nghiên cứu xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro giống lan hoàng thảo trầm trắng (dendrobium nestor var alba)

DANH MỤC BẢNG 3.1a Ảnh hưởng của chất khử trùng đến khả năng tạo mẫu vô trùng của 3.1b Ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng đến khả năng tạo mẫu vô 3.1c Ảnh hưởng của nồng độ chất khử tr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ TÌNH

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN NHANH

IN VITRO GIỐNG LAN HOÀNG THẢO TRẦM TRẮNG

(DENDROBIUM NESTOR VAR ALBA)

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan: Bài luận văn thạc sỹ này là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân, được thực hiện dựa trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết, kiến thức chuyên ngành, nghiên cứu khảo sát tình hình thực tiễn và dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS Hà Thị Thúy và TS Nguyễn Thanh Hải

Các số liệu, bảng biểu và những kết quả trong bài luận văn là trung thực, các nhận xét, phương hướng đưa ra xuất phát từ thực tiễn và kinh nghiệm hiện có

Một lần nữa tôi xin khẳng định về sự trung thực của lời cam đoan trên

Người thực hiện

Nguyễn Thị Tình

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán bộ làm việc tại phòng nghiên cứu trọng điểm quốc gia công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp

đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình dạy bảo tôi trong suốt 2 năm học qua

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới những người thân, bạn bè đã luôn ở bên, chăm sóc, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp này

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng năm 2015

Học viên

Nguyễn Thị Tình

1.1 Nguồn gốc, phân bố, phân loại và giá trị của phong lan 3

1.4 Đặc điểm thực vật học và sinh thái học của lan Hoàng thảo Trầm trắng

1.5 Tình hình sản xuất hoa lan ở Việt Nam và trên thế giới 11

1.5.1 Tình hình sản xuất hoa lan trên thế giới 11 1.5.2 Tình hình nghiên cứu, sản xuất và phát triển phong lan ở Việt Nam 13

1.6.1 Phương pháp truyền thống 16 1.6.2 Phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật 18 1.7 Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô tế bào hoa lan 19 1.7.1 Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô hoa lan trên thế giới 19 1.7.2 Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô tế bào hoa lan trong nước 23 Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.2.2 Nghiên cứu phương pháp nhân nhanh thông qua protocorm ở các điều

2.2.3 Nghiên cứu xác định môi trường tái sinh cây và tạo cây hoàn chỉnh 29 2.2.4 Nghiên cứu phương pháp huấn luyện và đưa cây in vitro ra ngoài vườn

2.3.2 Các hóa chất và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 34 2.3.3 Phương pháp pha chế môi trường nuôi cấy in vitro 35

3.1.1 Ảnh hưởng khác nhau của chất khử trùng đến mẫu nuôi cấy 37 3.1.2 Ảnh hưởng của nguồn mẫu đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của mẫu đưa

3.1.3 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng của mẫu nuôi cấy

43 3.1.4 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng tới quá trình phát sinh hình

3.2 Nghiên cứu phương pháp nhân nhanh thông qua protocorm ở các điều kiện

3.2.1 Ảnh hưởng của 6-BA lên khả năng nhân protocorm 46

3.2.2 Ảnh hưởngcủa 6-BA kết hợp với kinetin lên khả năng nhân protocorm.

47 3.3 Nghiên cứu xác định môi trường tái sinh cây và tạo cây hoàn chỉnh 49 3.3.1 Ảnh hưởng của môi trường tái sinh cây lan Trầm trắng từ protocorm.49 3.3.2 Ảnh hưởng của môi trường khác nhau đến sự sinh trưởng và phát

3.4 Nghiên cứu phương pháp huấn luyện và đưa cây in vitro ra ngoài vườn ươm 59 3.4.1 Ảnh hưởng của một số biện pháp huấn luyện cây con in vitro khi ra

3.4.2 Ảnh hưởng của các loại giá thể lên sinh trưởng, phát triển của cây con

3.5 Tóm tắt quy trình công nghệ nhân nhanh giống lan hoàng thảo trầm trắng đã

6 - Benzyl Amino Purine

Chiều cao chồi Chiều dài lá Chiều dài rễ

Công thức

Chuối xanh Điều hòa sinh trưởng

Giberrilin acid

Hệ số nhân Indol Acetic Acid

Số chồi

Số rễ

DANH MỤC BẢNG

3.1a Ảnh hưởng của chất khử trùng đến khả năng tạo mẫu vô trùng của

3.1b Ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng đến khả năng tạo mẫu vô

3.1c Ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng đến khả năng tạo mẫu vô trùng

3.2 Ảnh hưởng của nguồn mẫu đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của mẫu

3.3 Ảnh hưởng của các loại môi trường cơ bản lên khả năng tạo

3.4 Ảnh hưởng của nồng độ 6-BA đến khả năng tạo protocorm và chồi

3.5 Ảnh hưởng của 6-BA lên khả năng nhân protocorm sau 6 tuần nuôi cấy 463.6 Ảnh hưởng của 6-BA kết hợp với kinetin lên khả năng nhân protocorm 483.7 Ảnh hưởng của nồng độ 6-BA đến khả năng tái sinh và nhân chồi từ

3.8 Ảnh hưởngcủa 6-BA kết hợp với kinetin đến khả năng tái sinh và

3.9 Ảnh hưởng kết hợp GA3 đến quá trình kéo dài chồi 523.10 Ảnh hưởng của α-NAA đến sự hình thành rễ của cây 533.11 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng cây Trầm

3.12 Ảnh hưởng của nồng độ nước dừa đến quá trình sinh trưởng của cây

3.13 Ảnh hưởng của dịch củ đến quá trình sinh trưởng của cây con in vitro 583.14 Ảnh hưởng của một số biện pháp huấn luyện cây con in vitro trước

3.15 Ảnh hưởng của các loại giá thể lên sinh trưởng, phát triển của cây

DANH MỤC HÌNH

3.1 Ảnh hưởng của chất khử trùng đến sự sinh trưởng và tái sinh của mẫu

3.2 Ảnh hưởng của chất khử trùng đến sinh trưởng và tái sinh của đoạn

3.3 Ảnh hưởng của các loại môi trường cơ bản lên khả năng nhân

3.4 Ảnh hưởng của nồng độ 6-BA đến khả năng tạo protocorm và chồi

của lan hoàng thảo trầm trắng ở nồng độ 6-BA = 2mg/l 45 3.5 Ảnh hưởng của 6-BA lên khả năng nhân protocorm sau 6 tuần nuôi cấy 47 3.6 Ảnh hưởng của 6-BA kết hợp với kinetin lên khả năng nhân

3.7 Ảnh hưởng của 6-BA lên khả năng tạo chồi từ protocorm sau 6 tuần

3.8 Ảnh hưởng của 6-BA kết hợp với kinetin lên khả năng tạo chồi từ

3.10 Ảnh hưởng của α - NAA lên khả năng tạo rễ sau 6 tuần nuôi cấy 54 3.11 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy tới sinh trưởng của cây con in vitro 55 3.12 Ảnh hưởng của nồng độ nước dừa tới sinh trưởng của cây con in vitro 57 3.13 Ảnh hưởng của dịch củ đến sinh trưởng của cây con in vitro 58 3.14 Ảnh hưởng của một số biện pháp huấn luyện cây con in vitro trước

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Cùng với sự phát triển của văn minh nhân loại, đời sống con người ngày càng được nâng cao, cả về mặt vật chất và tinh thần Nhu cầu thưởng thức cái đẹp, đặc biệt cái đẹp đến từ thiên nhiên, cỏ cây hoa lá dần đi vào đời sống mỗi người dân

Từ xa xưa, chơi hoa, trồng hoa và thưởng thức hoa đã được coi là một thú vui nghệ thuật độc đáo và thú vị Ngày nay, nghề trồng hoa và kinh doanh hoa đang ngày càng được chú tâm và phát triển bởi nó không chỉ bó hẹp trong giá trị thưởng thức mà còn mang lại giá trị kinh tế rất cao Phong lan là một trong những loài hoa

có chất lượng cao, giá trị kinh tế lớn, được nhiều người yêu thích bởi có hoa đẹp, cấu trúc hoa kiêu kỳ, phức tạp Hơn nữa, màu sắc hoa vô cùng phong phú, hương thơm quyến rũ, thời gian chơi dài,…có lẽ cũng bởi vậy mà phong lan được mệnh danh là nữ hoàng của các loài hoa!

Nhờ quá trình sưu tầm các loài lan đẹp, lạ mắt và các kỹ thuật lai tạo ra các thứ lan mới, số loài hoa lan hiện nay trên thế giới có thể đã lên đến 100 ngàn loài

Vì thế, trong thời gian gần đây, trên thế giới cũng như ở Việt Nam, thú chơi lan đã trở thành thông dụng và có điều kiện hơn, không phân biệt địa vị, tuổi tác, hoàn cảnh kinh tế Số người chơi và yêu chuộng hoa lan ngày càng tăng, hay nói cách khác, nhu cầu sử dụng các chủng loại lan đã và đang tăng Hoa lan hiện đang được trồng và kinh doanh với 3 kiểu dáng: hoa cắt cành, cây đã thành thục trong chậu treo hay bám trên giá thể và cây lan con từ 10 - 15 cm

Trầm trắng (Dendrobium nestor var alba) là một loài lan bản địa vô cùng

quý giá của Việt Nam Chúng không chỉ quý bởi vẻ đẹp, hương sắc hay độ bền hoa

mà còn quý bởi sự khan hiếm nguồn cây trong tự nhiên Sự săn lùng và khai thác bừa bãi đã làm chúng dần suy kiệt trong tự nhiên hơn nữa trên thị trường thì rất ít ỏi

và giá thành rất cao dẫn đến tình trạng phá rừng bừa bãi, ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường tự nhiên của nhiều loài Để khắc phục những vấn đề trên, chúng tôi

đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro giống lan hoàng thảo Trầm trắng (Dendrobium nestor var alba)”

- Tạo được nguồn vật liệu ban đầu

- Xác định được phương thức và môi trường nuôi cấy phù hợp trong giai đoạn nhân nhanh protocorm

- Xác định môi trường phù hợp trong giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh

- Xác định được phương pháp huấn luyện cây và giá thể thích hợp cho sự phát triển của cây con ngoài vườn ươm

+ Ý nghĩa của đề tài

- Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở để xây dựng và hoàn thiện quy trình

nhân nhanh giống lan Trầm trắng trong điều kiện in vitro, góp phần bảo vệ, lưu giữ

giống lan quý và giải quyết khó khăn về nguồn cung ứng giống cây cho thị trường

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Nguồn gốc, phân bố, phân loại và giá trị của phong lan

Cây hoa lan được biết đến đầu tiên ở phương Đông Theo tác giả Bretchacidor thì từ đời vua Thần Nông (2800 TCN) ở Trung Quốc, loài lan rừng đã được dùng làm thuốc chữa bệnh Sau đó cùng với vẻ đẹp và hương thơm của nó kết hợp với công dụng chữa bệnh nên loài này đã có mặt ở châu Âu Tại đây, người ta

đã tiến hành nghiên cứu khá công phu và tỉ mỉ Pharatus (376-285 TCN) được coi là cha đẻ của ngành lan học, vì ông là người đầu tiên dùng từ Orchids để chỉ một loài hoa lan củ tròn Sau đó là Linne (1707 - 1778) và Robiet Bron (1773 - 1858) là những người đầu tiên phân biệt rõ ràng họ lan và các họ thực vật khác Còn người đặt nền tảng cho môn học về hoa lan là Joanlind (1779 - 1885) Năm 1836, ông công bố tài liệu (A Tabuler View of the Tribes of Orchidea) để sắp xếp loài và chi thuộc họ lan Tên của họ lan do ông đưa ra được dùng đến ngày nay (dẫn theo Trần Hợp, 1990)

Ở Việt Nam, dấu vết những nghiên cứu về lan ở buổi đầu không rõ rệt lắm, có

lẽ người đầu tiên khảo sát về lan là nhà truyền giáo Bồ Đào Nha Joanisde Loureiro, ông

đã mô tả cây lan Việt Nam trong cuốn “Flora de cochin chinesis” (1789)

Năm 1972, Phạm Hoàng Hộ trong bộ “Cây cỏ Việt Nam” (quyển II) đã mô

tả kèm hình vẽ 289 loài lan gặp ở Việt Nam (Phạm Hoàng Hộ, 1993)

Năm 1992, Gunnar Seidenfaden người Đan Mạch đã phát hành cuốn “Hoa lan tại Đông Dương” gồm 200 giống và 2000 loài, trong đó có khoảng 136 giống và

720 loài của Việt Nam

Theo Phạm Hoàng Hộ (1993), Việt Nam có tới 755 loài lan

Trên khắp trái đất, hầu như nơi nào có thực vật là có phong lan nhưng số lượng nhiều ít khác nhau liên quan mật thiết đến độ cao Mỗi loài có một cách phân

bố và phát triển rất riêng biệt về kiểu dáng và kích cỡ, sự khác biệt đó không chỉ vì xuất xứ từ các lục địa khác nhau mà còn có khi ở ngay trong một vùng địa lý vài kilomet vuông

Về lịch sử phân loại, họ lan đến nay đã được biết khoảng 200 năm Theo hệ

thống phân loại thực vật, cây hoa lan thuộc họ lan (Orchidaceae), bộ lan (Orchidales), phân lớp hành (Lilidae), lớp một lá mầm (Monocotyledonae), ngành ngọc lan - thực vật hạt kín (Magnoliophyta) (Trần Hợp, 1990; Nguyễn Tiến Bân, 1997)

Trước kia, họ phong lan được chia làm 3 họ phụ (Orchidadeae,

Cypripedicideae, Apostasiscideae) Gần đây, do phân tích hoa đầy đủ hơn và đi sâu vào đặc tính di truyền, các nhà khoa học đã chia họ phong lan thành 6 họ phụ (Nguyễn Nghĩa Thìn, 1997):

Về giá trị của cây phong lan, trước hết phải kể đến giá trị trên phương diện thẩm mỹ và kinh tế

Hoa lan được nhiều người yêu thích, bởi lẽ đây là loài hoa có cấu trúc rất kiêu

kỳ và phức tạp, những trạm trổ rất tinh vi, đặc biệt ở bộ phận môi Màu sắc của hoa được pha trộn một cách hài hòa, cân đối, lắm khi lại hiện lên những nét tương phản rõ rệt, hay chìm lắng và cuốn hút Khác với các loài ký sinh thông thường có tác động hủy hoại ký chủ, đa số các loài lan có lối sống phụ sinh chỉ xem cây chủ làm giá thể

Vì thế, không phải ngẫu nhiên mà ông cha ta đã dùng cây lan biểu hiện cho người quân tử “Mai, Lan, Cúc, Trúc”, một đạo đức cao quý của dân tộc Việt Nam

Về mặt kinh tế, người ta đã thống kê, ở các nước xuất khẩu hoa lớn như Thái Lan, Đài Loan, Hà Lan, Úc, Nhật Bản,…doanh thu từ lan đạt vài trăm triệu USD/ năm Còn ở Việt Nam, theo các chuyên gia về lan, nghề trồng lan sẽ đem lại một lợi

nhuận không nhỏ cho người dân Theo tính toán của Bộ Nông nghiệp và Phát triển

nông thôn, nếu trồng phong lan cắt cành loài Dendrobium và Mokara, mỗi ha đất

trồng có thể cho thu nhập 500 triệu - 1 tỷ đồng/năm, cao hơn nhiều lần so với trồng lúa và một số hoa màu khác

Ngoài phương diện thẩm mỹ và kinh tế, cây lan còn có nhiều giá trị khác Với

giống Anoectochilus còn gọi là “Jewel Orchids” thì lá được dùng làm rau, một món ăn quen thuộc của người Mã Lai và Indonesia Trong số các loại thuộc giống Blettia,

Cattleya, Renanthera, giả hành và lá được dùng làm trà và thuốc Thổ dân Niu Ghinê

dùng Dendrobium utile để dệt làm kiềng đeo tay như một thứ đồ trang sức, Một số loài trong chi lan Hoàng thảo (Dendrobium) dùng làm thuốc chữa sốt nóng, kém ăn,

khô cổ, giảm thị lực,… vì chúng chứa nhiều alkaloid có giá trị chữa bệnh

1.2 Đặc điểm thực vật học chi lan Hoàng thảo

1.2.1 Rễ

Sự đa dạng về hình thái cấu trúc rễ đã làm cho chi lan Hoàng thảo phù hợp với điều kiện sống như khi sống trong đất thì rễ mập, thân rễ bò dài (Trần Hợp, 2000) Rễ của các đại diện chi Hoàng thảo là rễ khí sinh, thường mảnh, hình trụ, màu xanh và chuyển thành nâu khi già, chúng thường ôm lấy giá thể hoặc buông thõng xuống Ở một số loài sống bám lơ lửng trên vỉ thân cây gỗ làm nhiệm vụ lấy nước, muối khoáng, hấp thu dinh dưỡng, chúng được bao bọc bởi lớp mô hút ẩm dày bao gồm cả những lớp tế bào chết chứa đầy không khí do đó nó ánh lên màu xám bạc Chiều dài rễ từ 0,1 - 0,3 cm, rễ thường mọc ra từ phần gốc của thân hoặc

đôi khi có thể ở mấu thân của một vài loài (D Bilobulatum, D Parcum, )

1.2.2 Thân

Các đại diện của chi Hoàng thảo rất dễ nhận biết ngoài thiên nhiên Đó là các cây thân thảo mọc cụm, đứng thẳng hoặc rủ thõng, phân đốt, sống phụ sinh trên các cây gỗ hoặc một số sống bám trên đá, trong rừng ẩm Chi lan Hoàng thảo thuộc nhóm đa thân (sympodial) với nhiều giả hành Đây là nhóm bao gồm các cây tăng trưởng liên tục nhưng có chu kỳ nghỉ sau những mùa sinh trưởng Chúng vừa có thân thật vừa có giả hành, giả hành tuy là thân nhưng lại chứa diệp lục, dự trữ nước

và nhiều chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của giả hành mới Cấu tạo giả

hành gồm nhiều mô mềm chứa đầy dịch nhầy, phía ngoài có lớp biểu bì với vách tế bào dày, nhẵn bóng bảo vệ để tránh sự mất nước do sức nóng của mặt trời Đa số các củ giả hành có màu xanh nên nó cùng với lá làm nhiệm vụ quang hợp (Trần Hợp, 2000)

Thân của các đại diện trong chi Hoàng thảo đều phân đốt, hình trụ, hình con suốt, hình chùy hoặc hình trứng, có chiều dài thay đổi từ 2 - 3cm đến 120cm hoặc đôi khi hơn, kích thước phổ biến là 20 - 50cm Lát cắt ngang thân có thể là hình tròn, bầu dục, đôi khi hình 3 cạnh nhưng được gọi chung theo kích thước ngang này

là chiều dày, thay đổi từ 0,3 - 1,5cm nhưng đa số hay gặp là khoảng từ 0,5 - 1 cm

Thân có thể mảnh (sect Grastidium, sect Trongyle), đôi khi dẹt bên (sect Aporum, sect Oxystophyllum) hoặc là dày mập lên (sect Chrysotoxae, sect Dendrobium, sect Superbientia) Phần dày mập lên của thân gồm một vài lóng ở sát gốc (sect

Crumenatae ) hoặc ở sát đỉnh (sect Bolbidium) còn đa số ở giữa thân đều dần lên

đến đỉnh và xuống phía gốc Đôi khi phần dày lên theo hình con suốt có 4 gờ sắc

(sect Chrysotoxae, sect Dendrobium, sect Crumenatae) Cá biệt ở vài loài chỉ có các mấu dày lên, còn lóng thì hầu như không làm thân có tràng hạt (sect Pendulum) hoặc sự dày lên là dần dần độc lập làm thành dạng đùi gà nối tiếp (D.nobile,

D wardianum) Phần tận cùng là gốc, nơi xuất phát của rễ thường là nhỏ mảnh

nhưng cũng không ít trường hợp phình to ra

1.2.3 Lá

Lá mọc thành hai dãy so le nhau, không có cuống mà chỉ có bẹ ôm thân, ít

khi không có bẹ (sect Bolbidium, sect Chrysotoxae) Lá phân bố suốt dọc thân nhưng ở nhiều đại diện lá tập trung 2 - 4 chiếc ở đỉnh thân (sect Chrysotoxae), cũng có khi phần đỉnh thân chỉ có hoa mà không có lá (D acinaciforme, D

dalatense) Lá thường tồn tại khi cây ra hoa nhưng ở nhiều loài lá rụng trước khi hoa nở Số lượng lá thay đổi nhiều có khi chỉ còn 3 - 5 lá, vài loài chỉ còn 1 - 2 lá

Lá thường cứng, dạng da bóng, ít khi nạc và mềm (sect Grastidium), bề mặt

thường nhẵn, đôi khi lá còn non bề mặt bẹ và lá có phủ lông cứng ngắn màu đen

sớm rụng (sect Formosae, sect Conostalix) Đa số lá có dạng lưng - bụng bình thường, đôi khi gặp vài đại diện có lá hình trụ (sect Strongyle, sect Crumenatae)

Ngoài ra còn gặp lá dẹt bên tức là đường sống lưng và bụng trở thành “mép lá”

nếu so sánh vị trí tương ứng với lá lưng - bụng bình thường (sect.Aporum, sect

Oxystophyllum) Lá nguyên, mép nhẵn, màu xanh có các gân hình cung Lá thường có hình mác, bầu dục, đôi khi hình kiếm, hình thuôn hoặc ít khi lá hình thoi dài, hình nêm Đỉnh lá nhọn hoặc tù, rất nhiều trường hợp lá xẻ 2 thùy nhọn,

tù hoặc tròn lệch nhau Chiều dài của lá thay đổi từ 1 - 19cm và chiều rộng từ 0,3 - 3,5cm Lá hình trụ thường có bề dày (từ 0,2 - 0,4cm)

Cằm hoa là một bộ phận được hình thành nhờ mép phần gốc 2 lá đài bên dính nhau và dính với thân cột Cằm có các hình bán cầu, hình túi đến hình cựa, hình trụ cong ít nhiều

Cánh môi: so với cánh đài, cánh hoa ít nhiều có kích thước và màu sắc khác biệt Tuy nhiên, ngay trong các cánh hoa thì cánh môi khác nhiều so với các thành phần còn lại của bao hoa cả về màu sắc, kích thước lẫn sự sắp xếp Trang trí đa dạng trên cánh môi như đốm, vạch, diềm tua, u lồi, đường sống, lông phủ chiếm vị trí khá quan trọng trong phân loại Nhiều đại diện có gốc cánh môi dính với chân cột tạo thành cựa

Cột: cột hay còn gọi là trụ nhị - nhụy (trụ) thường thấp, mặt trước hơi lõm lòng máng, đỉnh cột lõm để chứa khối phấn, hai mép đỉnh cột có 2 răng cột, phủ lên đỉnh cột là nắp bao phấn

Ở gốc cột có mỏ, thường là một phần phụ dạng màng nhô ra nhằm ngăn cách bao phấn với nhụy Chỗ thấp hất phía dưới cột là chân cột, thường hình tam giác thuôn và có tuyến mật Bao phấn hình mũ, bề mặt thường nhẵn hoặc có nhũ mịn, đôi khi có lông nạc bao phủ Khối phấn hình chùy, không có chuôi, số lượng là 4

xếp thành 2 cặp Bầu hạ thường nhỏ và thon dần xuống cuống hoa, ranh giới giữa bầu và cuống hoa không rõ rệt, bầu 3 ô và có rất nhiều noãn

1.2.5 Quả

Quả nang thường hình chùy hoặc hình con suốt, chứa rất nhiều hạt nằm xen lẫn những sợi lông mảnh Khi quả già gặp trời ẩm sợi này sẽ hút nước và trương lên, phá vỡ vỏ quả giải phóng hạt ra ngoài Hạt rất nhỏ hầu như không trọng lượng, bao quanh hạt là lớp màng dạng mắt võng, trong suốt chứa đầy không khí dễ dàng bay cùng hạt trong không khí nhờ gió

1.3 Đặc điểm sinh thái học chi lan Hoàng thảo

Hoàng thảo (Dendrobium) là một thế giới vô cùng phức tạp, ngay sự ra hoa

cũng thuộc loại khác nhau, được phân chia thành 2 nhóm: một nhóm gồm các loài

Dendrobuim ra hoa vào đầu mùa mưa do quá trình khô hạn trong mùa nắng, nhóm khác ra hoa vào dịp tết và hiện chưa được biết chắc chắn là do ảnh hưởng của quang chu kỳ, nhiệt độ hay cả hai yếu tố

Chi Dendrobium gồm nhiều loài thích nghi với các điều kiện sinh thái khác

nhau Có thể tạm chia chúng làm 2 nhóm chính: nhóm ưa lạnh và nhóm ưa nóng Yêu cầu ngoại cảnh của 2 nhóm này như sau:

1.3.1 Nhiệt độ

Nhóm Dendrobium ưa lạnh sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiệt độ lý tưởng

là 15oC gồm các giống được lấy từ vùng cao nguyên sống trên cao độ 1000m của

Việt Nam và Mianma, như các loài Vảy cá (D Linlleyi), Thủy tiên tím (D

Amabile ), Long nhãn kim điệp (D Fimbriatum) Các loài này nếu được trồng ở

nhiệt độ lớn hơn hoặc bằng 25oC thì cây vẫn sống nhưng phát triển kém và rất hiếm ra hoa

Nhóm Dendrobium ưa nóng gồm đa số các giống Dendrobium rừng của châu

Úc, Indonesia, Malaysia và các loài Dendrobium lai, nhiệt độ thích hợp cho các loài

này là 25oC Đặc biệt, các giống lai có thể chịu được nhiệt độ cao hơn nhiều

Ngoài ra còn có một nhóm Dendrobium trung gian có thể sống ở cả vùng

lạnh và vùng nóng nhưng thường các cây sống ở cùng lạnh thì sinh trưởng và ra hoa

nhiều hơn như D Primulinum, D Fanmeri, D Chrysotoxum, nhiệt độ lý tưởng của

các loài này là 20oC

1.3.2 Ẩm độ

Độ ẩm thích hợp giúp cho cây phát triển nhanh hơn nhưng hoa tươi và lâu

tàn Dendrobium cũng như đa số các giống lan khác chỉ phát triển tốt trong điều

kiện không khí ẩm nhưng thoáng khí, vào ban ngày cây cần độ ẩm khoảng từ 40

- 60% vào ban đêm độ ẩm thích hợp từ 60 - 90% cây sẽ phát triển tốt hơn Loại

giá thể quá ẩm và úng sẽ là điều kiện bất lợi cho sự sinh trưởng của Dendrobium

vì có thể bị thối toàn bộ bộ rễ, biểu hiện là các cây con mọc từ phần ngọn của thân (keiki) Với độ ẩm cao, lá và rễ cây sẽ có thể hút hơi nước trong không khí khi cần thiết

1.3.3 Ánh sáng

Dendrobium là giống ưa sáng, có thể trồng trong điều kiện ánh sáng trực tiếp

hay khuếch tán Ánh sáng hữu hiệu cho giống Dendrobium là 70% vì vậy giàn che

với độ che sáng 30% dưới đất và 40% ở trên cao với cường độ ánh sáng từ 15000-

30000 lux rất thích hợp cho sự phát triển của Dendrobium ( Trần Duy Quý, 2005)

Ngoài ra, thời gian chiếu của ánh sáng trong ngày là điều kiện quyết định sự

ra hoa của một số loài chịu ảnh hưởng của quang chu kỳ như: Giả hạc, Long tu, Kim điệp chỉ ra hoa với điều kiện ánh sáng có thời gian chiếu ít hơn 10h trong ngày Tuy nhiên, một giả thiết khác cần được nghiên cứu là có thể các loài này ra hoa do

sự lạnh kéo dài vào tháng 12 Loài lan Thạch hộc chỉ cần bị lạnh trong vài giờ, cây

sẽ trổ hoa sau 1 tuần lễ

ẩm Cũng có thể trồng cây lan Dendrobium với căn hành cách đáy chậu khoảng

3cm, rồi rải thật thoáng xung quanh căn hành là một số rễ bèo lục bình được phơi sạch Với cách trồng này thì kích thước chậu và cây phải thật tương xứng Tuy

nhiên, giá thể than và gạch nung vẫn tỏ ra hiệu quả nhất đối với các loài

Dendrobium

Dendrobium là một giống lan rất nhạy cảm khi sống trên giá thể không thích thích hợp cho việc phát triển của lan và biểu hiện một số cây con sẽ được mọc trên ngọn thân của các giả hành Khi có điều này xảy ra cần phải tiến hành thay chậu, vì chắc chắn các giá thể trong chậu đã không còn tác dụng Hiện tượng này là do giá thể đã bị quá ẩm, lắng cặn xuống đáy chậu tạo thành một lớp mùn úng nước, chính lớp mùn này là điều kiện sinh sống thuận lợi của côn trùng phá hoại bộ rễ cây lan

Do bản năng sinh tồn cây lan sẽ phản ứng bằng cách mọc ra một số cây con trên ngọn để duy trì nòi giống

Quan sát hiện tượng các cây con mọc trên chồi ngọn cũng sẽ giúp các nhà vườn, người sản xuất kiểm tra lại cách trồng, điều kiện nước và phân bón Ngoài ra, với chu kỳ 2 năm 1 lần nên thay chậu cho lan vì trong quá trình sinh trưởng, các chậu thường bị đóng rêu, giá thể bị hư hao, mất cân đối (cây quá lớn, chậu quá nhỏ không đủ không gian để tạo độ thoáng cho rễ cây phát triển một cách tốt nhất)

1.3.5 Mùa nghỉ

Khái niệm về mùa nghỉ đối với một số giống lan nói chung và Dendrobium

nói riêng là hoàn toàn mới, ở miền Nam Việt Nam, từ lâu các nhà vườn ở đây đều trồng lan không có mùa nghỉ

Mùa nghỉ là thời gian vô cùng cần thiết đối với các giống Dendrobium, nó

quyết định phẩm chất hoa của mùa tới Tùy địa phương và việc chọn thời gian nghỉ

cho Dendrobium là khác nhau, như ở thành phố Hồ Chí Minh, mùa nghỉ của

Dendrobium thường bắt đầu từ tháng 3 đến cuối tháng 4

1.4 Đặc điểm thực vật học và sinh thái học của lan Hoàng thảo Trầm trắng

(Dendrobium Nesto var alba)

Là loài phong lan sống phụ, đa thân, thân dài, buông thõng, dài 80 - 120cm Thân hình trụ, màu hanh vàng, trên thân có nhiều rãnh dọc, có nhiều bẹ lá bao bọc lấy đốt thân Lá hình thuôn dài, dày, cứng, màu xanh đậm, đầu lá xẻ 2 thuỳ tù lệch Khi lá phát triển hết cỡ thường hơi quăn và có nếp nhăn Kích thước lá: (10 - 13) x (2 - 3)cm Rễ chính to, mập, phân nhánh mạnh

Chùm hoa mọc ra từ các đốt thân trên các thân đã rụng lá, mỗi chùm từ 2 - 4 bông, kích thước: 6 x 5cm Hoa thường tập trung ở phần ngọn, khoảng 1/3 chiều dài thân tính từ ngọn, mỗi nách hoa ra 1 – 2 bông, cá biệt có tới 3 bông Hoa màu trắng, cánh hoa hơi nhọn và dài, thường cụp không mở căng hết, trông buồn buồn Thơm đặc trưng mùi giả hạc rừng

Thời gian nở hoa: tháng 3 âm lịch, độ bền: 20 ngày

Hình 1: Lan trầm trắng ( sưu tầm)

Hiện nay trên thị trường trong nước và ngoài nước, lan Dendrobium nestor var

alba có thể coi là một loài quý hiếm, có giá trị thẩm mỹ và giá trị kinh tế cao

1.5 Tình hình sản xuất hoa lan ở Việt Nam và trên thế giới

1.5.1 Tình hình sản xuất hoa lan trên thế giới

Hoa lan (Orchidaceace) là một trong những đỉnh cao của sự tiến hóa của các

loài cây có hoa Hoa lan được con người biết đến từ rất sớm Ở châu Á, người Trung Quốc biết thưởng thức và chăm sóc hoa lan sớm hơn nhiều so với người châu

Âu Tuy nhiên, để biến hoa lan thành mặt hàng có giá trị xuất khẩu thì người châu

Âu mới là những người đi tiên phong Từ khi con người biết ứng dụng những thành tựu khoa học kỹ thuật, ngành trồng lan có những bước tiến bộ nhảy vọt Đầu tiên, phương pháp cộng sinh nấm để gây sự nảy mầm được Noel Bernad thực hiện năm

1904, nhưng cho đến khi phương pháp gieo hạt không cộng sinh trong phòng thí

nghiệm được Knudson nghiên cứu năm 1922, ngành trồng lan mới thật sự có những chuyển biến rõ rệt Sau đó, phương pháp cấy mô lan đa thân đã gây lạc quan cho tất

cả các nhà trồng lan trên thế giới (dẫn theo Nguyễn Công Nghiệp, 2002) Phương pháp này có thể nhân giống lan với tốc độ rất cao: 4 triệu cây con/năm, với các vốn ban đầu chỉ là một chồi non, được Morel khám phá Lúc này, ngành trồng lan có những chuyển biến với nhịp độ chưa từng thấy để đi sâu vào lĩnh vực thương mại (dẫn theo Nguyễn Công Nghiệp, 2002)

Ngày nay, với sự tiến bộ vượt bậc của ngành thực vật học, chính phủ Pháp

đỡ đầu giúp kỹ nghệ sản xuất lan với phương pháp phân chia (meristem, cũng như cloning) Nhà sinh vật học George Morel, người hướng dẫn chương trình thí nghiệm meristem với giống khoai tây, đã đưa ra thí nghiệm nuôi cấy meristem cho các giống lan Kết quả thật bất ngờ, năm 1956, ông dùng một tế bào trên chóp của một chồi lan con mới nhú từ giò lan mẹ đem cấy trên một môi trường nuôi cấy có chất các dinh dưỡng và ông đã tách ra được vô số các cây lan con Phương pháp này giúp sản xuất ra những cây lan con giữ được đặc tính di truyền của cây lan mẹ, trong lúc đó việc gieo hạt lan lại tạo ra những cây lan con khác với cây mẹ Áp dụng phương pháp của Morel, Michel Vacherot và Maurice Lecouffe đã tiến hành sản xuất và cho ra đời hàng loạt các cây lan con theo phương pháp này Ngày nay, ngoài một số các nhà gây giống lan chuyên nghiệp ở khắp châu Âu, châu Á, các trại lan ở

Mỹ, Châu Phi, Hawaii, Singapore, Thái Lan đã đạt đến mức sản xuất lan kỹ nghệ Ở

Mỹ, nhất là ngày lễ Valentine, Secretary Day và dạ vũ tốt nghiệp Prom, hàng năm tiêu thụ đến 20 triệu lan cài áo (brioche) hoặc bouquet

Phong lan dần được xuất khẩu và lưu thông như một ngành thương mại và được phát triển nhanh ra nhiều nước Ngày nay, các nước phát triển như Pháp, Mỹ,

Hà Lan, Thái Lan, Nhật Bản, Đài Loan, Úc, Trung Quốc,…đã có nhiều nghiên cứu,

sử dụng nhiều thành tựu khác nhau của ưu thế lai, nuôi cấy bao phấn, nuôi cấy mô

tế bào, kỹ thuật di truyền,…và kết quả là đã tạo ra hàng nghìn giống phong lan, địa lan có màu sắc sặc sỡ, hương thơm quyến rũ đem lại lợi ích kinh tế rất lớn cho những nước này, trung bình 100 - 500 triệu USD/ năm Nhiều nước xuất khẩu hoa lan lớn như Thái Lan, Đài Loan, Hà Lan, Úc, Nhật Bản và Trung Quốc đạt doanh

thu vài trăm triệu USD/ năm

Thái Lan: Nhờ khả năng thực hiện công nghệ mới trong nuôi cấy mô và lai tạo,

với giá lao động thấp, khí hậu tốt, giao thông tốt cho phép Thái Lan sản xuất quanh năm và xuất đi 50 nước trên thế giới Hiện nay, Thái Lan là nước đứng đầu thế giới về xuất khẩu hoa lan, đạt 110 triệu USD trong năm 2003 Thái Lan có 18 phòng nuôi cấy

mô hoa lan thương mại hoạt động ở Băng Cốc và các vùng phụ cận Hàng năm, nước

này sản xuất 31,6 triệu cây con trong đó Dendrobium chiếm 80%, Mokara 5%, còn lại

là các loài lan khác

Đài Loan: Chú trọng đầu tư nhiều vào nuôi trồng Phalaenopsis và chọn tạo

nhiều giống mới, đem lại doanh thu hàng năm trên 9,3 tỷ Đài tệ Hiện nay, đã tạo ra được một số giống lan quý có khả năng cắt hoa và trồng trong chậu

Trung Quốc: Là nước có truyền thống tuyển chọn và tạo các giống lan

kiếm Họ sử dụng các phương pháp lai hữu tính thu quả, sau đó gieo và tuyển chọn các loài hoa đáp ứng được màu sắc, kiểu dáng rồi sử dụng kỹ thuật nhân giống in vitro và in vivo để tạo ra một số lượng lớn các cây, sau đó cho ra hoa đồng loạt tạo

ra sản phẩm hàng hóa có giá trị kinh tế cao, giá từ 5 - 10 USD/cành

Ở Singapore, nghề trồng lan xuất khẩu trên quy mô lớn bắt đầu từ năm

1987 Nhà nước đã thấy rõ tiềm năng xuất khẩu loại Lan này trên thị trường thế giới nên đã mở rộng trang trại trồng hoa lan Hiện nay, Singapore chiếm 12% thị trường kinh doanh phong lan trên thế giới

Nhật Bản: Đã đầu tư 6,6 triệu USD cho Thái Lan để mở rộng cơ sở sản

xuất với công suất 10 triệu cây hoa mỗi năm và hiện nay Nhật Bản cũng là khách hàng lớn nhất của Singapore với khả năng tiêu thụ 60% số cây lan nước này

1.5.2 Tình hình nghiên cứu, sản xuất và phát triển phong lan ở Việt Nam

Trước những năm 1986, nghề trồng hoa của Việt Nam chỉ tập trung ở một vài làng nghề ở Hà Nội, Hải Phòng, thành phố Hồ Chí Minh, Đà Lạt và một vài tỉnh miền Tây Nam Bộ Diện tích trồng hoa của Việt Nam theo số liệu thống kê năm

1993 chỉ chiếm 0,02% tổng diện tích đất nông nghiệp (khoảng 1.585 ha) Trong đó, diện tích trồng hoa lan chiếm 10%

Trong những năm gần đây, do sự phát triển chung của nền kinh tế, đời

sống nhân dân ngày càng được cải thiện từ đó nhu cầu chơi hoa ngày càng phát triển rộng rãi Thị trường WTO mở cửa kết hợp với chính sách sản xuất theo hướng hàng hoá xuất khẩu của nhà nước đã tác động mạnh mẽ, tích cực đến ngành sản xuất hoa nói chung và hoa lan nói riêng Sản xuất hoa lan ở Việt Nam tập trung theo 2 hướng chính:

- Sản xuất theo quy mô công nghiệp các loài lan mới lai tạo hoặc được nhập nội (lan công nghiệp)

- Khai thác và nuôi trồng các loài hoa lan bản địa (lan rừng)

Tuy nhiên, các chính sách đầu tư của nhà nước hầu hết chỉ tập trung vào mảng lan cắt cành và sản xuất cây con giống của một số loài lan công nghiệp như

Hồ Điệp (Phalaenopsis), Cát lan (Cattleya), Vũ Nữ (Oncidium), Hoàng Thảo

(Dendrobium) Các dự án đầu tư phát triển hoa cây cảnh của các tỉnh đều hướng tới sản xuất lan cắt cành, đặc biệt ở các tỉnh phía Nam Tại hội thảo về hiện trạng và hướng phát triển hoa lan trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh năm 2005, ông Nguyễn Thiện Nhân - Phó Chủ tịch thường trực Thành phố cho biết, với thế mạnh

là hoa nhiệt đới, lan cắt cành sẽ trở thành cây chủ lực của thành phố Hồ Chí Minh trong những năm tới Ở miền Bắc, một số cơ quan nghiên cứu như: Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Sinh học Nông nghiệp, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, trong những năm vừa qua cũng đã tập trung nghiên cứu các phương pháp nhân giống vô tính in vitro và cho ra đời mỗi năm hàng vạn cây con giống hoa lan có giá trị Viện Nghiên cứu Rau quả đã triển khai dự án “Hoàn thiện quy trình nhân giống

và sản xuất một số giống lan Hồ Điệp ở quy mô công nghiệp” và đã có sản phẩm đưa ra thị trường phục vụ người chơi Hải Phòng xây dựng khu Nông nghiệp công nghệ cao (Mỹ Đức, An Lão) với mục tiêu cụ thể: sản xuất 300000 cây giống hoa lan bằng công nghệ của Viện Sinh học nông nghiệp – Học viện Nông nghiệp Việt Nam

và của Hiệp hội hoa Thái Lan (Xây dựng khu Nông – Lâm nghiệp công nghệ cao tại trung tâm phát triển lâm nghiệp Hải Phòng (2003)) Tất cả những chính sách đầu tư trên đã đem lại hiệu quả to lớn thúc đẩy ngành sản xuất lan công nghiệp phát triển

và thu được nhiều thành tựu, đáp ứng nhu cầu trong nước và một phần được xuất ra thị trường quốc tế đem lại nguồn thu ngoại tệ cho quốc gia và thu nhập lớn cho

người trồng, người kinh doanh và người đầu tư vào lĩnh vực này

Khác với lan công nghiệp, lan bản địa (lan rừng) lại chỉ phát triển nhỏ lẻ và được nuôi trồng ở quy mô hộ gia đình, tập trung chủ yếu ở Hà Nội và một số vùng phụ cận

Xã Đông La - Hoài Đức - Hà Nội những năm gần đây trở nên nổi tiếng với nghề trồng lan, đây được coi là trung tâm nuôi trồng phong lan rừng lớn nhất miền Bắc Đến nay cả xã đã có 52 hộ trồng lan, trong đó có hơn 30 hộ có diện tích vườn lan từ 500 đến 1000m2, tập trung nhiều nhất ở thôn Đông Lao và Đồng Nhân với những vườn lan như Huyền Chân, Trường Uyên, Thực Hà, Tiền Hảo, Theo lãnh đạo xã Đông La, nghề trồng lan đã đóng góp đáng kể cho phát triển kinh tế của địa phương, tạo việc làm, tăng thu nhập cho người lao động Trung bình mỗi năm, trừ chi phí, một hộ trồng lan cũng có lãi hàng trăm triệu đồng, gấp nhiều lần nghề nông nghiệp khác

Bên cạnh Đông La, một số địa phương như Gia Lâm, Đông Anh (Hà Nội), Văn Giang (Hưng Yên), Mộc Châu (Sơn La), Phổ Yên (Thái Nguyên) cũng đang có nhiều hộ gia đình tập trung đầu tư vào sản xuất và nuôi trồng phong lan bản địa, tuy nhiên quy mô diện tích các vườn lan này khá nhỏ, chỉ từ 300 - 500m2 Số lượng loài cũng rất ít, phổ biến là các loài Đai Châu, Đuôi Cáo, Hoàng Thảo, Quế Lan Hương

và một số loài lan Hài

Nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm quanh năm cho nên chủng loại lan ở Việt Nam rất phong phú Theo các chuyên gia về hoa của Học viện Nông nghiệp Việt Nam, với khoảng trên 800 loài lan hiện có, khí hậu thích hợp và nhiều nguyên liệu làm giá thể tốt cho cây sinh trưởng, Việt Nam có thể trở thành một nước sản xuất hoa phong lan lớn trong khu vực.Tuy nhiên, sản xuất hoa lan ở Việt Nam mới chỉ phát triển mạnh mẽ ở các tỉnh phía Nam, đặc biệt là Đà Lạt và thành phố Hồ Chí Minh

Hiện nay mới chỉ có một số công ty lớn, trong đó có những công ty nước ngoài trồng phong lan tại Đà Lạt, thành phố Hồ Chí Minh, Đồng Nai với diện tích khoảng 50 - 60 ha/ một doanh nghiệp Một vài địa phương khác phong lan chỉ mới trồng ở quy mô gia đình, trên diện tích vài mét vuông, cá biệt mới có vài hộ trồng

trên 1 - 2 ha

Theo tính toán, mỗi năm Việt Nam phải chi hàng tỷ đồng để nhập phong lan

từ các nước láng giềng cho nhu cầu nội địa Chỉ tính riêng tại thành phố Hồ Chí Minh, năm 2003 doanh số kinh doanh hoa lan và cây cảnh mới đạt 200 - 300 tỷ đồng, nhưng chỉ trong quý I năm 2006, doanh số này đã đạt 400 tỷ đồng; các cơ sở kinh doanh hoa lan, cây cảnh tăng nhanh từ 264 cơ sở năm 2003 lên trên 1000 cơ

sở Riêng phong lan mỗi năm ở thành phố này cũng đã tiêu thụ trên 1 triệu cây

Lĩnh vực kinh doanh lan ở Việt Nam còn rất non trẻ, mới thực sự bắt đầu được hơn 10 năm trở lại đây Theo ông Đồng Văn Khiêm - Giám đốc công ty Phong lan xuất khẩu thành phố Hồ Chí Minh thì khó khăn lớn nhất là nhà nước chưa có chính sách phát triển ngành lan, chưa có một văn bản nào để khuyến khích, chính sách thuế không rõ ràng, Bên cạnh đó, việc xuất khẩu lan hiện còn qua ủy thác, không tạo được sự chủ động cho nhà sản xuất

Để có thể đáp ứng nhu cầu nội địa, tiến vào thị trường phong lan thế giới, ngoài việc khắc phục những khó khăn trên, ngành công nghiệp hoa lan của Việt Nam còn phải quan tâm rất nhiều đến vấn đề về tạo giống, công nghệ sản xuất, canh tác, công nghệ sau thu hoạch, đóng gói, kiểm dịch và đầu tư mở rộng cơ sở hạ tầng cho sản xuất loài hoa này

1.6 Các phương pháp nhân giống lan Hoàng Thảo

1.6.1 Phương pháp truyền thống

1.6.1.1 Phương pháp nhân giống hữu tính

Phương pháp nhân giống hữu tính là phương pháp nhân giống bằng hạt

* Những ưu điểm của phương pháp nhân giống bằng hạt

- Kỹ thuật đơn giản, dễ làm

- Hệ số nhân giống cao

- Tuổi thọ của cây trồng bằng hạt thường cao

- Cây trồng bằng hạt thường có khả năng thích ứng rộng với điều kiện ngoại cảnh

* Những nhược điểm của phương pháp nhân giống bằng hạt

- Cây giống trồng từ hạt thường khó giữ được những đặc tính của cây mẹ

- Cây giống trồng từ hạt thường ra hoa kết quả muộn

1.6.1.2 Phương pháp nhân giống vô tính

Phương pháp chiết cành

• Cơ sở khoa học của phương pháp là sau khi ta tiến hành khoanh vỏ, dưới ảnh hưởng của các chất nội sinh trong tế bào như auxin, cytokinin khi gặp những điều kiện nhiệt độ, độ ẩm thích hợp thì dễ được hình thành và chọc thủng biểu bì đâm ra ngoài

Những ưu điểm của phương pháp chiết cành

- Cây giống giữ nguyên được đặc tính di truyền của cây mẹ

- Cây sớm ra hoa kết quả, rút ngắn được thời gian kiến thiết cơ bản

- Thời gian nhân giống nhanh

- Cây trồng bằng cành chiết thường thấp, phân cành cân đối, thuận lợi cho chăm sóc và thu hoạch

Những nhược điểm của phương pháp chiết cành

- Hệ số nhân giống không cao, chiết nhiều cành trên cây sẽ ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển của cây mẹ

- Đối với một số giống cây ăn quả, dùng phương pháp chiết cành cho tỷ lệ

ra rễ thấp

Phương pháp giâm cành

• Giâm cành là phương pháp nhân giống cây trồng bằng cơ quan sinh dưỡng Cơ sở khoa học của phương pháp tương tự như nhân giống bằng phương pháp chiết cành

Những ưu điểm của phương pháp giâm cành

- Giữ nguyên được đặc tính di truyền của cây mẹ

- Tạo ra cây giống sau trồng sớm ra hoa kết quả

- Thời gian nhân giống nhanh

- Có thể nhân nhiều giống mới từ một nguồn vật liệu giới hạn ban đầu Phương pháp tách chiết cây lan con (cây keiki)

• Keiki là tiếng Ha Uy Di (Hawaii) có nghĩa là bé con (baby) Những cây con này thừa hưởng đặc tính di truyền nên hoa lá sẽ giống y như cây mẹ

Khi cây mọc quá mạnh, tình trạng này thường xẩy ra, với các loài đơn thân như

cây Renanthera citrina bên cạnh ra tới 3 cây con, một ở trên thân và 2 ở dưới gốc

Những cây Dendrobium khi cần khô nước để chuẩn bị ra hoa, chúng ta lại

tưới quá nhiều thường sinh ra nhiều cây con ở trên cành

Còn những cây Dendrobium ở vào tình trạng sắp chết, vì bản năng sinh tồn,

cây mẹ phải sinh ra cây con trước khi từ giã cuộc đời Muốn tách những cây con này ra, nên đợi tới khi cây có tối thiêu 3 rễ, nhưng rễ này phải dài 3 – 4cm và rễ phải có đầu xanh Nếu rễ quá ngắn hoặc không có đầu xanh nên lấy rêu phủ lên để tăng thêm độ ẩm, rễ sẽ mọc dài ra

Khi đó nhẹ nhàng tách cây con ra khỏi cây mẹ, hay tốt hơn là lấy dao hay kéo sắc, đã khử trùng cắt ở dưới gốc cây keiki một đốt hay là nếu nhiều cây nên cắt luôn một khúc, sau đó chấm vào thuốc mọc rễ và đem trồng với hỗn hợp: 80% vỏ thông, 10% than củi và 10% perlite đã ngâm trong nước 24 giờ Để vào chỗ rợp mát

và một tuần sau mới tưới rất ít Sau đó dần dần mang cây ra chỗ sáng hơn và khi thấy cây mọc mạnh, tưới nước và bón phân đều đặn

Không nên tách cây con vào cuối thu hay mùa đông vì thời gian này cây không mọc nên thường hay bị chết

1.6.2 Phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật

• Nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào là phương pháp nhân giống vô tính tiên tiến nhất hiện nay Bộ phận để nhân giống có thể là ngọn cây, ngọn cành, nhánh một phần của lá, hoa, rễ cây Nhân giống hoa ở các nước tiên tiến đều sử dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào đối với cây hoa lan, cúc, cẩm chướng, đồng tiền, loa kèn, layơn…

Ưu điểm của phương pháp nhân giống bằng in vitro

- Cây được sản xuất từ nuôi cấy mô tế bào là sạch bệnh, cây sinh trưởng,

phát triển khoẻ, độ đồng đều cao

- Hệ số nhân giống cao so với các phương pháp nhân giống khác

Nhược điểm của phương pháp nhân giống bằng in vitro

- Phải đầu tư các phương tiên kỹ thuật, hoá chất

- Giá thành cây con giống cao, khó áp dụng

1.7 Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô tế bào hoa lan

1.7.1 Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô hoa lan trên thế giới

Hoa lan là một trong những loại cây trồng trong chậu và hoa cắt quan trọng nhất trên toàn thế giới, từ rất lâu vẻ đẹp hoàn hảo của nó đã mê hoặc và cuốn hút hàng ngàn người Họ lan, một trong những họ lớn nhất trong thực vật có hoa, với hơn 800 chi và 25 – 35000 loài (Arditti 1992) Đối với người Hy Lạp, hoa lan là biểu tượng cho nghị lực (dẫn theo Jaime A Teixeira da Silva*, 2013)

Trồng hoa lan là một trong những ngành công nghiệp quan trọng ngoài vườn ươm thu lại lợi nhuận hàng tỷ đô la, hiện nay với sự ra đời của công nghệ sinh học, thực vật mong muốn nhất là có thể nhân giống bằng công nghệ nuôi cấy mô như đã thực hiện đối với lan Hoàng Thảo, chiếm khoảng 80% tổng số loài lan nhiệt đới, thường đươc nhân theo hướng tạo protocorm (Griesbach 2003; Saiprasad et al., 2004) Địa lan là loài hoa quan trọng nhất trong thương mại, nhất là các giống lai có

nguồn gốc từ 44 loài gốc (Obara - Okeyo and Kako 1998) Hoa lan Monopodial như

Vanda , Chi Hỏa hoàng, Rhyn- chostylis, Aranda, Renanthera và Neofinetia, và các

giống lai chung của các liên chi được trồng rộng rãi, chúng được nhân giống bằng nuôi cấy mô đã vượt qua sự nhân giống bằng phương pháp thông thường (dẫn theo Jaime A Teixeira da Silva*, 2013)

Kinh doanh xuất khẩu / nhập khẩu trên thế giới của hoa cắt hoa phong lan vượt quá 150 triệu USD vào năm 2000 (Laws, 2002) Châu Á đứng đầu thị trường thương mại thế giới, với Thái Lan xuất khẩu 50 triệu USD với hoa lan cắt, tiếp theo

là Singapore, Malaysia và New Zealand (Hew 1989; Goh and Kavaljian 1989) (dẫn theo Jaime A Teixeira da Silva*, 2013)

Ngày nay với sự phát triển nhanh chóng của công nghệ sinh học thực vật và những tiến bộ của kỹ thuật phân tử đã đưa công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật phát triển với những bước tiến dài Cho đến năm 2005, chỉ có một đánh giá riêng lẻ được công bố (Sheehan 1984) mô tả sự phát triển trong thực vật phong lan, là nhân giống và sinh lý trong khi Arditti (1984) nhìn vào bối cảnh lịch sử của lai tạo giống phong lan, sự nảy mầm của hạt giống và nuôi cấy mô Hew và Clifford (1993) đã đưa ra một mô tả rất hời hợt và thoáng qua của việc sử dụng chất điều hòa sinh

trưởng thực vật (PGRs) trong nuôi cấy mô phong lan và các ngành công nghiệp hoa cắt cành (dẫn theo Jaime A Teixeira da Silva*, 2013)

Sự cần thiết cho quá trình nhân giống hầu hết của các kiểu gen hoa lan ưu tú

đã được lựa chọn và thực tế là xét về mặt kinh tế một số loài lan phát triển chậm

theo hướng tạo protocorm dẫn đến sự ra đời của phương pháp in vitro mới công

nghệ tạo mô sẹo từ cuống hoa và chùm hoa, lá và thân cây, đặc biệt là theo phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào (Prakash et al., 1996) Sự cần thiết phải bảo tồn, cải thiện và nghiên cứu sinh lý học của hoa lan cũng là một động lực cho các nghiên cứu nuôi cấy mô của họ (Arditti and Ernst 1993) Cây con thu được từ những cấy qua tiền protocorm (PLBs) hoặc thông qua trung gian là mô sẹo (Philip and Nainar 1986; Begum et al., 1994a) ngày càng được phát triển trên các môi trường có bổ sung dịch chuối, nước dừa hoặc nước ép cà chua, mặc dù vậy nhìn chung mô sẹo hoa lan thường bị chết hoặc tăng trưởng chậm (Kerbauy 1984a; Philip và Nainar 1986; Kerbauy 1991; Colli và Kerbauy 1993; Begum et al 1994) Các tiền PLB, đầu tiên được mô tả bởi Morel (1960) có cấu trúc gần giống với protocorm nhưng được tạo ra bằng nuôi cấy mô hoặc tạo mô sẹo trong bình thí nghiệm PLBs của địa lan được tái sinh từ các tế bào biểu bì (Tanaka et al., 1975; Kim và Kako 1984; Lin 1987), nhưng Begum et al (1994a, 1994b) đã chỉ ra sự cảm ứng của mô sẹo và PLBs từ bên trong, mô nhu mô của PLBs Zhou (1995) cho rằng hyperhydric Doritaenopsis PLBs có công suất lớn hơn của sự khác biệt so với PLBs bình thường, nhưng thông qua việc bổ sung dịch khoai tây vào môi trường, PLBs bình thường có thể được phục hồi Phân chia tế bào PLB xảy ra từ các lớp tế bào bên ngoài vào trong, và tần số của phân chia tế bào tăng dần theo thời gian nuôi cấy trong BA hoặc phương tiện truyền thông PGR - miễn phí; tần số của phân chia tế bào nghiên về hai bên đã thống trị trong ba lớp tế bào bên ngoài, trong khi nhìn chung tế bào phân chia cao hơn ở các lớp tế bào bên trong Fujii et al (1999b) (dẫn theo Jaime A Teixeira da Silva*, 2013)

Lan Hồ điệp, một chi thuộc họ lan, là giống đầu tiên được nhân giống trong ống nghiệm, trong khi đó địa lan là giống đầu tiên được nhân theo phương pháp tạo chồi, và một phân tích toàn diện các điều kiện cần thiết cho việc nuôi cấy mô và vi

nhân của các loài lan khác nhau đã được xem xét ở những nơi khác (Arditti and Ernst, 1993)

Cả hai môi trường rắn và lỏng rất thích hợp cho sự phát triển của hoa lan, nhìn chung là nhanh hơn và sâu rộng hơn, cả hai phương pháp nuôi cấy động và

tĩnh đều thích hợp, trừ Paphiopedilum (Arditti Ernst, 1993) Sự chuyển động có thể

tạo ra các công nghệ mới như để loại bỏ tính phân cực, làm chậm sự phát triển của

rễ và chồi (Scully 1967; Wimber 1963), cải thiện thông khí, tăng diện tích bề mặt, tăng tốc độ pha loãng của các chất chuyển hóa độc hại (Ishii et al., 1976, 1979a), hoặc kích thích sự hình thành PLB (dẫn theo Jaime A Teixeira da Silva*, 2013) Hầu hết, công nghệ nuôi cấy mô tế bào cần chất điều hòa sinh trưởng cho sự tăng trưởng, tạo mô sẹo hoặc hình thành PLB, mặc dù lúc đầu nuôi cấy mô hoa lan thất bại do thiếu chất điều hòa sinh trưởng nhưng sau này nhiều nghiên cứu đã chứng minh nuôi cấy mô phong lan vẫn thành công mà không cần dùng chất điều hòa sinh trưởng (Morel 1960; Wimber 1963) Địa lan sống trên mặt đất, auxin được biết đến là chất điều hòa tăng trưởng kích thích ra rễ, trong khi đó cytokinin được biết đến là chất kích thích mọc chồi (Hasegawa et al 1985; Paek and Yeung 1991;

Lu et al 2001) Trong Campylocentrum burchellii, một phong lan có rễ, cho thấy

một khả năng sinh tổng hợp cao đối với acid nội sinh indole – 3 - acetic (IAA) và cytokinin trong một cơ quan duy nhất, với IAA/cytokinintỷ lệ thuận với auxin trong

rễ (Peres et al., 1997) Chất kháng auxin, trans - cinnamic acid (TCA) được sử dụng

để tạo chồi đỉnh từ trạng thái không hoạt của chúng, cho phép chúng phát triển thành chồi (Mosich et al., 1974) Ngoài auxin và cytokinin, nước dừa cũng được sử dụng trong nuôi cấy mô hoa lan, trong nước dừa có chứa một lượng lớn các chất hóa sinh phổ biến có thể hành động như là các yếu tố tăng trưởng cá nhân hoặc chung (Shantz and Steward 1952), như 1,3-diphenylurea, trong đó cho thấy hoạt động giống cytokinin, và zeatin riboside và zeatin (Letham 1974; Dix and Van

Staden 1982) Trong các nghiên cứu được tiến hành trên Dendrobium, Oncidium và

Cattleya, đã đánh giá được ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng (PGRs) tới quá trình tạo thành PLBs: 6-benzyl amino purine (6-BA) > kinetin > α – naphtyl acetic acid (α - NAA) > IAA > 2,4 axit -dichlorophenoxyacetic (2,4-D)> axit gibberellic

(GA3) (Saiprasad et al., 2002) Chowdhury et al., (2003) cho thấy sự kết hợp giữa

6-BA cùng với α-NAA là cần thiết cho sự hành thành mô sẹo trong Doritaenopsis,

trong khi NAA tăng cường sự hình thành của PLBs từ mô sẹo 6-BA và α-NAA có ảnh hưởng tốt tới quá trình hình thành mô sẹo và PLB của hai loại hoa lan

Dendrobium formosum (Nasiruddin et al., 2003) và Cymbidium pendulum(Vij et al.,

1994).Môi trường phát sinh hình thái là khác nhau giữa các loài, như quá trình tạo PLB giữa các loài là khác nhau trong các môi trường khác nhau Knudson C vừa là

môi tường tốt nhất cho hạt nảy mầm trong Spathoglottis plicata (Singh 1992),

Cymbidium (Torikata et al., 1965)., Cattleya (Boesman, 1962), và Dendrobium

(Mowe, 1973), sự có mặt của α-NAA trong môi trường tăng cường nảy mầm của

hạt đối với Cattleya, Cymbidium và Bletilla (Strauss and Reisinger, 1976) Ngược

lại, Alam et al (2002) nhận thấy môi trường MS là tốt hơn các Hyponex®,

Knudson C hoặc OKF1 trong nảy mầm của hạt Dendrobium transparens (dẫn theo Jaime A Teixeira da Silva*, 2013)

Sự lựa chọn của nguồn mẫu cấy đóng một vai trò quan trọng trong kết quả

của công nghệ nhân giống, trong đó, Phalaenopsis có thể đạt được thông qua việc

sử dụng chồi đỉnh làm mẫu nuôi cấy ban đầu (Intawong and Sagawa 1974), chồi gốc (Tanaka et al., 1976)., chồi nách trên hoa cuống (Tseet et al., 1971; Koch 1974; Fu, 1979a), đoạn thân mang mắt ngủ (Pieper và Zimmer 1976; Zimmer and Pieper, 1978), cũng như các phần giữa của cuống hoa (Homma and Asahira, 1985; Lin, 1986) Việc sử dụng các vết cắt mỏng ngang thân (TCSS) hoặc lớp mỏng tế bào (TCLs) trên bộ phận của cây, được thiết kế để kiểm soát chặt chẽ hơn với hình thái thường xuyên đa mô / nuôi cấy tế bào (Teixeira da Silva, 2003; báo cáo trong Teixeira da Silva 2013), đặc biệt là từ 6 - 7 tuần tuổi PLBs mà các tế bào ở giai đoạn này sinh trưởng mạnh (Prakash et al 1996)., được sử dụng để thúc đẩy quá

trình tái sinh cây đối với nhiều hoa lan như Aranda, Cymbidium, Rhynchostylis và

Spathoglottis (Trần Thanh Văn 1974a, 1974b; Begum et al., 1994b; Lakshmanan

et al., 1995; Teng et al., 1997; Le et al., 1999) (dẫn theo Jaime A Teixeira da Silva*, 2013)

1.7.2 Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô tế bào hoa lan trong nước

Ở nước ta, có một số Viện đã triển khai nghiên cứu chọn tạo giống và nhân giống phong lan bằng cấy mô như Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Di truyền Nông nghiệp ở khu vực phía Bắc; trường Đại Học Nông Lâm, Đại Học Khoa học - Tự nhiên, Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Sinh học Tây Nguyên ở phía Nam… Tuy nhiên, công tác nghiên cứu còn tản mạn, chưa có

hệ thống, chưa có phân công trách nhiệm nghiên cứu thường xuyên mang tính chuyên môn hóa Do vậy, các khâu nghiên cứu phát triển phong lan như bảo tồn nguồn gen, lai tạo và chọn giống, nhân giống bằng công nghệ cấy mô, công nghệ vườn ươm sau cấy mô, sinh lý sinh trưởng phát triển của các loài lan và chế độ canh tác, đóng gói, bảo quản hoa lan chưa được đầu tư đúng mức và bài bản Nguồn giống phong pan mới và công nghệ, thiết bị, vật tư sản xuất phong lan vẫn còn lệ thuộc nhiều vào nước ngoài Sản phẩm hoa chưa được tiêu chuẩn hóa Nông dân Việt Nam vẫn phải mua cây giống, vật tư, phân bón… từ Thái Lan, Trung Quốc hoặc Đài Loan, do vậy giá thành sản xuất còn cao Ví dụ, mỗi cây lan ở thành phố

Hồ Chí Minh bán với giá từ 50.000 đến 60.000 đồng, thì tại Bangkok, chỉ khoảng từ 12.000 đến 15.000 đồng/cây Trong khi đó, thị trường phong lan ở nước ta rất lớn, tiêu thụ phong lan ở các thành phố lớn như Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh vào các ngày lễ tết tăng trưởng nhanh Tuy nhiên, các loại hoa được tiêu thụ hầu hết là phong lan nhập nội từ nước ngoài như Thái Lan, Đài Loan, Trung Quốc, Mã Lai) Việc nghiên cứu tạo giống lan ở trong nước còn rất yếu Trong khi giống thương mại quốc tế đều là giống lai F1, trong đó nhiều giống bố mẹ là giống lan dại của Việt Nam Vì vậy, việc tạo giống bố mẹ và tiến hành lai tạo, cứu phôi hạt lai, nhân giống nhanh các dòng phong lan lai quý là rất cấp bách

Hiện nay, đã có những công ty hàng năm sản xuất và tiêu thụ hoa lan doanh thu lên hàng tỷ đồng như Sài gòn Orchidex, công ty hoa Hoàng Lan, các công ty này chủ yếu buôn bán các giống lan nhập nội Nghiên cứu tài nguyên di truyền và phân loại phong lan mới chỉ là bước đầu (Trần hợp, 1993) Một số nghiên cứu lại do nước ngoài chủ trì (Leonid et al., 2009) Một số địa phương như Sapa, Phú yên đã thực hiện dự án “Sưu tập và xây dựng vườn hoa phong lan đầu dòng” đã thu thập và

nghiên cứu phương pháp nhân giống và hoàn thiện quy trình sản xuất phong lan, cụ thể dự án đã thu thập 50 dòng phong lan rừng tiêu biểu khu vực miền Trung - Tây nguyên và du nhập trên 100 dòng lan nước ngoài, bước đầu đã thành công tạo ra khoảng 300.000 - 500.000 cây phong lan nuôi cấy mô Hồ điệp, Vũ nữ,… Viện Công nghệ Sinh học thực vật, Học viện Nông Nghiệp Việt Nam đã và đang đi sâu nghiên cứu cây lan, đã thành công trong việc nghiên cứu một số môi trường nhân

nhanh một số giống phong lan Hồ Điệp (Phalaenopsis), Dendrobium, thông qua

nuôi cấy lát mỏng tế bào (Nguyễn Quang Thạch và cs, 2005) Tuy nhiên, các tác giả chỉ nghiên cứu trên đối tượng lan nhập nội.Trong những năm gần đây, thấy được tầm quan trọng của bản tồn, lưu giữ nguồn gen các giống lan bản địa và nhu cầu ngày càng cao của người chơi, nhiều cơ quan tổ chức đã tiến hành nghiên cứu nhân nhanh các giống lan này Tuy nhiên, các nghiên cứu còn rất hạn chế, đặc biệt trầm

trắng là giống lan khó trồng và gặp nhiều khó khăn trong khâu nhân giống

Hiện nay, trên thế giới, lan Trầm trắng vẫn đang được sản xuất rất hạn chế, không đủ phục vụ nhu cầu của khách hàng Một ít nơi tiêu biểu như Đài Loan, Hawaii có thể coi là những thị trường lớn Tại Việt Nam, lan Trầm trắng gần như chưa được đưa vào sản xuất, nguồn hàng bán trên thị trường đều nhập khẩu từ nước ngoài hoặc do khai thác ngoài tự nhiên Một số tổ chức nhà nước hoặc tư nhân như Viện Di truyền Nông nghiệp, công ty Orchid Life’s Beautiful đã và đang tiến hành nghiên cứu nhân nhanh in vitro lan Trầm trắng, tuy nhiên hiệu quả tạo ra cây con còn thấp nên cũng chưa thể đưa vào sản xuất Khắc phục điều này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro

giống lan hoàng thảo Trầm trắng (Dendrobium nestor var alba)”

Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu và thời gian nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu là giống lan Hoàng thảo Trầm trắng được thu thập

từ vùng miền núi phía Bắc, được trồng tại vườn tập đoàn các giống lan - Viện Di truyền Nông nghiệp

- Vật liệu nghiên cứu gồm lá non, chồi và các đoạn thân mang mắt ngủ của cây hoàng thảo Trầm trắng

- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 1/ 2014 đến tháng 5/2015

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Thiết lập hệ nuôi cấy vô trùng

- Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng khác nhau đến khả

năng tạo mẫu vô trùng

• Mục đích của thí nghiệm: Xác định được nồng độ chất khử trùng thích

hợp để hiệu quả vào mẫu là tốt nhất

• Thí nghiệm được nghiên cứu trong điều kiện tối ưu về nhiệt độ, pH, ánh sáng

+ Thí nghiệm 1.1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng đến khả năng tạo mẫu vô trùng của mẫu lá non

Số mẫu ban đầu

Mẫu lá non

Số mẫu sống

Số mẫu chết

Số mẫu nhiễm

+ Thí nghiệm 1.2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất khử đến khả năng tạo mẫu vô trùng của mẫu chồi gốc

Số mẫu ban đầu

Chồi gốc

Số mẫu sống

Số mẫu chết

Số mẫu nhiễm

+ Thí nghiệm 1.3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng đến khả năng tạo mẫu vô trùng của mẫu đoạn thân

Số mẫu ban đầu

Mẫu đoạn thân

Số mẫu sống

Số mẫu chết

Số mẫu nhiễm

5

10

5

10 Môi trường hồi phục sau khử trùng: VW + 30 g/L sucrose + 10% nước dừa (ND) + 1 mg/L 6-BA + 10% chuối xanh (CX) + 0,5g/L than hoạt tính (AC) + 5,5 g/L agar, pH = 5,8

- Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nguồn mẫu đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của

mẫu nuôi cấy

• Mục đích của thí nghiệm: xác định được nguồn mẫu đưa vào tối ưu nhất

để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo

Công thức 1: lá non

Công thức 2: chồi gốc

Công thức 3: mẫu đoạn thân

- Thí nghiệm3: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh

trưởng của mẫu nuôi cấy

• Mục đích của thí nghiệm: Xác định được môi trường nuôi cấy tối ưu cho

sinh trưởng của mẫu nuôi cấy

• Thí nghiệm được nghiên cứu trong điều kiện tối ưu về nhiệt độ, pH, ánh sáng

Công thức 1 (VW): Môi trường khoáng Vacin and Went (1949)

Công thức 2 (VW1): môi trường VW tăng gấp đôi lượng KNO3 và NH4SO4 Công thức 3 (VW2): môi trường VW1 bổ xung thêm vitamin của môi trường

MS (Murashige & Skoog, 1962)

Công thức 4 (MS/2): môi trường MS giảm đi 1 nửa

Môi trường nền: 30 g/l Succaroza + 10% ND + 1 mg/l 6-BA + 0,5 mg/L NAA + 100g/l CX + 0,5 g/l AC + 5,5 g/l agar, pH 5,8

α-Loại môi trường tối ưu sẽ được chọn làm môi trường nền tối ưu (NTU) cho các thí nghiệm tiếp theo Môi trường nền tối ưu ký hiệu là NTU

Môi trường nền chung: NTU +30 g/L sucrose + 10% nước dừa (ND) + 1 mg/L 6-BA + 0,5 mg/L α-NAA + 10% chuối xanh (CX) + 0,5 g/L AC + 5,5 g/L agar, pH = 5,8

- Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến

sự phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy

• Mục đích của thí nghiệm: Xác định được nồng độ của 6-BA cần thiết để bổ

sung vào môi trường sao cho khả năng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy là cao nhất

• Thí nghiệm được nghiên cứu trong điều kiện tối ưu về nhiệt độ, pH, ánh sáng

- Thí nghiệm 5: Đánh giá ảnh hưởng của 6-BA lên khả năng nhân protocorm

• Mục đích của thí nghiệm: Xác định được nồng độ của 6-BA cần thiết để

bổ sung vào môi trường sao cho khả năng tạo protocorm là lớn nhất

• Thí nghiệm được nghiên cứu trong điều kiện tối ưu về nhiệt độ, pH, ánh sáng

Công thức 1 (B1) Nồng độ 6-BA bổ sung : 0mg/l môi trường

Công thức 2 (B2) Nồng độ 6-BA bổ sung : 1mg/l môi trường

Công thức 3 (B3) Nồng độ 6-BA bổ sung : 2mg/l môi trường

Công thức 4 (B4) Nồng độ 6-BA bổ sung : 3mg/l môi trường

Công thức 5 (B5) Nồng độ 6-BA bổ sung : 4mg/l môi trường

Công thức 6 (B6) Nồng độ 6-BA bổ sung : 5mg/l môi trường

Môi trường nền chung: NTU + 30 g/L sucrose + 10% nước dừa (ND) + 0,5 mg/L α-NAA + 10% chuối xanh (CX) + 0,5 g/L AC + 5,5 g/L agar, pH = 5,8

• Công thức môi trường thích hợp sẽ được chọn để áp dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

- Thí nghiệm 6 : Đánh giá ảnh hưởng của 6-BA kết hợp với kinetin lên khả

năng nhân protocorm

• Mục đích của thí nghiệm: Xác định được nồng độ của Kinetin cần thiết để

bổ sung vào môi trường sao cho khả năng tạo protocorm là cao nhất

• Thí nghiệm được nghiên cứu trong điều kiện tối ưu về nhiệt độ, pH, ánh sáng

Công thức 1 (K1) Nồng độ kinetin bổ sung : 0,1mg/l môi trường

Công thức 2 (K2) Nồng độ kinetin bổ sung : 0,2mg/l môi trường

Công thức 3 (K3) Nồng độ kinetin bổ sung : 0,3mg/l môi trường

Công thức 4 (K4) Nồng độ kinetin bổ sung : 0,4mg/l môi trường

Công thức 5 (K5) Nồng độ kinetin bổ sung : 0,5mg/l môi trường

Môi trường nền chung: NTU + 6-BA (thí nghiệm 6) + 30 g/L sucrose + 10%

ND + 10% CX + 0,5 g/L AC + 5,5 g/L agar, pH = 5,8

2.2.3 Nghiên cứu xác định môi trường tái sinh cây và tạo cây hoàn chỉnh

- Thí nghiệm7: Nghiên cứu môi trường tái sinh cây lan Trầm trắng từ

protocorm

+ Thí nghiệm 7.1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 6-BA đến khả năng tái sinh và nhân chồi

• Mục đích của thí nghiệm: Xác định được nồng độ của 6-BA cần thiết để

bổ sung vào môi trường sao cho khả năng tái sinh và nhân chồi là lớn nhất

• Thí nghiệm được nghiên cứu trong điều kiện tối ưu về nhiệt độ, pH, ánh sáng

• Mục đích của thí nghiệm: Xác định được nồng độ của Kinetin cần thiết để

bổ sung vào môi trường sao cho khả năng tái sinh và nhân chồi là cao nhất

• Thí nghiệm được nghiên cứu trong điều kiện tối ưu về nhiệt độ, pH, ánh sáng

+ Thí nghiệm 7.3 Ảnh hưởng của GA3 đến khả năng kéo dài chồi

• Mục đích của thí nghiệm: xác định được nồng độ GA3cần thiết để bổ sung vào môi trường sao cho khả năng kéo dài chồi của cây con in vitro là tốt nhất

• Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện tối ưu về nhiệt độ, pH, ánh sáng Công thức 1: 0mg/l GA3

+ Thí nghiệm 7.4 Ảnh hưởng của α-NAA đến sự hình thành rễ của cây

• Mục đích của thí nghiệm: xác định được nồng độ α-NAA cần thiết để bổ

sung vào môi trường sao cho sự hình thành rễ của cây con in vitro là tốt nhất

• Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện tối ưu về nhiệt độ, pH, ánh sáng Công thức 1: 0mg/l α-NAA

• Công thức môi trường thích hợp sẽ được chọn để áp dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

- Thí nghiệm 8 : Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến sinh trưởng và

phát triển của cây con in vitro

+ Thí nghiệm 8.1: Nghiên cứu ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy cơ

bản đến sự sinh trưởng, phát triển của cây con in vitro

• Mục đích của thí nghiệm: xác định được môi trường nuôi cấy cơ bản tốt

nhất cho sự sinh trưởng, phát triển của cây con in vitro

• Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện tối ưu về nhiệt độ, pH, ánh sáng Công thức 1: môi trường VW

Công thức 2: môi trường VW1

Công thức 3: môi trường VW2

Công thức 4: môi trường MS/2

Môi trường nền chung: 6-BA (thí nghiệm 7.1) + Kinetin (thí nghiệm 7.2) +

GA3 (thí nghiệm 7.3) + α-NAA (thí nghiệm 7.4)+ 30 g/L sucrose + 10% ND + 10%

CX + 0,5 g/L AC + 5,5 g/L agar, pH = 5,8

• Loại môi trường tối ưu sẽ được chọn làm môi trường nền tối ưu cho các thí nghiệm tiếp theo Môi trường nền tối ưu ký hiệu là NTU

+ Thí nghiệm 8.2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nước dừa đến quá

trình sinh trưởng của cây con in vitro

• Mục đích của thí nghiệm: xác định được nồng độ nước dừa cần thiết để bổ

sung vào môi trường sao cho sinh trưởng của cây con in vitro là tốt nhất