước chậu và cây phải thật tương xứng.Tuy nhiên, giá thể than và gạch nung vẫn tỏ ra hiệu quả nhất đối với các loài

Dendrobium

2 2 Thông tin chung về cây lan Dendrobium làm dược liệu

Chi Dendrobium được Olof Swartz đặt tên năm 1799 thuộc họ

Epidendroideae, tông Epidendreae (R.L.Dressler,1981) Chi này lớn thứ nhì của họ

lan với 1600 loài và đã được lai tạo thêm rất nhiều loài mới, phân bố trên các vùng

Châu Á nhiệt đới cũng tập trung nhiều ở Châu Á, Châu Úc Chi Dendrobium có trên

1000 giống (theo Dương Đức Huyến, 2007), tại Việt Nam có khoảng 110 giống

Phần lớn các loài trong chi Lan Dendrobium được dùng làm dược liệu và điều trị rất

nhiều bệnh khác nhau Chúng tôi thống kê một vài kết quả sử dụng làm dược liệucủa một số loài lan thuộc chi Hoàng Thảo, theo (http://www.hoalanvietnam.org)

+ Tại Ấn Độ, D.monticola và D ovatum được dùng làm kem bôi cho da tay chân được mềm mại và D moschatum chữa chứng đau tai

+ Tại Malaysia, D bifarum, D planibulbe và D purpurum được dùng để chữa trị nhiều chứng bệnh về da liễu Ở Malaysia và Jova, D crumenatum được dùng để chữa chứng đau tai hay nhiễm trùng trong tai, còn D hymenanthum dùng để chữa bệnh phù thũng và D.sulbulatum được nghiền ra để trị chứng nhức đầu

+ Lá cây D crispatum cũng được dân đảo Haihiti vò ra để chữa nhức đầu và làm

dịu những cơn đau trầm trọng

+ Người Philippin dùng D taurinum làm thuốc gội đầu trị chứng rụng tóc + Tại đảo QueenLand, Austraylia người ta dùng D discolor để làm thuốc chữa

bệnh nhiễm trùng và bệnh hắc lào

+ Một vài loài trong chi Dendrobium ở New Zealand được ghi nhận là có

tính chất kích thích tình dục

+ Những loài khác như D acinaciforme ở Ambon, D chryseum ở Ấn Độ,

D.moniliforme tại Hàn Quốc, Đài Loan và D nobile ở Trung Hoa đã và đang được

dùng vào mục đích gia tăng sinh hoạt tình dục

2.3 Đặc điểm hình thái và giá trị sử dụng của loài Dendrobium officinaleKimura et Migo (thạch hộc thiết bì).

Thạch hộc Thiết bì có tên gọi khác là Thạch hộc rỉ sắt, Hắc tiết thảo, Thiết

bì lan, Lí thụ thảo là cây thảo lâu năm thuộc Chi Thạch hộc họ Lan, thường sinhtrưởng ở các vách đá, khe đá, hoặc phụ sinh trên cây cổ thụ, ở vùng cao núi đá,nhiệt đới, Á nhiệt đới, độ cao từ 800 – 1000 m.Theo “Dược điển nước cộng hòaTrung Hoa” xuất bản năm 2005 đã ghi nhận ở Trung Quốc có 5 Chi Thạch hộc là:Thạch hộc hoàng thảo, Thạch hộc bờm ngựa, Thạch hộc vỏ tím, Thạch hộc rỉ sắt,Thạch hộc Kim thoa, trong đó Thạch hộc rỉ sắt là quý nhất được đánh giá là tuyệtphẩm của Thạch hộc

Trong Thạch hộc rỉ sắt có nhiều hợp chất có giá trị dược lý Sử dụng cácphương pháp phân tích hiện đại, trong Thạch hộc rỉ sắt đã phân lập được 72 hợpchất đơn thể, trong đó đã giám định được 63 hợp chất và phát hiện

Trong Thạch hộc rỉ sắt có nhiều hợp chất có giá trị dược lý Sử dụng cácphương pháp phân tích hiện đại, trong Thạch hộc rỉ sắt đã phân lập được 72 hợpchất đơn thể, trong đó đã giám định được 63 hợp chất và phát hiện thêm 18 hợp chấtmới gồm các loại: Hợp chất loại Bibenzil và các dẫn xuất gồm 27 loại: Thạch hộc rỉsắt (gọi tắt là THT) A, THT.B, THT.C, THT.D, THT.E, THT.S, THT.G, THT.H,THT.I, THT.J, THT.K, THT.L, THT.M, THT.N, THT.O, THT.P, THT.Q, …v.v

Hợp chất Phenol có 12 loại; Hợp chất Lignanoid có 4 loại; hợp chất lacton có

2 loại; hợp chất dihydroflavon có 2 loại; Giám định hoạt tính kháng oxy hóa vàkháng u bướu, đã phát hiện phần lớn các hợp chất loại bibenzil đều có hoạt tínhkháng oxy hóa, có 2 loại hợp chất Bibenzil có hoạt tính kháng u bướu Công dụngdược lý của Thạch hộc rỉ sắt chủ yếu làTăng cường công năng miễn dịch: Thạchhộc rỉ sắt có công năng tư âm dưỡng huyết “Dược tính luận” đời nhà Thanh củaTrung Quốc cho biết, Thạch hộc rỉ sắt bổ thận, tích tinh, dưỡng vị âm, dưỡng khílực Với hàm lượng polysaccarit phong phú có công năng tăng cường miễn dịch

Nghiên cứu về dược lý hiện đại cho biết, Thạch hộc rỉ sắt có thể nâng cao năng lựcứng thích có tác dụng tốt về chống mệt mỏi và chống chịu ngạt oxy.

a Thạch hộc rỉ sắt ích vị sinh tân: trong “Thần nông bản thảo kinh”, “Bảnthảo tái tân” đã ghi nhận Thạch hộc rỉ sắt là thuốc trường vị, chữa trị đau dạ dày,đau bụng Y học hiện đại cho rằng, Thạch học rỉ sắt có tác dụng kiềm chế bệnh sántrùng, viêm dạ dày co bóp, uống nước có Thạch hộc xúc tiến bài tiết dịch dạ dày, ratăng năng lực bài khí của dạ dày, có lợi cho tiêu hóa

b Hộ gan lợi mật: Thạch hộc rỉ sắt có tác dụng lợi mật Xưa nay giới y họcđều cho rằng, Thạch hộc rỉ sắt có tác dụng tư dưỡng can âm, là dược thảo tốt điềutrị các bệnh gan, mật, chữa trị viêm gan, viêm túi mật, sỏi mật

c Kháng phong thấp: vào tuổi trung niên sức khỏe bắt đầu suy giảm, côngnăng xương cốt thoái hóa, Thạch hộc rỉ sắt có khả năng tư dưỡng âm dịch, bôi trơncác khớp, giúp cho gân cốt khỏe, khớp nối thanh thoát, có hiệu quả tăng cườngkháng phong thấp

d Giảm đường huyết, mỡ máu: Thạch hộc rỉ sắt dưỡng âm thanh nhiệt, thuận

táo, là thảo dược chuyên dụng để điều trị bệnh tiểu đường Kết quả nghiên cứu lâm

sàng cho biết Thạch hộc rỉ sắt không những có hoạt tính tăng cường Insulin, đồngthời có khả năng giảm đường huyết giúp cho máu hoạt động bình thường, xúc tiếntuần hoàn, giãn huyết quản, giảm cholesterol và triglyceride

e Kháng u bướu: Thạch hộc rỉ sắt có khả năng tiêu diệt một số tế bào ác tínhcủa ung thư phổi, ung thư buồng trứng, bệnh máu trắng với hoạt tính kháng ung thưtương đối mạnh Trong lâm sàng sử dụng Thạch hộc rỉ sắt làm thuốc điều trị bổsung các bệnh ung thư ác tính, cải thiện tính trạng của người bệnh, giảm nhẹ tácdụng phụ của các liệu pháp xạ trị, hóa trị, tăng sức miễn dịch, nâng cao chất lượngcuộc sống, kéo dài tuổi thọ

f Bảo hộ thị lực: Thạch hộc rỉ sắt có công năng dưỡng âm, dưỡng mục, làthảo mộc quý bảo vệ mắt, có hiệu quả tương đối tốt để chữa bệnh lòa của tuổi già,bảo vệ mắt cho trẻ em

g Tư dưỡng da: Khi vào tuổi trung niên, âm dịch sa sút, da lão hóa, nám da

và nhăn da Thạch hộc rỉ sắt có chất nhờn, có tác dụng tư nhuận dinh dưỡng da

h Kháng suy não: Thạch hộc rỉ sắt là thần dược có tác dụng trẻ hóa cơ thể.Trong Thạch hộc rỉ sắt có nhiều nguyên tố vi lượng quý có tác dụng chống lão hóa

tốt hơn nhiều so với các loại thuốc khác.

Ở Trung Quốc đã có nhiều sản phẩm thuốc từ Thạch hộc bán ra thị trườngtrong và ngoài nước Thạch hộc chế biến thành phong đấu, giá xuất khẩu vào nhữngnăm 80 thế kỷ trước đạt mức 3.000 USD/kg Ở Đài Loan giá phong đấu từ 1.000-3.000USD/kg Giá phong đấu hảo hạng cực kỳ đắt, ở thị trường Trung Quốc khoảng

30 đến 60 triệu VNĐ/kg Giá 1 cây Thạch hộc tươi 3 tuổi có giá 25.000 VNĐ –35.000 VNĐ, 1 ha trồng 1 triệu cây thạch hộc, có thể thu được 25-30 tỷ trong 3năm Ở thị trường Trung Quốc giá phong đấu Thạch hộc cao cấp là 60 triệuđồng/kg Nhu cầu của Trung Quốc và các nước trên thế giới về Thạch hộc còn rấtlớn với giá cao, đem lại siêu lợi nhuân cho những người trồng và chế biến thạchhộc Nhu cầu thị trường Trung Quốc hiện nay cần khoảng 2000 tấn/năm, nhưng mớisản xuất được 200 tấn/năm Dự báo trong 10 năm tới thị trường nội địa cần tới

15000 tấn/năm tương đương hàng chục tỉ USD

2.4 Các nghiên cứu nhân giống lan Hoàng Thảo bằng kỹ thuật nuôi cấy mô trên thế giới và ở Việt Nam

2.4.1 Tình hình nuôi cấy mô lan Hoàng Thảo trên thế giới

Một số kết quả đạt được trong nhân giống một số loài Dendrobium bằngphương pháp nuôi cấy mô (theo George, 1993)

D bigibbum

Lindl Các đoạn thân Tái sinh các chồi bên Kukylezanka and Wojciechowska

D spp Các ngọn chồi Tạo protocorm và tăng

sinh nhanh protocorm

var.superba Đỉnh sinh trưởng chồi ngọn Tạo protocorm và tăngsinh nhanh protorm Morel (1974)

D lacniosum Đỉnh sinh trưởng

của chồi ngọn và chồi bên

Tạo sự khởi đầu và nhân nhanh tiền củ (protocorm)

trên thế giới Một số phương pháp nuôi cấy phát sinh cụm chồi qua nuôi cấy đỉnhsinh trưởng và phôi PLB đã được báo cáo (Manorama và cs, 1986; Artidi và Ernst,1993; Nayak và cs, 1997, 2002) Nuôi cấy phát sinh phôi vô tính trong môi trườnglỏng được đặc biệt quan tâm do là một hệ thống nuôi cấy thích hợp nhân nhanhcông nghiệp trong các hệ thống bioreactor (Zimmerman, 1993) Nuôi cấy hạt

Dendrobium đầu tiên được Itsuhyko Ito thực hiện tại phòng thí nghiệm Đại học

Kyoto (Ito, 1966,1967)

Nhân giống qua nuôi cấy chồi đỉnh: Nhân giống Dendrobium đầu tiên được

thực hiện tại Đại học Hawaii (Sagawa và Choji, 1967; Kim và cs, 1970) qua nuôi cấychồi đỉnh Lim-Ho (1981) nuôi cấy thành công tách rời Gandawijaja (1980) nuôi cấy

chồi đỉnh Dendrobium phalaenopsis Fernando (1979) nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Dendrobium caesar Lip Singh (1976) nuôi cấy chồi đỉnh Dendrobium Ng Eng

Cheo Soediono (1983b) nuôi cấy chồi đỉnh Dendrobium jaquelyn Thomas ‘White’.

Nhân giống qua nuôi cấy chồi bất định: Khaw và cs (1978a, 1978b) nuôi cấy chồi bất định Dendrobium Khaw và Ong (1974) nuôi cấy chồi bất định Aranda và

Dendrobium Alice trên môi trường VW Kukulczanka và Wojciechowska (1983)

nuôi cấy chồi bất định Dendrobium antennatum và Dendrobium phalaenopsis.

Nhân giống Dendrobium Joannie Ostenhault qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng:

Vasundhara (1990) nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tách rời trên môi trường lỏng VW có

bổ sung 15% nước dừa, đặt trong tối 48h, sau đó đưa ra sáng, tạo PLB PLB đượccấy chuyển, nhân sinh khối và tái sinh thành chồi trên môi trường bán rắn VW có

bổ sung 15% nước dừa

Nhân giống Dendrobium qua nuôi cấy đốt thân: Arditti và cs (1973), Mosich

và cs (1973, 1974a,b) nuôi cấy đốt thân trên môi trường Knop, chồi xuất hiện sau

45 ngày nuôi cấy, chồi được tách rời và nuôi cấy ra rễ

Nhân giống Dendrobium crumenatum qua nuôi cấy mô lá: Phương pháp này

được được trường ĐH Quốc Gia Singapore phát triển (Manorama và cs, 1986)

Gieo hạt Dendrobium crumenatum in itro, chồi tái sinh từ hạt tách lấy lá non Lá

non được cắt thành mảnh mỏng và nuôi cấy trong môi trường lỏng VW (lắc 80rpm)

có bổ sung 2,4D (5mg/l), NAA (5mg/l), BA (2mg/l) Mô sẹo hình thành sau 40ngày nuôi cấy và tạo PLB sau 3 tháng nuôi cấy

Nhân giống Dendrobium moschatum qua nuôi cấy lát mỏng thân:Kanjilal và

cs (1999) nuôi cấy lát mỏng thân (dày 1-1,5mm) của chồi từ hạt in vitro trên môitrường lỏng KnudsonC (lắc 80-120rpm) có bổ sung 15% nước dừa, 2mg/l NAA và3mg/l BA tạo PLB Nuôi cấy tăng sinh và tái sinh PLB trên cùng môi trường bán rắn

Nhân giống Dendrobium sonia: Prasad và cs (2001) đã nuôi cấy chồi đỉnh

trên môi trường MS có bổ sung 1mg/l NAA và 1mg/l BA hình thành cụm chồi sau

25 ngày nuôi cấy, với 11 chồi/mẫu

Nghiên cứu sự tạo mô sẹo trên Dendrobium cho thấy: mô sẹo sinh trưởng

chậm, dễ bị hoại tử trong quá trình nuôi cấy được ghi nhận (Chang và Chang 1998;Lin và cs, 2000; Roy và Banerjee, 2001) Hơn nữa môi trường nuôi cấy tạo mô sẹo

có bổ sung Auxin, cytokinin, nước dừa cho kết quả khả quan (Yam và cs, 1991,Arditti và Ernst 1993) và duy trì mô sẹo (Ishii và cs, 1998; Lin và cs, 200; Chen vàChang 2000; Huan và cs, 2004) Tuy nhiên nuôi cấy kéo dài trong môi trường cóchất kích thích sinh trưởng dẫn đến biến tính tế bào soma (Vazquez, 2001) và cầnđiều khiển Auxin và xytokinin thích hợp trong tái sinh mô sẹo hình thành chồi vàPLB (Roy và cs, 2007)

Chung và cs (2007) thành công trong nuôi cấy phát sinh phôi vô tính trực

tiếp từ lá giống hoa lan Dendrobium Chiengmai Pink đã nghiên cứu ảnh hưởng của

4 loại auxin (2,4D; NAA; IBA; IAA) và 5 loại cytokinin (Ki, BA, 2ip, TDZ, zeatin)trên môi trường 1/2MS đến sự tạo mô sẹo trực tiếp ghi nhận auxin không ảnh hưởngđến sự hình thành phôi vô tính trong tối và ngoài sáng sau 60 ngày nuôi cấy; phôiphát sinh tốt với 1mg/l TDZ với 5-25% mẫu nuôi cấy tạo phôi và đạt 33,6phôi/mẫu; phôi thứ cấp phát sinh trên vết cắt bản lá và có tần suất tạo phôi cao đểtrong tối; NAA (0-0,1-1mg/l) kết hợp TDZ (0-0,3-3mg/l) nâng cao hiệu suất thànhphôi; chồi tái sinh từ phôi dễ dàng trên môi trường 1/2MS không chất kích thíchsinh trưởngvà có tỷ lệ sống cao khi thuần hóa

Roy và cs (2007) đã thành công trong nghiên cứu nhân giống Dendrobium qua con đường nuôi cấy tạo mô sẹo và tái sinh PLB Dendrobium chrysotoxum Lindl.

Trên môi trường MS, tần suất tạo mô sẹo cao với µM TDZ hay BA; mô sẹo tạo PLB

và chưa thấy xuất hiện biến tính tế bào soma sau 18 tháng nuôi cấy trên môi trườngkhông bổ sung chất kích thích sinh trưởng; tuy nhiên sự hình thành PLB phụ thuộc

nhiều vào tỷ lệ cytikinin và auxin và kỹ thuật nuôi cấy, BA kích thích sinh trưởng

mô sẹo và tăng sinh PLB; TDZ gây hoại tử mô sẹo, NAA không tác động mạnh lênquá trình tạo mô sẹo nhưng ảnh hưởng đến quá trình cấy truyền mô sẹo; hệ số tăngsinh mô sẹo khi bổ sung 0,5mg/l NAA là 69 lần sau 3 tháng nuôi cấy; tái sinh sẹo đạthiệu quả cao nhất 133 PLB/100mg mô sẹo với môi trường bổ sung 1µM NAA, sự táisinh và hình thành PLB PLB phụ thuộc vào loại và nồng độ cytokinin sử dụng

PLB Dendrobium được sử dụng làm nguyên liệu nuôi cấy chuyển gen trong

công tác tạo giống mới (Kuehnle và Sugii, 1992; Chia và cs, 1994; Tee và cs, 2003;Janna và cs, 2006)

Khi gieo hạt một số loàiDendobium sp Luan và cs (2006) đã bổ sung 0,5mg/

l NAA kích thích sự nảy mầm và phát sinh protocorm khi gieo hạt lan trên nền môitrường MS

Anjum S, (2006) nghiên cứu trên lan Dendobium malones đã tái sinh

protocorm từ mẫu lá trên môi trường MS + 1,0mg/l Kinetin + 0,5mg/l NAA vàprotocorm sau khi được hình thành được cấy chuyển lên môi trường MS cơ bản bổsung 2,0mg/l BAP để phát sinh hình thái và thu được số lượng protocorm nhiều nhất

2.2.2 Tình hình nuôi cấy mô lan Hoàng Thảo ở Việt Nam.

 Các nghiên cứu nhân giống lan Hoàng Thảo nói chung

Chi Dendrobium (Lan Hoàng Thảo, Đăng lan), thuộc họ thực vật

Orchidacea, là một chi hoa rất lớn bao gồm trên 1500 loài, sinh sống tự nhiên trongmột khu vực trải rộng từ Triều Tiên, Nhật xuống Mã Lai, Indonesia, đến Úc và NewZealand

Giáo sư Tôn Thất Trình đã nhận xét về 'tiến bộ' của Thái Lan trong việc khaithác khả năng kinh tế của Lan Hoàng thảo như sau : ' mỗi lần được ghé Thái Lanxem triển lãm hoa lan và thi xe hoa, kết toàn hoa lan ngắm các phong lanDendrobium spp (Giả hạc, Thanh Hoàng, Ngọc Điểm, Ngọc Vạn, Kim Điểm, Nhấtđiểm Hồng ) Thái Lan tuyển chọn, lai giống hay ngoại nhập, mới thấy Thái Lantiến bộ quá nhiều, biến Dendrobium thành một tông chi lan, 'quốc hoa', ít nhất làtrên phương diện phổ biến thương mại quốc tế '

Hình 1 Lan Thạch Hộc

Tại Việt Nam, theo nhà nghiên cứu Lan Bùi Xuân Đáng, hiện có 133 giốngDendrobium (12-2003) Trong sách ' Tra cứu Tên cây cỏ Việt Nam' từ trang 206đến 210, GS Võ văn Chi đã liệt kê được 104 loài

(Về vấn đề định danh , do việc tên gọi các loải lan tại VN thiếu sự đồng nhất

và khó chính xác, Ông Bùi Xuân Đáng đề nghị cần kèm theo tên khoa học của loài

lan Chi Dendrobium được đề nghị là Lan Hoàng thảo, Đăng lan, chi Flickingeria là

Thạch hộc, trong khi đó, GS Chi cũng dùng tên Thạch hộc cho đa số các loài

Dendrobium)

Theo tác giả Trần Văn Minh, Nguyễn Văn Uyển (2001) kết luận MS là môi

trường nuôi cấy cơ bản thích hợpcho nhân giống lan Dendrobium in vitro, 1mg/l

BA+ 0,1mg/l IBA là tổ hợp chất điều tiết sinh trưởng thích hợp cho nhân protocormchi lan này Hàm lượng nước dừa 15% là chất hữu cơ bổ sung hữu hiệu nâng cao

hiệu quả phát sinh chồi trong quá trình nhân giống hoa lan Dendrobium Môi trường

MS + 0,1mg/l BA + 20%ND là môi trường tổ hợp các chất điều tiết sinh trưởng vàchất hữu cơ bổ sung đạt hiệu quả cao trong tái sinh chồi và chiều cao của chồi lan

Dendrobium in vitro

Theo Trịnh Cẩm Tú, Bùi Trang Việt (2006) sự ra hoa của Dendrobium sp.

liên quan đến sự chuyển tiếp mô phân sinh tạo lá và thân sang mô phân sinh tạohoa Mô phân sinh hoa tự là vị trí phát sinh cơ quan liên tục với một vùng nhỏ các tếbào gốc đa năng Đời sống và hoạt động của mô phân sinh hoa tự liên quan đến số

nụ hoa trên hoa tự được quan sát bằng cách sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô phân sinhhoa tự trên môi trường MA có bổ sung zeatin 1mg/l, AIA 0,5mg/l và GA3 1mg/l.Với BA 5mg/l, mô phân sinh hoa tự của pháthoa tạo cụm chồi dinh dưỡng thay vìtiếp tục tạo phát hoa

Theo Vũ Ngọc Phượng, Thái Xuân Du (2007) có thể sử dụng ánh sáng tựnhiên như một giải pháp tiết kiệm điện máy lạnh và đèn chiếu sáng để nuôi cấy

phong lan Dendrobium Dendrobium có tốc độ lớn nhanh và khi sử dụng tinh bột

thay cho đường tỷ lệ nhiễm giảm Lượng agar dùng làm đông môi trường giảm đi.Trong điều kiện ánh sáng tự nhiên chiếu mạnh cây có sắc tố tím đỏ Kết quả nghiêncứu cho thấy ở môi trường ánh sáng tự nhiên việc sử dụng carbohydrat ở dạng tinhbột tốt hơn so với dùng đường Kể từ ngày 30 trở đi bắt đầu ghi nhận được sự khácbiệt với cây sống trên môi trường chứa đường Trong vòng 60 ngày, thời gian nuôicấy càng kéo dài về sau thì sự vượt trội càng rõ rệt

Bùi Thị Tường Thu, Trần Văn Minh (2007) sử dụng môi trường VW bổ sung

BA, NAA, kinetin, TDZ, nước dừa, đường sucrose nuôi cấy phát sinh và tăng sinh

tế bào soma, phát sinh và tái sinh phôi giả (PLB) của cây hoa lanDendrobium.

Nguyễn Thị Mỹ Duyên, 2006 đã đưa ra qui trình vi nhân giống lan

Dendrobium anosmum Quả lan sau khi được tự thụ 4 tháng, khử trùng và gieo cấy

hạt vào môi trường sau 3 tháng gieo cấy tỷ lệ nảy mầm ≥ 85% trên môi trường MS+ 1 mg/l NAA và môi trường MS + 1 mg/l BA + 0,2 mg/l NAA Chồi lanDendrobium anosmum phát triển tốt nhất trên môi trường MS + 2mg/l BA, ở thờigian 3 tháng sau khi cấy đạt HSN chồi 3,17lần, chồi cao 20,6 mm Chồi lan tạo rễtốt nhất trên môi trường MS + 1 mg/l NAA Sau 3,5 tháng tạo được cây hoàn chỉnh,đạt tiêu chuẩn để đưa ra ngoài vườn ươm

Qui trình vi nhân giống lan Dendrobium mini thì chồi lan phát triển tốt trên

môi trường MS có bổ sung 1 mg/l BA Và sau 2 tháng nhân chồi đạt HSN là 3,8chồi, chồi cao 1,26cm Môi trường MS/2 + 0,2 mg/l NAA cho kết quả ra rễ tốt vàsau 2 tháng chồi lan tạorễ hình thành cây hoàn chỉnh để đưa ra vườn ươm Khi thíchứng cây ra vườn ươm trên nhiều loại giá thể khác nhau thì thấy rằng đối với lanDendrobium mini trong giai đoạn đầu nuôi trồng (từ cây mới ra mô đến khi câyđược 7,5 tháng tuổi) thì giá thể thích hợp nhất cho cây là dớn và dừa miếng

Nguyễn Văn Song và cs, 2011 đề xuất khi nhân in vitro lan Dendrobium

chrysotoxum thì nguyên liệu là quả lan 3 tháng tuổi Môi trường thích hợp cho nảy

mầm và phát sinh protocorm là môi trường MS + 20 g/l sucrose, 8 g/l agar, 15%nước dừa và 2,0 mg/l BAP Môi trường nhân nhanh protocorm tốt nhất là MS + 20g/l sucrose, 8 g/l agar, 15% nước dừa và 2,0 mg/l BAP Môi trường MS + có 30 g/lsucrose, 8 g/l agar, 1g/l than hoạt tính, 15% nước dừa, 2,0 mg/l BAP và 1,0 mg/lNAA thích hợp nhất cho tái sinh chồi từ protocorm và sinh trưởng của chồi in vitro.Môi trường MS + 20 g/l sucrose, 8 g/l agar, 15% nước dừa và 1,0 mg/l NAA làthích hợp cho tạo rễ của chồi in vitro

 Các nghiên cứu nhân giống lan Hoàng Thảo làm thuốc

Nguyễn Thị Sơn, 2012 đã nhân giống loài lan Dendrobium nobile Lindl trên

hệ thống Bioreactor Plantima với môi trường MS + 20g đường + 60g chuối chín/lítmôi trường đạt hệ số nhân chồi 5,2 lần với các thông số kỹ thuật pH dung dich 5,7 –5,9; chu ký ngập chìm là 5 phút ngập, 30 phút nghỉ

Vũ Ngọc Lan và cs, 2013 Khi nhân giống in vitro loài lan bản địa D.nobile

Lindl Tác giả đã đưa ra kỹ thuật nuôi cấy lỏng lắc nút bông và nuôi cấy lỏng lắcthoáng khí đã tăng HSN protocorm đạt 1,9 và 2,3 lần so với đối chứng Nuôi cấyđặc, màng lọc thoáng khí làm giảm 25% lượng saccharose bổ sung vào môi trườngnuôi cấy và tăng HSN protocorm lên gấp 1,4 lần so với nuôi cấy kinh điển Nhânnhanh cụm chồi bằng kỹ thuật bioreactor giảm thời gian nhân giống và cải thiệnchất lượng chồi

 Các nghiên cứu nhân giống lan Thạch hộc thiết bì

Cây lan hầu như ít được nhắc đến trong các sách vở nghiên cứu, nuôi trồng

lan và chỉ được mô tả trong các bài viết y dược tại Trung Hoa D officinale

Kimura&Migo hiện được xếp vào loài được bảo vệ tại Trung Hoa được trồng và

thu hoạch hạn chế tại những trại lan ở Triết giang, Quảng Tây, Quế châu, Vân Nam

và Tây tạng Theo Ủy Ban Chế dược thư = Pharmacopoeia Commission of PRC,

2010 thì D officinale được xếp vào loại cây thuốc giúp đề kháng ung thư và tăng

tuổi thọ

Hình 2 Lan Thạch Hộc

Theo PRC Pharmacopoeia thì trong D officinale có dendrobium

polysaccharides (23 %), alkaloids (0.02-0.04 %) amino-acids (135mg/ g cây khô),nhiều kim loại như Sắt (292 microg/g), Kẽm (12 mcg/g), Manganese (52mcg/g),Đồng (3.6 mcg/g)

Những nghiên cứu khoa học ghi nhận D officinale và polysaccharides trong

cây cải thiện, tăng cường sức đề kháng tế bào khi thử trên chuột (Natural ProductsCommunications Số 6-2011), hoạt tính chống oxy-hóa của các polysaccharides tổngcộng và polysaccharide tinh chế DCPP3c-1 (trích từ môi trường cấy mô D.officinale) đã được chứng minh qua các thử nghiệm 'in vitro'(Chinese Traditional

Patent Medicine Số 29-2007) Dịch chiết từ D candium (D officinale) có hoạt tính

làm hạ đường khi thử trên chuột bị gây tăng đường trong máu bằng adrenaline vàbằng streptozotocin do cách tác động kích thích sự bài tiết insulin từ tế bào beta,đồng thời ngăn sự bài tiết glucagon từ tế bào alpha, ngoài ra còn làm giảm sự phânhủy của glycogen trong cơ thể, làm tăng tổng hợp glycogen trong gan (Trung Quốc

Trung dược Tạp chí Số 24-2009) D officinale là một trong 5 dược thảo có chứa

chrysotoxene, erianin và confusarin là những chất có hoạt tính diệt bào khi thử (invivo và in vitro) trên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau (Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica Số 26-2006

Li và cs, 2012 đã đề xuất nhân giống vô tình cây lan Thạch hộc Thiết bì bằngnuôi cấy mô từ kei ki khử trùng và cấy vào môi trường MS+0,1mg/l BA +0,02mg/lNAA để khởi động mẫu, sau đó nhân nhanh chồi trên môi trường MS MS+2,5mg/l

BA +0,05mg/l NAA sau đó tạo cây hoàn chỉnh trong môi trường 1/2MS +1mg/lIBA + 1g/l Than hoạt tính trong điều kiện nuôi cấy là pH=5,8; nhiệt độ 25±2oC,chiếu sáng 12h/ ngày, cường độ chiếu sáng 2000lux

Qua phần tổng quan có thể rút ra một số nhận xét: Lan Thiết bì Thạch hộcđang được thị trường ưa chuộng do nó vừa có đặc tính làm thuốc vừa có giá trị làmcây cảnh và hoa đẹp Việc phát triển sản xuất hoa lan Thạch hộc đang được quantâm phát triển ở Trung Quốc và Đài Loan Tuy nhiên việc nhân giống lan Thạch hộcThiết bì ở Việt nam là hoàn toàn mới Trước bối cảnh ấy việc thực hiện đề tài này sẽđáp ứng yêu cầu bức xúc của thực tiễn sản xuất cũng như sẽ có nhiều đóng góp mới

về mặt khoa học của lĩnh vực nhân dòng vô tính thực vật in vitro nói chung và bảo

tồn phát triểnloài lan thuốc đặc hữu Dendrobium officinale Kimura et Migo (Thạch

hộc thiết bì) nói riêng

II VẬT LIỆU NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

 Đối tượng: Loài lan Hoàng thảo

_Tên la tinh: Dendrobium officinale Kimura et Migo

_Tên Việt Nam: Thạch Hộc Thiết Bì

 Vật liệu

Mẫu thí nghiệm: quả lan và đoạn thân mang mắt ngủ loài lan Dendrobium

officinale Kimura et Migo do viện Sinh Học Nông Nghiệp thu thập từ Triết Giang

Trung Quốc

Môi trường nuôi cấy: Vacxin &Went (1949), Murashige & Shoog (1962),Hyponex, Robert Ernst (1979)

Giá thể: bột dừa, vỏ thông, vỏ lạc, khí canh

 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

_ Thời gian: 12/2013- 6/2014

_ Địa điểm: Viện sinh học nông nghiệp_ Đại học Nông Nghiệp Hà Nội

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.2.1.Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Nghiên cứu nhân giống lan Dendrobium officinale Kimura et

Migo từ hạt

Thí nghiệm 1 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền đến giai đoạn khởi

động mẫu tạo vật liệu ban đầu trong gieo hạt lan Dendrobium officinale Kimura et Migo.

Thí nghiệm 2 Nghiên cứu ảnhhưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng

nhân nhanh protocorm lan Dendrobium officinale Kimura et Migo.

Thí nghiệm 3 Nghiên cứu ảnhhưởng củaKinetin đến khả năng nhân nhanh

protocorm lan Dendrobium officinale Kimura et Migo.

Thí nghiệm 4 Nghiên cứu ảnhhưởng nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh

protocorm lan Dendrobium officinale Kimura et Migo.

Nội dung 2: Nghiên cứu nhân giống vô tính lan Dendrobium officinale

Kimura et Migo thông qua nuôi cấy đoạn thân

Thí nghiệm 5 Nghiên cứu ảnhhưởng nồng độ BA kết hợp αNAA đến sự

phát sinh hình thái và hệ số nhân của đoạn thân mang mắt ngủ lan Dendrobium

officinale Kimura et Migo.

Thí nghiệm 6 Nghiên cứu ảnhhưởng nồng độ BA kết hợp IBA đến sự phát

sinh hình thái và hệ số nhân của đoạn thân mang mắt ngủ lan Dendrobium

officinale Kimura et Migo.

Nội dung 3: Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh

Thí nghiệm 7 Nghiên cứu ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy đến khả

năng sinh rễ chồi lan Dendrobium officinale Kimura et Migo.

Thí nghiệm 8 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết αNAA đến khả năng

sinh rễ của chồi lan Dendrobium officinale Kimura et Migo.

Thí nghiệm 9 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết IAA đến khả năng

sinh rễ của chồi lan Dendrobium officinale Kimura et Migo.

Nội dung 4: Nghiên cứu đưa cây in vitro ra vườm ươm

Thí nghiệm 10 Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến sinh trưởng của cây

in vitroDendrobium officinale Kimura et Migo ngoài vườn ươm

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nuôi cấy mô quy chuẩn hiện hành được áp dụng để nghiên cứunhân giống in vitro Các thí nghiệm thiết kế theo phương pháp khối ngẫu nhiênhoàn chỉnh (RCB), mỗi công thức tiến hành 3 lần lặp lại

Sử dụng hệ thống khí canh của Viện Sinhhọc Nông nghiệp - Trường Đại họcNông nghiệpHà Nội dựa trên mô hình hệ thống khí canh của Richard(AeroponicsVersus Bed and Hydoponic Propagation, Florists, Review) Thiết bịhoạt động theo nguyên tắc dung dịch dinh dưỡng được phun thẳng vào rễ cây dướidạng sương theo chế độ ngắt quãng Dung dịch dinh dưỡng gốc là dung dịch trồngthủy canh của Trung tâm Nghiên cứu phát triển rau châu Á đã được Viện Sinh họcNông nghiệp - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội nghiên cứu cải tiến thành 3loại dinh dưỡng khác nhau (I, II, III), pH: 5,5 - 6,0 và EC: 400 - 500 µs/cm

2.3.1Phương pháp nghiên cứu nội dung 1:

Nghiên cứu nhân giống lan Dendrobium officinale Kimura et Migo từ hạt

Thí nghiệm 1 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền đến giai đoạn khởi

động mẫu tạo vật liệu ban đầu trong gieo hạt loài lan Dendrobium officinale Kimura

et Migo

Tiến hành bố trí thí nghiệm trên 3 loại môi trường MS,VW vàHyponex (H)

CT1: Môi trường MS + 1g pepton/lít môi trường + 10g sacaroza/lít môi

trường + 30g khoai tây/lít môi trường + 15% nước dừa

CT2: Môi trường Hyponex + 1g pepton/lít môi trường + 10g sacaroza/lít môi

trường + 30g khoai tây/lít môi trường + 15% nước dừa

CT3: Môi trường VW+ 1g pepton/lít môi trường + 10g sacaroza/lít môi

trường + 30g khoai tây/lít môi trường + 15% nước dừa

Chọn các quả lan đều nhau Cấy mẫu vào 3 công thức, mỗi công thức 5 bình,một quả cấy vào 5 bình, thí nghiệm 3 lần lặp lại

Các chỉ tiêu theo dõi : tỷ lệ mẫu phát sinh protocorm, màu sắc protocorm

Thí nghiệm 2 Nghiên cứu ảnhhưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng

nhân nhanh protocorm loài lan Dendrobium officinale Kimura et Migo.

Tiến hành thí nghiệm trên 5 loại môi trường sau:

CT1: Môi trường MS + 20g sacaroza/lít môi trường + 6g agar/lít môi trường

Các chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu sống và tạo chồi, số lượng chồi/bình, hệ sốnhân chồi, màu sắc.

Thí nghiệm 3 Nghiên cứu ảnhhưởng củaKinetin đến khả năng nhân nhanh

protocorm lan Dendrobium officinale Kimura et Migo.

CT1: Môi trường MS + 20g sacaroza/lít môi trường + 6g agar/lít môi trường

+ 10% ND (ĐC)

CT2: ĐC+ 0,2 ppmKi/lít môi trường

CT3: ĐC + 0,5 ppmKi/lít môi trường

CT4:ĐC + 0,7 ppmKi/lít môi trường

CT5: ĐC + 1,0 ppmKi/lít môi trường

Thí nghiệm được tiến hành cấy vào mỗi bình 5 cụm, mỗi cụm mang 10protocorm Mỗi công thức cấy vào 5 bình, thí nghiệm3 lần nhắc lại

Các chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu sống và tạo chồi, số lượng chồi/bình , hệ sốnhân chồi, hình thái mẫu

Thí nghiệm 4 Nghiên cứu ảnhhưởng nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh

protocorm lan Dendrobium officinale Kimura et Migo.

CT1: Môi trường MS + 20g sacaroza/lít môi trường + 6g agar/lít môi trường

+ 10% ND (ĐC)

CT2:ĐC+ 0,2 ppmBA/lít môi trường

CT3: ĐC +0,5 ppmBA/lít môi trường

CT4: ĐC +0,7 ppmBA/lít môi trường

CT5:ĐC + 1,0 ppmBA/lít môi trường

Tiến hành cấy vào mỗi bình 5 cụm, mỗi cụm 10 protocorm Mỗi công thứccấy vào 5 bình, thí nghiệm3 lần nhắc lại

Các chỉ tiêu theo dõi:,số lượng chồi/ bình, hệ số nhân chồi, màu sắc, kíchthước chồi

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu nội dung 2:

Nghiên cứu nhân giống vô tính lan Dendrobium officinale Kimura et Migo thông qua nuôi cấy đoạn thân

Hình 3 Đoạn thân mang mắt ngủ Thí nghiệm 5 Nghiên cứu ảnhhưởng nồng độ BA kết hợp αNAA đến sự

phát sinh hình thái và hệ số nhân của đoạn thân mang mắt ngủ lan Dendrobium

officinale Kimura et Migo.

CT1: Môi trường ½ MS + 20g sacaroza/lít môi trường + 6g agar/lít môi

trường + 10% ND (ĐC)

CT2: ĐC+0,2 ppmBA/lít môi trường+ 0,05 ppmαNAA/lít môi trường

CT3: ĐC+ 0,5ppmBA/lít môi trường + 0,05 ppmαNAA/lít môi trường

CT4:ĐC+ 0,7ppmBA/lít môi trường + 0,05 ppmαNAA/lít môi trường

CT5: ĐC + 1,0ppmBA/lít môi trường + 0,05 ppmαNAA/lít môi trường CT6: ĐC + 0,2 ppmBA/lít môi trường + 0,1ppmαNAA/lít môi trường

CT7: ĐC+ 0,5ppmBA/lít môi trường + 0,1ppmαNAA/lít môi trường

CT8: ĐC + 0,7ppmBA/lít môi trường + 0,1ppmαNAA/lít môi trường

CT9: ĐC + 1,0ppmBA/lít môi trường + 0,1ppmαNAA/lít môi trường

Tiến hành cấy vào mỗi bình 5 đoạn thân (mỗi đoạn thân mang 1 mắt ngủ),mỗi công thức cấy 5 bình, thí nghiệm 3 lần lặp lại

Các chỉ tiêu theo dõi: hệ số nhân chồi, số chồi/đoạn thân, chiều cao chồi, sốlá/chồi, màu sắc , kích thước chồi

Thí nghiệm 6 Nghiên cứu ảnhhưởng nồng độ BA kết hợp IBA đến sự phát

sinh hình thái và hệ số nhân của đoạn thân mang mắt ngủ lan Dendrobium

officinale Kimura et Migo.

CT1: Môi trường ½ MS + 20g sacaroza/lít môi trường + 6g agar/lít môi

trường + 10% ND (ĐC)

CT2: ĐC + 0,2 ppmBA/lít môi trường + 0,05 ppmIBA/lít môi trường

CT3: ĐC + 0,5 ppmBA/lít môi trường + 0,05 ppmIBA/lít môi trường

CT4: ĐC+ 0,7 ppmBA/lít môi trường + 0,05 ppmIBA/lít môi trường

CT5: ĐC+ 1,0 ppmBA/lít môi trường + 0,05 ppmIBA/lít môi trường

CT6: ĐC+ 0,2 ppmBA/lít môi trường + 0,1ppmIBA/lít môi trường

CT7: ĐC + 0,5 ppmBA/lít môi trường + 0,1ppmIBA/lít môi trường

CT8: ĐC + 0,7 ppmBA/lít môi trường + 0,1ppmIBA/lít môi trường

CT9: ĐC + 1,0 ppmBA/lít môi trường + 0,1ppmIBA/lít môi trường

Tiến hành cấy vào mỗi bình 5 đoạn thân (mỗi đoạn thân mang 1 mắt ngủ),mỗi công thức cấy 5 bình, thí nghiệm 3 lần lặp lại

Các chỉ tiêu theo dõi: hệ số nhân chồi, số chồi/đoạn thân, chiều cao chồi, sốlá/chồi, màu sắc kích thước chồi

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu nội dung 3: Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh

Thí nghiệm 7 Nghiên cứu ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy đến khả

năng sinh rễ chồi lan Dendrobium officinale Kimura et Migo.

CT1: Môi trường MS + 10g sacaroza/lít môi trường + 6g agar/lít môi trường

+ 0,3g than hoạt tính (THT) /lít môi trường

CT2: Môi trường ½ MS + 10g sacaroza/lít môi trường + 6g agar/lít môi

trường + 0,3g THT/lít môi trường

CT3: Môi trường VW + 10g sacaroza/lít môi trường + 6g agar/lít môi trường

+ 0,3g THT/lít môi trường

CT4: Môi trường ½ VW +10g sacaroza/lít môi trường + 6g agar/lít môi

trường + 0,3g THT/lít môi trường

CT5: Môi trường RE + 10g sacaroza/lít môi trường + 6g agar/lít môi

trường+ 0,3g THT/lít môi trường

CT6: Môi trường ½ RE + 10g sacaroza/lít môi trường + 6g agar/lít môi

trường + 0,3g THT/lít môi trường

CT7: Môi trường H + 10g sacaroza/lít môi trường + 6g agar/lít môi trường +

0,3g THT/lít môi trường

Thí nghiệm được tiến hành cấy với mỗi công thức 5 bình, mỗi bình 5 chồi,thí nghiệm 3 lần lặp lại.

Các chỉ tiêu theo dõi:số rễ, chiều dài rễ

Thí nghiệm 8 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết IAA đến khả năng

sinh rễ của chồi lan Dendrobium officinale Kimura et Migo.

CT1: Môi trường RE + 10g sacaroza/lít môi trường + 6g agar/lít môi trường.

+ 0,3g THT/lít môi trường (ĐC)

CT2: ĐC + 0,2 ppm IAA/lít môi trường

CT3: ĐC + 0,5 ppm IAA/lít môi trường

CT4: ĐC + 0,7 ppm IAA/lít môi trường

CT5: ĐC + 1,0 ppm IAA/lít môi trường

Thí nghiệm 7, 8 được tiến hành cấy với mỗi công thức 3 bình, mỗi bình 5chồi, thí nghiệm 3 lần lặp lại

Các chỉ tiêu theo dõi: số rễ/chồi, chiều dài rễ

2.3.4 Phương pháp nghiên cứu nội dung 4:

Nghiên cứu đưa cây in vitro ra vườn ươm

Thí nghiệm 9 Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến sinh trưởng của cây in

vitroDendrobium officinale Kimura et Migo ngoài vườn ươm.

+ CT1: Trồng trên giá thể mùn dừa: Giá thể được phủ lên trên mặt rổ nhựa,

dày 3cm Cây con được trồng thẳng đứng trên bề mặt rổ Ngày tưới 2 lần bằng cáchphun sương trên bề mặt trồng

+ CT2: Trồng trên giá thể vỏ lạc: Vỏ lạc đập dập cho vào các rổ nhựa có lót

lưới, cây con được đặt vào giá thể xung quanh gốc phủ một lớp giá thể mỏng sao cho câyđứng thẳng và hở gốc Ngày tưới 2 lần bằng cách phun sương trên bề mặt trồng

+ CT3: Trồng trên vỏ thông: Giá thể là các mảnh vỏ thông có kích thước 2,0 x

1,0 x 0,2 cm được đặt trong các rổ nhựa và trồng cây con vào đó sao cho phần gốc

rễ cây con được bao bọc bởi mảnh vỏ thông và cây con đứng thẳng Ngày tưới 2 lầnbằng cách phun sương trên bề mặt giá thể trồng

+ CT4: Hệ thống khí canh: Cây con được trồng vào các khay xốp đã đục lỗ

sẵn sao cho cây có thể thả bộ rễ xuống phía dưới bề mặt xốp Trong khay xốp của

hệ thống khí canh có các đầu phun dung dịch nuôi dưỡng để cây có thể hấp thụ Banngày phun dung dịch 2 lần

Thí nghiệm tiến hành trên 4 công thức; mỗi công thức trồng 3 rổ, mỗi rổtrồng 30 cây, chiều cao 5cm, 5 lá, 4 rễ, cây cách cây 3cm, hàng cách hàng 4cm Cáccây được tưới giữ ẩm hàng ngày Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu chết

2.4 Điều kiện thí nghiệm:

 Nhóm thí nghiệm ở vườn ươm

Các thí nghiệm được tiến hành trong nhà nuôi trồng lan có mái che của Việnsinh học Nông Nghiệp - Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội

2.5 Các chỉ tiêu theo dõi

2.5.1 Các chỉ tiêu theo dõi trong nuôi cấy in vitro.

Tỷ lệ mẫu nhiễm = (∑ mẫu nhiễm /∑ mẫu cấy ) * 100%

Tỷ lệ mẫu sống = (∑ mẫu sống /∑ mẫu cấy ) * 100%

Tỷ lệ mẫu tạo protocorm = (Số mẫu hình thành protocorm/∑ mẫu cấy ) * 100%HSN protocorm (lần) = (∑protocorm sau 8 tuần nuôi cấy/∑protocorm ban đầu) * 100%HSN chồi (lần) = (∑ lượng chồi sau 8 tuần nuôi cấy/∑ lượng chồi ban đầu) * 100%Chiều cao cây (cm) = Khoảng cách từ gốc rễ đến đầu mút lá

Chiều dài rễ (cm) = Khoảng cách từ gốc rễ đến đầu mút rễ

Số lá = ∑ lá trên cây thí nghiệm

Số rễ = ∑ rễ trên cây thí nghiệm

2.5.2 Các chỉ tiêu theo dõi trong vườn ươm

Tỷ lệ cây sống % = (∑ cây sống /∑ số cây đưa ra trồng ngoài vườn ươm) * 100%

2.6 Xử lí số liệu:

Các số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm IRRISTART 5.0 và MS Excel

III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Nhân giống lan Dendrobium officinale Kimura et Migo từ hạt

3.1.1 Ảnh hưởng của môi trường nền đến giai đoạn khởi động mẫu tạo vật liệu ban đầu trong gieo hạt lan Dendrobium officinale Kimura et Migo

Hạt lan phát triển rất kém ngay khi quả đã chín, chúng phụ thuộc vào sựnhiễm nấm để nảy mầm và phát triển trong tự nhiên Phương pháp nuôi cấy khôngcộng sinh được phát triển nghiên cứu của Knudson (1922), hạt lan có thể nảy mầmtrên môi trường khoáng có đường Ở nhiều nước trên thế giới, phương thức nảymầm hạt lan in vitro là một phần quan trọng của trương trình bảo tồn và nhân giốngcác loài lan quý hiếm, cung cấp cây con cho chương trình phục hồi tái sinh rừng(McKendrick, 2000)

Nhiều công trình nghiên cứu trong nước và thế giới trên đã công bố kết quảnghiên cứu khử trùng mẫu quả của các giống lan (Nguyễn Quang Thạch và cộng sự,2004; Phạm Thị Kim Hạnh và cộng sự, 2009) Kế thừa các kết quả đó chúng tôi tiếnhành gieo quả lan theo 3 công thức môi trường nền MS, VW và Hyponex sau 8 tuầntheo dõi kết quả thu được ở bảng 4.1.1

Hình 4 : ảnh hưởng của môi trường nền VW, MS, H đến giai đoạn khởi tạo vật liệu ban đầu trong gieo hạt lan Dendrobium officinale Kimura et Migo

(sau 8 tuần nuôi cấy)

Bảng 4.1.1 Ảnh hưởng của môi trường nền đến giai đoạn khởi động mẫu tạo vật

liệu ban đầu trong gieo hạt lan Dendrobium officinale Kimura et Migo

(sau 8 tuần nuôi cấy)

Màu sắc protocorm

Màu sắc chồi

Ghi chú: +++ sắc xanh đậm, ++ sắc xanh, + xanh nhạt của mẫu

Qua bảng 4.1.1 cho ta thấy gieo hạt lan trên 3 loại môi trường (MS, VW vàH) sau thời gian 8 tuần nuôi cấy ở tất cả các công thứcđều phát sinh hình thái(100%) Trong đó, trên nền môi trường VW và MS hạt phát sinh protocorm lần lượtlà86,67% và 93,33% đồng thời xuất hiệnchồi là 13,33% và 6,67% Về hình thái thìmầu sắc củaprotocorm và chồi là tốt nhất trên môi trường nền VW tiếp đến là MS.Hạt được gieo trên nền môi trường H cho tỷ lệ hạt có màu xanh và tỷ lệ mẫu phátsinh chồi là thấp nhất Điều này chứng tỏ môi trường VW là môi trường thích hợpnhất cho sự nảy mầm của hạt lan

3.1.2 Ảnhhưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh protocorm loài lan Dendrobium officinale Kimura et Migo.

Hạt lan nảy mầm có thể sản xuất ra một khối tế bào chưa phân hoá rõ ràngđược gọi là protocorm Tất cả các protocorm này sẽ phát triển trong nhiều tuần, nhiềutháng thậm chí trong nhiều năm phụ thuộc từng loài cho đến khi đủ lớn để tạo chồi(McKendrick, 2000) Môi trường nuôi cấy cung cấp dinh dưỡng cần thiết cho mẫu cấy.Các nền môi trường khác nhau có chứa các thành phần dinh dưỡng với tỷ lệ khác nhau.Việc nghiên cứu xác định nền môi trường thích hợp cho nhân nhanh protocorm là rất cầnthiết Có rất nhiều loại môi trường khoáng dùng trong nuôi cấy mô nhưng trong đóchúng tôi tiến hành nghiên cứu trên các nền môi trường được cho là thích hợp với cácloài phong lan nói chung như: MS (Murashige & Shoog, 1962), VW (Vacin & Went,1949), ½MS, ½VW và Hyponex (H) Các cụm protocorm thu được khi nuôi cấy khởiđộng ở thí nghiệm trên chúng tôi chọn lưa và cấy vào mỗi bình 5 cụm, mỗi cụm 10protocorm Sau 8 tuần nuôi cấy, theo dõi chúng tôi thu được kết quả ở bảng 4.1.2