nghiên cứu xây dựng qui trình nhân nhanh in vitro giống lan hồ điệp nhập nội (phalaenopsis)

Trong số những loài hoa Lan được nuôi trồng chủ yếu ở nước ta, bên cạnh những loại hoa tương đối dễ chăm sóc như Mokara, Dendro, Lan vũ nữ… thì vẫn có những loài hoa Lan chỉ thích hợp v

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

Cùng với sự phát triển trong đời sống vật chất, đời sống tinh thần và nhu cầu thưởng thức cái đẹp của con người cũng không ngừng tăng lên Trong cuộc sống, hoa là một trong những vẻ đẹp đến từ thiên nhiên mà con người dễ dàng thưởng thức nhất, luôn là tâm điểm của mọi sự chú ý, nhất là vào những dịp lễ Tết và các hoạt động văn hoá Ngày nay, việc trồng hoa không chỉ mang ý nghĩa xã hội mà còn mang ý nghĩa lớn về mặt kinh tế, nhất

là xuất khẩu Vì vậy ngành sản xuất hoa đã và đang đóng vai trò quan trọng trong các ngành sản xuất nông nghiệp nói riêng và trong nền kinh tế nói chung Hoa mang lại lợi nhuận lớn cho những người tham gia sản xuất và kinh doanh Hoa góp phần mang lại vẻ đẹp cho cảnh quan, hệ sinh thái và môi trường sống của con người

Trong vườn hoa muôn màu muôn vẻ của thế giới tự nhiên, có lẽ hiếm

có loài hoa nào lại phong phú, tập hợp trong mình nhiều họ, nhiều chủng loại, màu sắc, dáng nét và giàu sức quyến rũ, mê hoặc con người một cách kỳ lạ cho bằng hoa Lan Hoa Lan không chỉ mang vẻ đẹp đài các, sang trọng nhưng

ấm áp, gần gũi mà nó còn chất chứa trong mình những giá trị tiềm ẩn, luôn mới lạ, luôn hấp dẫn và mời gọi lòng say mê, khám phá của những ai trót nặng lòng với loài hoa vương giả này Trong số những loài hoa Lan được nuôi trồng chủ yếu ở nước ta, bên cạnh những loại hoa tương đối dễ chăm sóc như

Mokara, Dendro, Lan vũ nữ… thì vẫn có những loài hoa Lan chỉ thích hợp

với một số khu vực địa lý nhất định mà cụ thể nhất là địa Lan, loài hoa chỉ có thể nuôi trồng trong điều kiện lí tưởng của Đà Lạt… Không quá kén chọn và hạn chế nơi trồng như địa Lan song Lan Hồ điệp cũng là một trong những giống Lan quý mà qui trình chăm sóc, thuần dưỡng cũng đòi hỏi lắm công phu, tâm huyết của người trồng

Lan Hồ Điệp là một loài Lan rất khó nhân giống, thường cho hệ số nhân thấp trong điều kiện vườn ươm Để có được số lượng lớn cây giống,

đồng đều, ổn định về mặt di truyền đáp ứng nhu cầu thị trường thật nan giải Trong những năm gần đây, công nghệ lai giống kết hợp gieo hạt trong ống nghiệm cho tỷ lệ nẩy mầm cao, chất lượng cây con tương đối ổn định Tuy nhiên nhân giống bằng phương pháp gieo hạt mang tính ngẫu nhiên không đảm bảo thu được cây có tính trạng như mong muốn

Do đó, việc nâng cao chất lượng giống và nhân giống chủ động bằng cách áp dụng công nghệ sinh học mới trong sản xuất đang là vấn đề quan trọng cho phát triển ngành sản xuất hoa Lan ở nước ta Từ thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài :

“ Nghiên cứu xây dựng qui trình nhân nhanh in vitro giống Lan Hồ Điệp nhập nội (Phalaenopsis)”

Với mục tiêu cụ thể là: Nghiên cứu quy trình nhân giống bằng phương pháp

in vitro nhằm cung cấp nhanh giống đã được tuyển chọn cho sản xuất, đồng

thời chủ động khâu giống cây vốn lâu nay phụ thuộc nguồn ngoại nhập

- Xây dựng qui trình kỹ thuật nhân giống Lan Hồ Điệp bằng in vitro

- Duy trì và nhân nhanh giống Lan Hồ Điệp để cung cấp giống tốt, khoẻ, sạch bệnh, cho sản xuất

PHẦN 2 TỔNG QUAN 2.1 Giá trị kinh tế của hoa Lan

2.1.1 Trên thế giới

Hoa Lan là một loài hoa rất đa dạng về kích thước, hình dáng, màu sắc, cấu trúc, số lượng và hương thơm Trong số các loại hoa thương phẩm lớn hiện nay, hoa Lan là một loài có triển vọng kinh tế hết sức cao Ngay từ năm

1957, James Shoemaker đã cho rằng “Nuôi trồng Lan sẽ không chỉ là một sở thích mà còn hướng tới trở thành một ngành công nghiệp” Và quả vậy, ngành trồng Lan đang ngày càng phát triển mạnh mẽ

Từ thời xưa cho đến nay, hoa Lan luôn được con người ngưỡng mộ và được xem như là nữ hoàng của các loài hoa, loài hoa vương giả hay vua của những loài cỏ cây có hoa Do có vẻ đẹp rực rỡ, quý phái, ngào ngạt hương thơm, thanh nhã cao sang và trước đây hoa Lan được xem là loài quý hiếm, nên thời gian trước thú chơi hoa Lan thường chỉ dành cho giới vua chúa, thượng lưu Ngày nay, thú chơi hoa Lan đã được nâng lên thành nghệ thuật, nghề trồng Lan đã được phát triển thành ngành công nghiệp có lợi nhuận cao

ở một số nước như Thái Lan, Đài Loan,… Hơn nữa, nhờ quá trình sưu tầm các loài hoa Lan đẹp, lạ mắt và các kỹ thuật lai tạo ra các hoa Lan mới tuyệt đẹp, nên số loài hoa Lan hiện nay trên thế giới có thể đã lên đến 100000 loài

Vì thế trong thời gian gần đây, trên thế giới cũng như ở Việt Nam ta, thú chơi hoa Lan đã trở thành thông dụng và có điều kiện hơn, không phân biệt địa vị, tuổi tác, hoàn cảnh kinh tế nữa, số người chơi và yêu chuộng hoa Lan ngày càng tăng nhanh, hay nói cách khác nhu cầu sử dụng các chủng loại hoa Lan

đã và đang tăng Hoa Lan hiện đang được trồng và kinh doanh với 03 kiểu dáng phổ biến trên thị trường: hoa cắt cành, cây đã thành thục trong chậu treo hay bám trên giá thể và cây Lan con từ 10-15cm

(http://dost.danang.gov.vn/default.php?Action=news_detail&idx=153)

Khu vực Đông Nam Á ngày nay hoa kiểng cũng phát triển rất mạnh; Singapore năm 1991 xuất khẩu đạt 13 triệu USD, nay đã đạt trên 20 triệu USD; Thái Lan năm 1991 đạt 80 triệu USD thì nay đã đưa doanh số xuất khẩu lên 200 triệu USD/năm Theo đánh giá của các nhà nghiên cứu về Lan, Thái Lan có hơn 1.000 giống hoa Lan, thậm chí Lan đã trở thành biểu tượng của vương quốc Tại Malaysia, chính phủ đã quy hoạch 300 ha ở bang Zohor và giao cho Hiệp hội hoa Lan tổ chức ở đây thành khu Trung tâm sản xuất Hoa kiểng xuất khẩu Ngành trồng hoa của Đài Loan cũng đang tăng nhanh tốc độ

15 – 20% Hiện nay, Đài Loan đã có diện tích trồng hoa là 10.172ha, đạt doanh thu hàng năm 293 triệu USD

(http://www.tuvannongnghiep.com.vn/tintuc/default.aspx?cat_id=772&news_id=1847)

2.1.2 Ở Việt Nam

Theo các chuyên gia về hoa của trường Đại học Nông nghiệp 1, với khoảng 755 loài hoa Lan hiện có, khí hậu thích hợp và nhiều nguyên liệu làm giá thể tốt cho cây sinh trưởng, Việt Nam có thể trở thành một nước sản xuất hoa Lan lớn trong khu vực Tuy nhiên hàng năm Việt Nam ta vẫn phải nhập một lượng lớn cây giống và cả lan cắt cành từ Thái Lan về để phục vụ nhu cầu trong nước

Hiện nay, mới chỉ có một số công ty lớn, trong đó có những công ty nước ngoài trồng hoa Lan tại Đà Lạt, TP Hồ Chí Minh, Đồng Nai với diện tích khoảng 50-60 ha/một doanh nghiệp Một vài địa phương khác hoa Lan chỉ mới trồng ở quy mô gia đình, trên diện tích từ vài m2 đến vài nghìn m2, cá biệt mới có vài hộ trồng trên 1-2 ha Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam bước đầu cũng đã có những thành công trong việc nuôi cấy mô tạo giống phong lan theo công nghệ được chuyển giao từ Thái Lan Một số địa phương

khác như Sa Pa, Phú Yên bước đầu đã khảo sát và nghiên cứu phương pháp

nhân giống, hoàn thiện quy trình sản xuất hoa Lan

Theo tính toán của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, nếu trồng

hoa Lan cắt cành là loài Dendrobium và Mokara, mỗi ha đất trồng có thể cho

thu nhập 500 triệu đến 1 tỷ đồng/năm, cao hơn nhiều lần so với trồng lúa và

một số hoa màu khác Hiện nay, mỗi năm Việt Nam vẫn phải chi hàng tỷ

đồng để nhập hoa Lan từ các nước láng giềng cho nhu cầu nội địa Chỉ tính

riêng tại thành phố Hồ Chí Minh, năm 2003 doanh số kinh doanh hoa Lan và

cây cảnh mới đạt 200 - 300 tỷ đồng, nhưng chỉ trong quý I năm 2006, doanh

số này đã đạt 400 tỷ đồng; các cơ sở kinh doanh hoa Lan, cây cảnh tăng

nhanh từ 264 cơ sở năm 2003 lên trên 1.000 cơ sở Riêng hoa Lan mỗi năm ở

thành phố này lượng tiêu thụ cũng đã lên đến hàng triệu cây (http://www.longdinh.com/default.asp?act=chitiet&ID=4705&catID=6)

2.1.3 Tầm quan trọng đối với việc duy trì và bảo vệ nguồn giống

Khí hậu ở Việt Nam nóng ẩm rất phù hợp với sự sinh trưởng và phát

triển của các loài lan Theo giáo sư Phạm Hoàng Hộ, hoa Lan Việt Nam rất đa

dạng và phong phú với số lượng lên tới 755 loài (Phạm Hoàng Hộ, 2000)

Theo nguồn tài liệu ngiên cứu mới nhất về hoa Lan ở Việt Nam năm 2003, đã

biết được 897 loài thuộc 152 chi của họ Lan (Trần Duy Quý, 2005)

Hoa Lan là một loại cây cảnh rất được ưa chuộng trên thị trường Tuy

nhiên, do các mục đích kinh tế, con người đã không quan tâm tới sự bảo tồn

thiên nhiên nói chung cũng như bảo vệ các nguồn giống quý nói riêng Lan

được khai thác từ rừng và vận chuyển tới các thành phố lớn trong nước và

nước ngoài, đặc biết những giống đặc hữu và quý hiếm Nguồn tài nguyên

này đang ngày càng cạn kiệt (http://www.monre.gov.vn) mà không có cách gì

bù đắp

Hiện nay, ở nước ta nuôi cấy mô tế bào đã được ứng dụng rộng rãi

trong việc nhân nhanh nhiều giống cây cảnh, cây lâm nghiệp, cây lương thực

thực phẩm… và đã thu được những thành công nhất định Không chỉ vậy, nuôi cấy mô tế bào cũng được áp dụng trong việc bảo tồn nguồn gen của các giống cây quý

Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu và ứng dụng so với yêu cầu thực tiễn còn một khoảng cách khá lớn và đòi hỏi sự nỗ lực và quyết tâm của các nhà khoa học cũng như các chuyên gia kinh tế trong lĩnh vực này

2.2 Giới thiệu về giống lan Hồ Điệp Phalanopsis

2.2.1 Giới thiệu chung về họ Lan

Về phân loại học, họ Lan Orchidaceae là họ lớn nhất trong giới thực vật một lá mầm, với khoảng 800 chi và 25000-35000 loài (Arrditti, 1979; Garay, 1960) Đặc tính khác thường về khả năng thụ phấn và lai xa tự nhiên của họ thực vật này đã khiến chúng trở nên phong phú về loài và phân bố rộng rãi Bên cạnh đó, người ta tiến hành lai tạo và đạt được nhiều thành công càng làm tăng nhanh số giống mới Hiện nay có hơn 9000 giống Lan lai mới đã được đăng ký bản quyền tại Royal Horticulture Society, Anh (Phạm Hoàng

Lan Hồ Điệp có tên khoa học là Phalaenopsis là loài có hoa lớn, bền,

đẹp Có tên từ chữ grec Phalaina nghĩa là bướm và opsis có nghĩa là sự giống nhau Lan Hồ Điệp là loài Lan có hoa giống bươm bướm phất phơ rất đẹp

Lan Hồ Điệp được khám phá năm 1750, đầu tiên được ông Rumphius

đặt tên là Angraecum album Năm 1753 Linne đổi tên thành Epidendrum

Năm 1825 nhà thực vật Hà Lan định danh lại là Phalaenopsis

Lan Hồ Điệp phân bố chủ yếu ở: Malaysia, Indonexia, Philipin, phía

đông Ấn Độ và Úc Ở Việt nam cũng có một số loài vì có hoa nhỏ nên được

gọi là tiểu Hồ Điệp (phalaenopsis manni, gibbosa, lobbi, fuscata, cornucervi)

Lan Hồ Điệp có thể mọc ở khí hậu nhiệt đới và đồi núi cao 2000m nên vừa

chịu được khí nóng ẩm vừa chịu được khí hậu mát

Lan Hồ Điệp có chừng 44 loại nguyên giống, cây có thể mọc ở xứ nhiệt

đới và đồi núi cao 2000 mét nên vừa chịu khí hậu nóng ẩm lại vừa chịu khí

hậu mát, nhiệt độ trung bình từ 200C đến 300C Việt Nam có chừng 7-8 giống

Vào năm 1750 G.E Rumphius đã tìm ra cây Lan Hồ Điệp nhưng lầm tưởng là

một loại Angraecum và sau này Carl Blume mới tìm ra cây Phalaenopsis

amabilis vào năm 1825 Lan Hồ điệp là một loại Lan thân đơn, ngắn, lá to và

cứng, rễ dài Những cây nguyên giống thường nở hoa vào mùa đông xuân, các

cây lai giống hoa nở quanh năm Nếu nuôi đúng cách Lan Hồ điệp có thể sống

rất lâu

2.2.2.2 Đặc điểm

Lan Hồ Điệp là loài Lan đơn thân, mập, ngắn lá to, dày mọc sát vào nhau Đây là giống gồm các loài có hoa lớn, đẹp Phát hoa mọc từ nách lá, dài, đơn hay phân nhánh, cánh hoa phẳng, trải rộng, hoa nở từng cái, 3 đài to tròn, 2 cánh xòa rộng kín Môi cong, dẹp có 2 râu dài Trụ có hình bán nguyệt với 2 phần khối u nên chứa đầy phấn hoa Ngày nay, Lan Hồ Điệp được lai tạo với nhiều màu sắc và kích thướt đa dạng: trắng, tím, đỏ, vàng, hồng

Hình 2.2 Một số loài Lan Hồ Điệp

Cách trồng

- Nhiệt độ: Lan Hồ Điệp là một loại Lan không chịu được quá nóng hay quá lạnh, lại không cần nhiều ánh sáng cho nên thích hợp trồng trong nhà hay trong nhà kính Nhiệt độ thích hợp nhất là từ 22 – 270C Khi cây đang ra nụ, nhiệt độ hay độ ẩm thay đổi bất thường sẽ làm cho nụ hoa héo rụng

- Ánh sáng: Trong nhà kính phải dùng lưới che bớt ánh sáng vì hoa Lan chỉ cần từ 1000 cho đến 1500 ánh nến Nuôi trong nhà, cần để lan ở gần cửa

sổ có ánh nắng hoặc không cũng được Có thể dùng 4 chiếc đèn ống 40W và

2 bóng đèn thường, cách ngọn cây Lan khoảng 6-10" từ 12-16 giờ mỗi ngày:

12 giờ cho cây lớn và 16 giờ cho cây nhỏ

- Tưới nước: Không bao giờ để Lan quá khô, mùa hè nên tưới thật đẫm

2 lần một tuần Mùa đông 10 ngày tưới một lần Nên tưới vào buổi sáng để lá cây sẽ khô trước khi đêm xuống Nếu để nước đọng vào ngọn, lá non dễ bị thối và cây sẽ chết

- Độ ẩm: Hoa Lan cần độ ẩm từ 50-80% Để chậu Lan trên khay nước

có xếp đá sỏi cho có đủ độ ẩm cần thiết

- Phân bón: Khi cây đang mọc bón phân 30-10-10 mỗi tuần một lần, chỉ nên bón 1/4 hay ½ thìa cà phê gạt cho 1 gallon nước Khi cây sắp ra nụ bón phân 10-30-20 hoặc dùng một thứ 15-15-15 Mùa đông bớt bón phân 2 tuần 1 lần, khi cây không mọc nên ngưng bón

- Thay chậu: Thời gian thay chậu tốt nhất là vào muà xuân hay khi hoa vừa tàn, tối thiểu 3 năm một lần Nếu vỏ cây bị mục nát sẽ làm thối rễ Vỏ cây nuôi Lan Hồ điệp cần phải thoáng và dóc nước, thông thường dùng vỏ cây cỡ

½" trộn với 1/10 perlite hoặc vỏ cây cở 1/8-1/4" và perlite cho những cây lan còn nhỏ Khi trồng lại, cắt bỏ các rễ thối, giữ cho cuống rễ gần ngang miệng chậu rồi bỏ vỏ cây vào Dùng ngón tay ấn quanh miệng chậu cho chặt Tưới bằng 1 thìa súp B1 pha với 1 gallon nước

Khi hoa tàn, cắt bỏ dò hoa chừa lại 3 đốt cuối, cây Lan sẽ tiếp tục ra hoa Nếu cây không được khỏe, lá mềm rũ xuống nên cắt bỏ hẳn dò hoa để cho cây được mạnh Đôi khi Lan cũng mọc cây con (keiki) ở gốc hoặc trên các đốt trên dò hoa, trường hợp này đợi cây non ra rễ sẽ tách ra trồng lại Có những loại thuốc có chất hormone để tạo ra những cây con ở các đốt hoa Thuốc này có bán tại các nhà trồng Lan

Những cây lai giống từ các cây kể trên phần đông đều có hương thơm

di truyền từ cây cha hoặc cây mẹ

2.3 Các phương pháp nhân giống hoa Lan

2.3.1 Phương pháp nhân giống hữu tính

Nhân giống hữu tính là biện pháp thụ phấn để tạo quả có hạt Sử dụng hạt đó kích thích nảy mầm để hình thành cây con Song thực tế do cấu trúc của hạt Lan chỉ là khối tế bào chưa phân hoá vì vậy mà khả năng nảy mầm của hạt trong điều kiện tự nhiên là cực thấp Chỉ trong những điều kiện khá tối

ưu như: ẩm ướt, có nấm cộng sinh thì cũng chỉ có tỷ lệ khoảng một phần triệu hạt Lan có thể nảy mầm được Song trong điều kiện hiện nay nhờ có kỹ thuật

nuôi cấy in vitro mà người ta có thể điều khiển sự nảy mầm của hạt Lan trong

điều kiện nhân tạo khá dễ dàng

Thụ phấn có 2 cách:

+ Nhờ vào côn trùng hoặc bằng chính bàn tay con người

+ Sự tự thụ phấn: hiện tượng này hầu như không xảy ra trên đối tượng hoa Lan do cấu trúc của hoa và phần sinh dục đực và cái chín lệch pha nhau

Trong tự nhiên sự thụ phấn cho được nhờ vào côn trùng hoặc bằng chính bàn tay con người thực hiện Chính vì vậy mà ngày nay đã xuất hiện một số lượng rất lớn các giống hoa lai và chính những giống này được phát triển rất mạnh mẽ trong đời sống

Các nghiên cứu về phương pháp lai giống: năm 1953 Dominy đã thành công trong việc lai giống Lan ở nước Anh Cây lai đầu tiên ra hoa là

Calamthe Dominu (tổ hợp lai là Calamthe masuca * Calamthe furcata)

Việc lấy phấn và thụ phấn được thực hiện tốt nhất từ ngay sau khi hoa

nở 3-4 ngày vào lúc buổi sáng sớm Qua kết quả chọn lọc và lai tạo các nhà chọn giống và trồng Lan đã bổ sung thêm 75000 loài Lan mới (Saprorhx-teahultum, 1953; Camphell, 1964)

2.3.2 Phương pháp nhân giống vô tính

+ Phương pháp nhân giống vô tính bằng cách tách chiết (phương pháp truyền thống)

Ở phương pháp này người ta lợi dụng sự dâm chồi, nẩy cành của cây, nguyên lý chung: vào chồi mùa sinh trưởng của cây, cắt rời chân cây mẹ thành từng đơn vị mỗi đơn vị gồm 3 giá thành và mỗi đơn vị này được trồng vào một chân chậu mới Hoặc tách cây con sinh ra trên các giá hành để trồng vào chậu mới

+ Phương pháp tách chồi (tách bụi)

Phương pháp này được sử dụng với các giống Lan đa thân như

Cattleya, Cymbidium, Paphiopedium… Ở phương pháp này tiến hành khi

trong chậu các giá hành đã sản sinh ra với số lượng lớn cây bò ra mép chậu hoặc tiến hành đồng thời khi cần thay đổi chậu mới bị hư hỏng

Trước khi tách thường ngâm chậu cây vào nước khoảng một giờ để cho

rễ bám vào các thành chậu dễ dàng tách ra giảm thiểu sự hư hại của bộ rễ Sau

đó nhấc toàn bộ bụi cây ra khỏi chậu dùng dao sắc đã khử trùng cắt Để tránh cho vết cắt không bị nhiễm khuẩn cần bôi kháng sinh vào hay paraffin… Các đơn vị này nên cắt bớt các rễ già, rễ chết, cố định cây vào chậu bằng cách dùng que cắm hay dây thép để buộc vào chậu

+ Phương pháp chiết cành (cắt đoạn thân)

Với Dendrobium,Thunia…thường tạo ra cây con trên giá hành (Keikis)

một cách tự nhiên Khi cây con này phát triển tốt, có rễ từ 5-7cm (không nên

để rễ quá dài), có thể tách khỏi giá hành

Với những cây Phalaenopsis đôi khi cây con tạo ra trên cộng phát hoa

Khi cây có rễ thì có thể tách ra trồng Song trường hợp này rất ít xảy ra Vì vậy có thể dùng hoá chất để kích thích, nhưng đơn giản hơn ta có thể làm tăng

độ ẩm bằng cách trùm cọng phát hoa già trong túi nilon có chứa chất có thể duy trì độ ẩm cao liên tục

Một số cây Vanda, Phalaenopsis… khoẻ mạnh, hoặc ít bị tổn thương ở

đỉnh ngọn thì chúng sẽ sinh ra cây con từ chồi bên gần gốc Vì vậy khi chồi

có rễ có thể tách ra để trồng Với một số giống Vanda, Arachinis… (Lan đơn

nhân), khi chúng quá cao lớn thì có thể cắt phần ngọn khoảng 30-50cm có ít

nhất 2-3 tầng rễ để trồng Phần gốc có thể tiếp tục duy trì trong môi trường độ

ẩm cao có thể xuất hiện thêm nhiều chồi bên (2-4 chồi), từ đó có thể tách ra

để trồng

Riêng đối với Dendrobium do cấu trúc của thân gồm rất nhiều các đốt

nên người ta cũng có thể nhân giống bằng cách cắt từng đốt có một mắt và từ mắt có thể hình thành chồi Hoặc người ta có thể thu gom những đoạn thân

Demdrobium đã già bó thành từng bó để vào điều kiện râm mát cung cấp

nước cho độ ẩm khu vực đó cao sau thời gian 1,5-2 tháng cũng có thể thu được chồi nhất định

Nhân giống bằng phương pháp tách chiết rất dễ làm, không đòi yêu cầu

kỹ thuật cao cũng như đầu tư cao song hệ số nhân giống rất thấp chỉ có thể đạt 0,3-0,7 lần/năm Vì vậy mà không thể nào có thể đáp ứng về số lượng cây cho sản xuất và kinh doanh mà chỉ có phương pháp vi nhân giống trong ống nghiệm (micropropagation) là giải pháp duy nhất có khả năng đáp ứng về số lượng lớn cây giống

2.3.2 Phương pháp vi nhân giống (micropropagation)

Trong thời đại phát triển như vũ bão của nền khoa học và công nghệ nói chung, khoa học nông nghiệp nói riêng thì vai trò của công nghệ sinh học

đã góp phần thúc đẩy sản xuất phát triển một cách vượt bậc, sản xuất nông nghiệp trong một số năm gần đây tăng trưởng cực kỳ mạnh mẽ cả về năng suất, chất lượng cũng như chủng loại các sản phẩm, đóng góp của công nghệ sinh học cụ thể là phương pháp NCM tế bào cho quá trình này là việc tạo ra nguồn vật liệu di truyền phong phú phục vụ cho công tác chọn tạo giống

- Nhân nhanh, duy trì các giống cây trồng có giá trị kinh tế cao

- Làm sạch virus phục tráng những giống quý giá bị thoái hoá

- Lưu giữ và bảo quản nguồn gen quý

Nuôi cấy mô tế bào là biện pháp nhân giống hữu hiệu nhất trong các phương pháp nhân giống vô tính đối với một số loại cây trồng Bằng kỹ thuật

này cho phép tạo ra một quần thể cây con đồng đều, giữ nguyên đặc tính di truyền của bố mẹ, hệ số nhân cao vì vậy có khả năng đáp ứng được cây giống phục vụ cho công nghiệp hoá nền sản xuất nông nghiệp

Với những loại cây trồng quý hiếm mà khả năng nhân giống theo phương pháp truyền thống gặp rất nhiều khó khăn thì phương pháp NCM tế bào là cực kỳ có giá trị trong việc nhân nhanh những giống cây này

2.3.3 Nhân giống Lan bằng phương pháp NCM tế bào

a Cơ sở khoa học nuôi cấy mô tế bào là Tính Toàn Năng của tế bào

Năm 1902 lần đầu tiên nhà thực vật học người Đức là Haberlandt đã đề xướng ra phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh cho tính toàn năng của tế bào Theo nhận định của ông mỗi tế bào bất kỳ từ một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh

Ngay từ năm 1898, Haberlandt đã bắt đầu tiến hành thí nghiệm, nuôi cấy

mô tế bào đơn tách từ nhu mô của lá, tượng tầng và biểu bì của thân, lông hút của rễ của nhiều loài thực vật khác nhau, nhưng không thu được kết quả Ông nêu rõ: trong các thí nghiệm nuôi cấy, tôi không bao giờ quan sát được tế bào phân chia Vấn đề đặt ra cho các thí nghiệm nuôi cấy mô trong tương lai là phải xác định cho được các điều kiện thích hợp mà ở đó tế bào riêng rẽ sẽ phải phân chia

Mãi hơn 50 năm sau, các nhà thực vật về nuôi cấy mô và tế bào thực vật mới đạt được thành công chứng minh cho khả năng tồn tại và phát triển độc lập của tế bào Khả năng đó được gọi là tính toàn năng của tế bào (totipotency) Tính toàn năng của tế bào thực vật được các nhà thực nghiệm từng bước chứng minh, điển hình là các công trình của các tác giả sau đây:

- Miller và Shoog (1953) tạo được chồi từ mảnh mô cắt từ thân cây thuốc

lá

- Reinert và Steward (1958) tạo được phôi và cây hoàn chỉnh từ tế bào đơn của mô tượng tầng tách từ củ và nuôi cấy dạng huyền phù

- Cooking (1960) tách và nuôi cấy từ nhu mô mảnh lá

- Takebe (1971) đã tái sinh thành công cây thuốc lá từ tế bào trần

Ngoài khả năng tái sinh trực tiếp cây hoàn chỉnh từ các loại mô đã phân hoá, các loại tế bào của cơ thê thực vật còn có khả năng phát triển thành mô sẹo Đó là loại mô không phân hoá, phân chia liên tục và có khả năng phân hoá thành phôi, chồi và cây hoàn chỉnh

Đây là đặc điểm không tìm thấy ở tế bào động vật Khi nuôi cấy tế bào động vật phân chia và nhân lên thành một quần thể đồng nhất, nhưng không

có khả năng phân hoá để tạo ra mô, tổ chức, cơ quan hoặc cơ thể mới Nhờ có tính toàn năng mà kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật nhanh chóng trở thành công cụ hữu hiệu trong nhiều công tác giống cây trồng

b Nguyên tắc cơ bản của nuôi cấy mô tế bào thực vật

Dựa trên tính toàn năng của tế bào thực vật, mô phân sinh, thân, rễ, lá, hoa, quả, bẹ lá… đều có thể phát triển tái sinh thành cơ thể mới

Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình nuôi cấy:

- Ánh sáng: Cây nói chung đòi hỏi nguồn sáng có cường độ 1500-2000 LUX, chất lượng quang phổ ở dải tần 230-278mm, chu kì chiếu sáng 16/24 hoặc 8/24 Vai trò của ánh sáng rất quan trọng, nó kích thích tạo diệp lục, kích thích phát sinh hình thái, cung cấp chất dinh dưỡng cho cây, tạo callus, tạo củ

và lưu giữ quỹ gen

- Nhiệt độ: Vai trò của nhiệt độ là duy trì sự phát triển bình thường của thực vật, nhiệt độ thường dùng 25-270C, có thể duy trì nhiệt độ trên bằng điều hoà nhiệt độ hoặc tủ sấy

- Môi trường: Môi trường nuôi cấy mô là rất quan trọng quyết định sự thành công của nuôi cấy, nó bao gồm các yếu tố sau :

+ Các muối khoáng đa lượng: có khối lượng lớn hơn 30mg/l như: N,P,K,Mg,Ca… Nitơ ở dạng NO3, NH4 chuyển hoá thành ammonium thông qua nitrat reductase Lưu huỳnh ở dạng SO4, photpho ở dạng PO4

+ Các muối khoáng vi lượng: có khối lượng nhỏ hơn 30mg/l như : Fe, B,

Mn, Cu, Zn, Co, I, Mo

+ Vitamin: Vitamin nhóm B bổ sung phần thiếu hụt của tế bào gồm B1, B2, B5, Biontin: cần thiết cho phân bào, Myo-inositol có vai trò sinh tổng hợp

tế bào

+ Nguồn cacbon: Mô thực vật trong nuôi cấy chủ yếu bằng phương pháp

dị dưỡng Nguồn cacbon thường dùng là saccarose, có thể dùng glucose, fructose, maltose nhưng hiệu quả kém hơn

+ Các phụ gia hữu cơ:

Nước dừa, bột chuối nghiền, bột khoai tây nghiền, dịch chiết cà rốt, dịch chiết nấm men, dịch thuỷ phân casein-caseinhydrolysat, các axit amin… Nước dừa được sử dụng rất thông dụng trong nuôi cấy mô tế bào Nó có thành phần phức tạp, không ổn định tuỳ theo mùa, độ tuổi của cây, nguồn gốc của cây… Tuy vậy, nó có tác dụng rất tốt trong nuôi cấy mô tế bào Thành phần hoá học gồm các chất kích thích sinh trưởng như kinetin, auxin, axit amin tự do, protein, đường, axit hữu cơ, myo-inositol AND, ARN…

- Giá thể: Thạch (agar- agar) là giá thể chủ yếu, nó là một polysaccharide chiết xuất từ tảo, hoà tan ở 800C, ở 400C trở về trạng thái gel - nửa cứng Ngoài ra có thể dùng một số chất làm giá thể như phytagel, agarose…

- pH: Là yếu tố cực kì quan trọng trong môi trường, pH ảnh hưởng đến các yếu tố sau:

+ Sự tương tác giữa các chất, đặc biệt là trong quá trình khử trùng

+ Rất quan trọng trong việc thuỷ phân agar, pH thấp hay cao đều dẫn đến việc thạch không đông sau khử trùng

+ Ảnh hưởng đến các vitamin và các chất hữu cơ

+ Trước khi khử trùng cần chuẩn độ pH = 5,8

+ Sử dụng KOH, NaOH và HCl để điều chỉnh pH

+ Trong quá trình nuôi cấy pH giảm dần làm môi trường chua hoá

c Các bước nuôi cấy mô

- Giai đoạn 1: Giai đoạn chuẩn bị

Chuẩn bị cây mẹ: chăm sóc phòng trừ bệnh, nếu cần thiết cách ly, bao bọc toàn cây hay bộ phận cần thiết để chống nhiễm các vi khuẩn, nấm và virus

- Giai đoạn 2: Giai đoạn nuôi khởi động

Tạo mẫu vô trùng trong ống nghiệm Đây là giai đoạn cực kì quan trọng trong quy trình nuôi nhân giống nào, yêu cầu tạo được mẫu vô trùng và phát triển trong ống nghiệm Chọn loại mô thích hợp để đưa vào ống nghiệm

là mô trẻ, mô dễ tái sinh, ưu tiên mẫu không cần qua khử trùng hoặc dễ khử trùng như đỉnh sinh trưởng

Khử trùng mẫu thường dùng các chất như cồn H2O2, HgCl2… Yêu cầu làm tiệt trùng mẫu mà không làm tổn hại đến mẫu, duy trì được khả năng tái sinh của mẫu

Trình tự khử trùng:

Dùng cồn 70 độ khử trùng lớp sáp bên ngoài Chú ý chọn nồng độ thích hợp và thời gian khử trùng phù hợp

Sau khi khử trùng loại bỏ chất khử trùng bằng tráng nước vô trùng nhiều lần, cắt bỏ phần mô tiếp xúc với chất khử trùng Sau đó cấy vào môi trường

- Giai đoạn 3: Nhân nhanh

Có ý nghĩa quyết định đến hiệu quả của toàn bộ quy trình Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình như: Loại môi trường, các chất điều hoà sinh trưởng,

vi lượng, nồng độ, tương tác giữa các chất, các muối khoáng đa lượng, vi lượng, các vitamin, phụ gia hữu cơ, chế độ chiếu sáng, nhiệt độ, chế độ cấy chuyển,…

- Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh

+ Kéo dài thân: Nếu thân chưa đủ dài thì phải kéo dài thân Môi trường giảm cytokinin, tăng hoặc giữ nguyên auxin

+ Ra rễ cho cây: Loại bỏ cytokinin, bổ sung auxin vào môi trường hoặc chuyển sang môi trường không có chất điều hoà sinh trưởng

- Giai đoạn 5: Đưa cây ra ngoài ống nghiệm

Chuẩn bị cây trước khi đưa ra ngoài ống nghiệm: giảm độ ẩm bằng cách mở nút, hay bằng nút giấy Tăng nhiệt độ, tăng cường độ ánh sáng

Chuẩn bị điều kiện để đưa cây ra: giá thể - khử trùng, tơi xốp, thoát nước, giữ độ ẩm cần thiết, cung cấp thêm chất dinh dưỡng (Phạm Hoàng Hộ, 2000)

+ Các nghiên cứu về NCM hoa Lan

Hoa Lan là một trong những loại cây trồng thành công nhất trong nhân giống vô tính bằng phương pháp NCM ở mức độ thương mại NCM đã được thí nghiệm từ thế kỷ 17 nhưng chỉ thành công sau những sưu tầm về môi trường nuôi cấy của White và Gautheret đã áp dụng phương pháp NCM hoa

Lan năm 1956 Morel (1960) đã tạo được cây Cymbidium sạch virus từ cây bị

bệnh bằng nuôi cấy chồi nách trên môi trường Knudson C Bằng phương pháp NCM có thể dễ dàng đạt được 4 triệu cây/năm từ một chồi ban đầu (Morel, 1964) Với kỹ thuật nhân giống này đã tạo ra cường độ cực kỳ mạnh mẽ trong phát triển nghề trồng hoa Lan có tính chất công nghiệp Một số nhà vườn hàng đầu thế giới đã chấp nhận kỹ thuật NCM như một thông lệ trong những điều kiện của họ Murashige (1974) đã liệt kê có 22 giống được nhân bằng phương pháp NCM, Aritti (1977) liệt kê được 35 giống Có rất nhiều những thành công đạt được với rất nhiều giống bao gồm cả những giống được tạo ra

do quá trình lai tạo như Aranthera (Irawati, Harjadi, Suseno and Idris, 1977), Ascocenda (Fu, 1979, Holttumara Teo and Wong, 1978) và Renantanda (Goh

and Tan, 1979)

Cho tới nay thì hầu hết các loài hoa Lan đã được nhân nhanh bằng cách

sử dụng phương pháp NCM tế bào đã có rất nhiều những cuộc hội thảo về hoa

Lan được tổ chức trên thế giới đặc biệt là các nước thuộc khu vực Châu Á Những nghiên cứu chi tiết cho từng loại, từng giống ở từng khu vực đã và đang được các nhà khoa học nghiên cứu đưa ra những quy trình những cải tiến ngày một hoàn chỉnh hơn

+ Các phương pháp nhân giống in vitro hoa Lan

a Nuôi cấy in vitro hoa Lan bằng cách sử dụng chồi đỉnh

Kết quả nuôi cấy đỉnh sinh trưởng phụ thuộc rất nhiều vào mẫu nuôi cấy, nguồn gốc và kích thước của mẫu Tốt nhất là chúng ta lấy mẫu từ chồi đỉnh đang ở thời kì sinh trưởng mạnh (Gup et al, 1981) Đỉnh sinh trưởng của những cây non tốt hơn cây già Điều kiện sinh trưởng, thời vụ lấy mẫu cũng

có ảnh hưởng rất lớn đến kết quả tái sinh của mẫu nuôi cấy

Những công việc của Morel 1960 về nuôi hoa Lan hầu hết là sử dụng chồi đỉnh Mored (1960, 1964) đã sử dụng những chồi đỉnh có kích thước rất nhỏ (0,1 mm) để lấy meristem

Những cộng sự của ông và các nhà khoa học khác sau đó sử dụng những chồi đỉnh có kích thước lớn hơn (khoảng 3-5cm) Theo cách này thì có thể sẽ không làm sạch được virus nếu như cây mẹ đã nhiễm bệnh Vì vậy mà người ta đã tách ra như sau:

Nếu cây mẹ sử dụng để lấy mẫu đã được xác định là hoàn toàn sạch virus thì có thể sử dụng những chồi đỉnh có kích thước từ 3-5mm để đưa vào nuôi cấy Với những kích thước mẫu nuôi cấy này thì sẽ giảm thiểu đáng kể đến sự chết của mẫu và tăng cao khả năng tái sinh Nếu cây mẹ bị nhiễm virus thì phải lấy chồi đỉnh có kích thước 0,1-0,2mm với 1-2 lớp lá bao đưa vào nuôi cấy thì sẽ tránh được nhiễm virus

Phương pháp sử dụng chồi đỉnh đã được thực hiện trên rất nhiều đối

tượng: Aranda (Goh, 1973; Goh, Lonhard), Dendrobium (Singh, 1976), Rhychotylis (Vajrabhaya, 1970), Vanda (Goh, 1970) và rất nhiều loài khác

b Nuôi cấy chồi nách

Phương pháp này dùng cho nuôi cấy các giống Vanda, Aranda, Dendrobium, Mokara và Oncidium

Trong thực tế một số kết quả thu được cho thấy việc sản xuất các chồi nách làm nguồn mẫu cuôi cấy chúng có thể phản ứng như việc sử dụng chồi đỉnh, thậm chí còn cho kết quả tốt hơn so với việc sử dụng chồi đỉnh đối với

một số giống Arandarai (Goh, 1973; Goh and Loh 1975) Tuy nhiên khả năng

đẻ của mẫu sẽ giảm khi sử dụng những chồi nách ở xa với đỉnh ngọn (Loh,

Goh, and Rao,1978) Điều này nhận thấy rõ trên đối tượng Dendrobium (Kim

et al, 1970; Singh, 1976) Chính vì vậy mà trong quá trình lấy mẫu và nuôi cấy người ta chỉ nên chọn các chồi có kích thước từ 3-4cm là tốt nhất

Đối với một số giống Lan đặc biệt là những loài thuộc nhóm Lan đa thân thì việc sử dụng chồi nách để nuôi cấy vừa có hiệu quả cao vừa có thể bảo toàn được cây mẹ ban đầu vì vào mùa sinh trưởng thì khả năng phát triển của chồi nách rất lớn

c Nuôi cấy cuống hoa

Việc sử dụng cuống hoa đem vào nuôi cấy chủ yếu áp dụng cho loài hoa

Phalaenopis Bởi vì đối với Phalaenopsis, nó không giống như các loại hoa Lan khác như Cymoidium, Dendrobium và Cattleya, hầu hết những giống Phalaenopsis được trồng trọt có tính thương mại chúng được nhân giống từ

hạt và như vậy thì sẽ cho thế hệ cây non không đồng nhất Và phương pháp vi nhân giống không có khả năng làm giảm được bất lợi trong kỹ thuật này Do

sự không đồng nhất đó một số vấn đề lớn phải giải quyết đó là sự thay đổi trong sinh trưởng, thời gian ra hoa và những đặc tính của hoa Những thay đổi

đã làm tăng giá thành sản xuất, giảm lợi nhuận (Ken Tokuhara and Masahiro

mii, 1993) Hơn nữa việc nhân giống bằng chồi nách của Phalaenopsis là rất

hãn hữu do khả năng đẻ chồi của nó rất hiếm

Một số phương pháp vi nhân giống như Phalaenopsis được đưa ra bao

gồm nuôi cấy cuống hoa cùng chồi nách (Intwong et at, 1972, Reiginger et at,

1976), chồi đỉnh của những chồi từ cuống hoa (Zimmer and Pieper 1978, Ichihashi 1992) những đoạn của cuống hoa (Homma and Asahira 1895, Lin 1986) Ở phương pháp này người ta sử dụng những phát hoa của cây đang ở thời kì hình thành nụ nhỏ, cắt mỗi đoạn phát hoa có mang một mắt chồi, loại

bỏ lớp áo bao phía ngoài rồi thực hiện các bước khử trùng Sau đó tách bỏ 2-3 lớp lá từ chồi Phần chồi đỉnh đạt được kích thước rộng 1mm, cao 0,5mm và

có 1-2 lá bao được cắt ra từ đoạn cuống của phát hoa

d Nuôi cấy mô lá

Sử dụng mô lá làm nguồn vật liệu cho nuôi cấy được thực hiện khá thành công trên một số đối tượng như: hoa cúc, thuốc lá… đối với hoa Lan việc sử dụng mô lá để làm nguồn mẫu ban đầu lại càng có ý nghĩa hơn bởi việc sử dụng chồi đỉnh sẽ dễ dàng làm hy sinh luôn cả cây đó Hoặc khi sử dụng chồi nách một phần của cây sẽ bị phá huỷ, cả hai phương pháp này đều làm ảnh hưởng tới sinh trưởng của toàn bộ cây mẹ hoặc nó bị ức chế tới các chức năng khác Trong khi việc sử dụng phát hoa, lá, rễ cũng gây hại cho cây nhân giống đầu tiên

Phương pháp sử dụng mô lá được thực hiện trên một số đối tượng như

Cattleya, EpiDendrobium và Laelio Cattleya Nguồn mẫu lấy từ lá non của cây in vitro hoặc phần chóp lá của những cây trưởng thành (Champagnat and

Morel, 1969; Churchill et at, 1971,1973)

Riêng đối với cây Phalaenpsis hướng nhân giống từ mô lá đã được

thực hiện bởi M.Tanaka và cộng sự tại trường đại học Osaka, Nhật Bản Những cuộc thử nghiệm ban đầu đã cho thấy việc nuôi cấy mô lá của những cây trưởng thành đã không hình thành thể Protocorm-PLB (protocorm like body) PLB chỉ hình thành khi nuôi cấy mô lá của những cây rất non Quá trình tạo PLB bị hạn chế cùng với sự tăng của tuổi cây

Lá từ những cây non của một số giống hoa Lan Aranda là nguồn mẫu tuyệt vời cho quá trình nhân giống in vitro (Loh et al, 1975; Loh, 1977; Fu,

1979) Thậm chí những lá non đang phát triển từ những cây trưởng thành của

Ascocenda và Renantanda có thể sử dụng để nuôi cấy tạo vật liệu cho việc

nhân giống hàng loạt (Fu, 1979; Goh and Tan 1979)

+ Môi trường nuôi cấy

Hầu hết môi trường sử dụng cho sự nảy mầm của hạt hoa Lan cũng như cho nuôi cấy mô là giống nhau như cho nuôi cấy mô của những loại cây khác (Witthner, 1959; Arditti, 1967) Qua nhiều thử nghiệm nghiên cứu người ta nhận thấy đa số các loài hoa Lan tỏ ra thích hợp với môi trường Vacin and Went (VW) Bên cạnh đó môi trường Murashige and Skoogs và Knudson C cũng hay được sử dụng

Ngoài thành phần khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin của môi trường

cơ bản ban đầu thì nước dừa (ND) thông thường được bổ sung để tăng cường

sự hình thành callus (Goh, 1970; Goh, Loh and Rao, 1975), với phạm vi sử dụng từ 10-25% Với mẫu đưa vào nuôi cấy ban đầu có thể dùng 20% và sau khi xảy ra sự phân hoá cấy chuyển có thể giảm xuống còn 10% (Loh, Goh and Rao 1978)

Một trong những nhân tố quan trọng nữa là cytokinin (Letham 1974, Van Standen and Drewes, 1975) Tuy nhiên tuỳ theo đối tượng mẫu, phát hoa,

mô lá hay tính trạng của mẫu (đã cấy chuyển nhiều lần hay chưa) mà ta sử dụng chủng loại, nồng độ cho thích hợp với từng loại mẫu, từng thời kì Vì đa

số các loài hoa Lan là tương đối nhạy cảm với sự có mặt của các chất điều tiết sinh trưởng bổ sung vào trong môi trường đặc biệt với mẫu đã qua một số lần cấy chuyển

Việc bổ sung các chất phụ gia khác (dịch chiết của một số loại như: khoai tây, chuối, đu đủ, cà rốt…) là hết sức có ý nghĩa đối với quá trình nhân

giống in vitro hoa Lan

PHẦN 3 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Để xây dựng qui trình nhân nhanh giống Lan Hồ Điệp, chúng tôi đã

tiến hành các thí nghiệm in vitro Qui trình nhân giống gồm 5 giai đoạn:

- Giai đoạn 1: Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy

- Giai đoạn 2: Tạo thể nhân nhanh in vitro

- Giai đoạn 3: Nhân nhanh in vitro

- Giai đoạn 4: Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh

- Giai đoạn 5: Chuyển cây con in vitro ra vườn ươm

Các thí nghiệm này được thực hiện tại phòng thí nghiệm trọng điểm, Viện Di Truyền Nông Nghiệp Nội dung nghiên cứu bao gồm:

- Nghiên cứu hiệu quả khử trùng của HgCl2 và H2O2 ở các thời gian, nồng độ khác nhau

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hoà sinh trưởng đến khả năng sinh trưởng và phát triển chồi của các mẫu nuôi cấy

- Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh trong ống nghiệm và đưa cây ra vườn ươm

Các thí nghiệm nghiên cứu được thực hiện:

3.2.1 Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy

Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ và thời gian khử trùng đối với ngồng hoa Lan Hồ Điệp

Mẫu ban đầu được lau qua cồn 700 rồi bỏ vào bình sạch đã được khử trùng(đối với những mẫu bám bụi bẩn, phải đem rửa bằng xà phòng trước) Sau đó cho 50-100ml cồn 700 lắc nhẹ trong thời gian 1 phút, rồi tráng nước vô trùng 1 lần và bắt đầu tiến hành thí nghiệm với các hoá chất khử trùng là

H2O2 nồng độ: 10%, 20%, 30% trong thời gian 10 phút và HgCl2 0,1% trong thời gian: 5 phút, 10 phút, 15 phút Các mẫu được lắc đều trong 100-150ml hoá chất ở các nồng độ và thời gian đã nêu Sau đó đem tráng nước vô trùng nhiều lần (4-5lần) cho đến khi mẫu sạch

3.2.2 Giai đoạn tạo thể nhân nhanh in vitro

Các mẫu đã được khử trùng đưa vào nuôi cấy trong các công thức môi trường khác nhau tùy theo mục tiêu của thí nghiệm Các công thức môi trường được liệt kê dưới đây

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ BAP từ (0- 2,5) mg/l đến khả năng tạo chồi từ mắt ngủ của Lan Hồ Điệp

B1: MS + 0 mg/l BAP + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

B2: MS + 0,5 mg/l BAP + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

B3: MS + 1,0 mg/l BAP + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

B4: MS + 1,5 mg/l BAP + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

B6: MS + 2,5 mg/l BAP + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

B5: MS + 2,0 mg/l BAP + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của 2,4D ở các nồng độ khác nhau kết hợp với 0,1mg/l IAA lên quá trình phát sinh mô sẹo ở nụ hoa (tính theo tỷ lệ %)

TD1: MS + 0 mg/l 2,4D + 0,1 mg/l IAA + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

TD2: MS + 0,1 mg/l 2,4D + 0,1 mg/l IAA + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

TD3: MS + 0,2 mg/l 2,4D + 0,1 mg/l IAA + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

TD4: MS + 0,3 mg/l 2,4D + 0,1 mg/l IAA + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

TD5: MS + 0,4 mg/l 2,4D + 0,1 mg/l IAA + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

TD6: MS + 0,5 mg/l 2,4D + 0,1 mg/l IAA + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

TD7: MS + 0,6 mg/l 2,4D + 0,1 mg/l IAA + 30g/l đường + 6g/l Agar

Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của chất bổ sung vào môi trường đến biểu hiện phân hoá mô sẹo của Lan Hồ Điệp

Bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất: 1000 mg/l casein hydrolysate,

1000 mg/l malt extract, 60 g/l maltose và sucrose, 60 g/l glutose và sucrose,

60 g/l sucrose

3.2.3 Giai đoạn nhân nhanh in vitro

Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của nồng độ NAA và nồng độ BAP = 1,0 mg/l

đến khả năng tạo chồi của Lan Hồ Điệp

N1: MS + 1,0 mg/l BAP + 0 mg/l NAA + 30 g/l đường + 6 g/l Agar N2: MS + 1,0 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA+ 30 g/l đường + 6 g/l Agar N3: MS + 1,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA+ 30 g/l đường + 6 g/l Agar N4: MS + 1,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA+ 30 g/l đường + 6 g/l Agar N5: MS + 1,0 mg/l BAP + 1,5 mg/l NAA+ 30 g/l đường + 6 g/l Agar N6: MS + 1,0 mg/l BAP + 2,0 mg/l NAA+ 30 g/l đường + 6 g/l Agar

Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của BAP đến quá trình nhân nhanh chồi của Lan Hồ Điệp

B1: Vacin + 0 mg/l BAP + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

B2: Vacin + 0,5 mg/l BAP + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

B3: Vacin + 1,0 mg/l BAP + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

B4: Vacin + 1,5 mg/l BAP + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

B5: Vacin + 2,0 mg/l BAP + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của nước Dừa đến quá trình nhân nhanh chồi của Lan Hồ Điệp

CW1: Vacin + 1,5 mg/l BAP + 0 ml/l nước Dừa + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

CW2: Vacin + 1,5 mg/l BAP + 50 ml/l nước Dừa + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

CW3: Vacin + 1,5 mg/l BAP + 100 ml/l nước Dừa + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

CW4: Vacin + 1,5 mg/l BAP + 150 ml/l nước Dừa + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

CW5: Vacin + 1,5 mg/l BAP + 200 ml/l nước Dừa + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của chuối xanh đến quá trình nhân nhanh chồi của Lan Hồ Điệp

C1: Vacin + 1,5 mg/l BAP + 150 ml/l nước dừa + 0 g/l chuối xanh + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

C2: Vacin + 1,5 mg/l BAP + 150 ml/l nước dừa + 10 g/l chuối xanh + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

C3: Vacin + 1,5 mg/l BAP + 150 ml/l nước dừa + 20 g/l chuối xanh + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

C4: Vacin + 1,5 mg/l BAP + 150 ml/l nước dừa + 30 g/l chuối xanh + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

C5: Vacin + 1,5 mg/l BAP + 150 ml/l nước dừa + 40 g/l chuối xanh + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

Thí nghiệm 9: Ảnh hưởng của GA3 đến khả năng kéo dài chồi tạo chồi của Lan Hồ Điệp

G1: Vacin + 0 mg/l GA3 + 0,5 mg/l BAP + 150 ml/l nước Dừa + 10 g/l chuối xanh + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

G2: Vacin + 0,1 mg/l GA3 + 0,5 mg/l BAP + 150 ml/l nước Dừa + 10 g/l chuối xanh + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

G3: Vacin + 0,2 mg/l GA3 + 0,5 mg/l BAP + 150 ml/l nước Dừa + 10 g/l chuối xanh + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

G4: Vacin + 0,3 mg/l GA3 + 0,5 mg/l BAP + 150 ml/l nước Dừa + 10 g/l chuối xanh + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

G5: Vacin + 0,4 mg/l GA3 + 0,5 mg/l BAP + 150 ml/l nước Dừa + 10 g/l chuối xanh + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

G6: Vacin + 0,5 mg/l GA3 + 0,5 mg/l BAP + 150 ml/l nước Dừa + 10 g/l chuối xanh + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

Thí nghiệm 10: Ảnh hưởng của các chất chống oxy hoá đến khả năng ngăn ngừa hiện tượng hoá đen môi trường của Lan Hồ Điệp

O1: MS + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

O2: MS + 1 g/l VTM C + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

O3: MS+ 2 g/l VTM C + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

O4: MS+ 3 g/l VTM C + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

O5: MS + 1 g/l PVP + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

O6: MS + 2 g/l PVP + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

O7: MS + 3 g/l PVP + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

3.2.4 Giai đoạn tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh

Thí nghiệm 11: Ảnh hưởng của NAA đến khả năng hình thành rễ của chồi Lan Hồ Điệp

D1: Vacin + 0 g/l NAA + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

D2: Vacin + 0,5 g/l NAA + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

D3: Vacin + 1,0 g/l NAA + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

D4: Vacin + 1,5 g/l NAA + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

D5: Vacin + 2,0 g/l NAA + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

D:6 Vacin + 2,5 g/l NAA + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

3.3 Điều kiện nuôi cấy

+ Điều kiện nuôi cấy: Mẫu được nuôi trong tối ở nhiệt độ (24-27)0C Mô sẹo được hình thành sẽ cấy chuyển sang môi trường tái sinh trong điều kiện chiếu sáng 8h/ngày, cường độ chiếu sáng 2400 lux-2600 lux

+ pH môi trường: 5,6- 5,8

3.4 Các chỉ tiêu và phương pháp theo dõi trong nuôi cấy mô tế bào

Để đánh giá hiệu quả của phương pháp khử trùng và khả năng tái sinh của mẫu nuôi cấy, chúng tôi dựa vào các chỉ tiêu sau :

- Đánh giá kết quả tạo và nhân chồi:

∑Số chồi thu được

Hệ số tạo chồi (lần) = -

∑Số mẫu cấy vào

∑Số chồi thu được

Hệ số nhân chồi (lần) = -

∑Số chồi cấy vào

- Đánh giá kết quả phát sinh mô sẹo (callus):

∑Số mẫu tạo callus

Tỷ lệ tạo callus (%) = - x 100

∑Số mẫu cấy vào

- Đánh giá kết quả nhân callus:

Các số liệu nghiên cứu được tính toán theo phương pháp thống

kê toán học Việc xử lý số liệu được thực hiện trên máy vi tính theo chương trình IRRISTAT