Bước đầu nghiên cứu, xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro giống hoa cát tường (eustoma grantdiflorum (raf ) shinn)

Kỹ thuật nuôi cây mô, tế bào xét chocùng đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vậtkhi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng một cách địn

Khác với những loại hoa thông thường khác, hoa cát tường khó trồng hơn.Người trồng hoa mua giống nhập từ Nhật, từ Mỹ về Đem ủ giống trong mảnhđất tốt, tơi xốp và giàu đạm để đảm bảo hoa có thể nảy mầm, phát triển Mộtluống hoa cát tường trồng khoảng 5, đến 6 tháng là thu hoạch đợt đầu, khoảng 3tháng sau thu hoạch đợt sau Luống hoa chỉ thu hoạch trong 1 năm, khoảng 3đợt, sau đó phải cuốc lên bỏ hết để trồng luống mới.

Hoa cát tường là giống hoa có khả năng chịu lạnh tốt, du nhập vào Đà Lạtnước ta lần đầu tiên khoảng chục năm về trước với nhiều chủng loại khác nhau.Hoa Cát tường rất được ưa chuộng, vì màu sắc và kiểu dáng của hoa rất đẹp, vìtên gọi của nó, mang đến ý nghĩa vạn sự như ý, may mắn, an lành, chúng đượctiêu thụ nhiều nhất vào dịp tết, ai cũng muốn cả năm, mình và gia đình được cáttường

Hoa Cát tường là một giống hoa mới du nhập vào nước ta, nguồn giốngchủ yếu là nhập ngoại nên giá hoa thành phẩm khá cao, chưa đáp ứng được nhucầu của người chơi hoa, hơn nữa Cây hoa Cát tường là loài cây khá khó tính, cần

kỹ thuật chăm sóc cẩn thận Việc nhân giống bằng hạt cho hiệu quả thấp, hệ sốnhân thấp, chất lượng cây không tốt, cây dễ bị thoái hoá Rõ ràng việc tìm raphương pháp nhân nhanh nhằm tạo ra được lượng cây giống lớn trong thời gianngắn, đồng thời duy trì được những đặc tính quý của giống là việc làm hết sức

có ý nghĩa Vì vậy, để hạn chế được khó khăn công tác chọn tạo, nhân giống,các kỹ thuật gieo trồng hoa Cát tường ở Việt Nam đã bước đầu được nghiêncứu Để có thể triển khai trên quy mô lớn, giảm giá thành, hiện nay kỹ thuậtnhân giống vô tính in vitro đã được áp dụng thành công trên rất nhiều đối tượng.Phương pháp này cho phép từ một lượng nhỏ giống ban đầu được nhân nhanh cóthể cung cấp được một lượng cây giống lớn, đồng nhất, sạch bệnh, duy trì đượcđặc tính của cây mẹ ban đầu Trên cơ sở đó trong thời gian thực tập tốt nghiệptại Viện di truyền nông nghiệp chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài:

“ Bước đầu nghiên cứu, xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro giống hoa Cát tường (Eustoma grantdiflorum (Raf.) Shinn).

1.2.Mục đích và yêu cầu của đề tài

1.2.1 Mục đích

Bước đầu nghiên cứu, xây dựng quy trình nhân nhanh giống hoa Cáttường (Eustoma grantdiflorum (Raf.) Shinn) bằng phương pháp nuôi cấy mô tếbào nhằm cung cấp một số lượng lớn cây con cho sản xuất phục vụ nhu cầu sửdụng hoa Cát tường ở Hà Nội và các vùng lân cận

- Nghiên cứu được ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng đến khảnăng nhân nhanh, hình thành rễ và tạo cây hoàn chỉnh

- Nghiên cứu được ảnh hưởng của các giá thể đến tỷ lệ sống của cây ởgiai đoạn vườn ươm

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ hoa

Sản xuất hoa cây cảnh trên thế giới đang phát triển một cách mạnh mẽ vàđang trở thành một ngành thương mại cao sản xuất hoa cây cảnh đã mang lại lợiích to lớn cho nền kinh tế các nước trồng hoa cây cảnh

Hiện nay, sản xuất hoa ở nước ta được thực hiện bởi 2 đối tượng chính:nông dân sản xuất tự phát theo xu hướng nhu cầu thị trường trong nước và bởicác doanh nghiệp tư nhân trong nước, liên doanh với nước ngoài hoặc 100% vốnnước ngoài sản xuất hoa chủ yếu cho xuất khẩu Hoa tiêu thụ trong nước chủngloại đa dạng và cung cấp ra thị trường theo mùa vụ, chất lượng từ thấp đến cao,giá cả vừa phải, hiệu quả kinh tế không cao, sản xuất nhỏ lẻ và thiếu ổn định.Các doanh nghiệp sản xuất hoa xuất khẩu lượng hoa nhiều hơn mang tính hànghoá, chất lượng hoa cao hơn và được sản xuất trong điều kiện kỹ thuật cao, sảnphẩm được tiêu thụ theo hợp đồng Hiện nay, Việt Nam đã xuất khẩu được cácsản phẩm hoa cắt cành như hồng, phong lan, cúc, đồng tiền, cẩm chướng, ly ly,sao tím sang Trung Quốc, Hồng Kông, Đài Loan, Nhật bản, Singapore.Australia, ảrập; vạn niên thanh, mai chiếu thủy, mai cảnh sang Trung Quốc,Hoa Kỳ, Nhật Bản Tuy nhiên, số lượng xuất khẩu không nhiều, với doanh thuhơn 10 triệu USD/năm Sở dĩ, sản phẩm hoa, cây cảnh của Việt Nam khó thâmnhập thị trường thế giới là do chủng loại, chất lượng, kích cỡ không đồng đều,chưa đáp ứng được thị hiếu của khách hàng quốc tế Trong khi đó, tiêu thụ trongnước lại có xu hướng chạy theo mùa vụ (rằm, lễ, Tết, các ngày kỷ niệm) làchính [19]

Đà Lạt là vùng sản xuất hoa nổi tiếng và là vùng có tiềm năng lớn nhất vềsản xuất hoa của cả nước Hiện nay công ty TNHH Đà Lạt - Hasfarm 100% vốnnước ngoài đang áp dụng công nghệ sản xuất hoa tiên tiến với qui mô diện tích

15 ha sản xuất trong nhà kính và 2 ha nhà thép; có hệ thống tự động điều chỉnhnhiệt độ, ẩm độ, hệ thống tưới nhỏ giọt bằng nguồn nước sạch hòa tan với phânbón, thuốc bảo vệ thực vật Các chủng loại hoa Công ty Đà Lạt - Hasfarm đang

sản xuất bao gồm hoa hồng, cúc, cẩm chướng, ly ly, đồng tiền và lá hoa trangtrí Sản lượng hoa xuất khẩu sang các nước Hồng Kông, Nhật, Đài Loan,Singapore chiếm 55%, phần còn lại dành cho tiêu thụ nội địa Quy trình sảnxuất được thực hiện khép kín từ gieo trồng đến thu hoạch, kể cả công nghệ sauthu hoạch như xử lý dung dịch giữ hoa, đóng gói, bảo quản và vận chuyển trongngày để gửi đến nơi tiêu thụ [19]

Hiện nay ở nước ta, nhu cầu về hoa Cát tường ngày càng tăng nhưng thựctiễn sản xuất và kinh doanh loại hoa này còn nhiều yếu kém cả về năng suất, sảnlượng cũng như chất lượng hoa Lý do xuất phát của những hạn chế đó là khókhăn về chủng loại, số lượng, chất lượng giống cũng như kỹ thuật nhân giống

Để giải quyết được những khó khăn đó thì việc áp dụng kỹ nuôi cấy mô in vitrotrên cây hoa Cát tường là rất cần thiết

2.2 Một số hạn chế trong sản xuất hoa hiện nay ở Việt Nam

Nhìn chung sản xuất hoa ở nước ta bị hạn chế rất lớn về thời vụ do điềukiện khí hậu không thích hợp: ở phía Bắc, hầu hết các loại hoa có chất lượng caochỉ có thể sản xuất được với chất lượng khá trong vụ Đông Xuân; còn ở các tỉnhphía Nam khí hậu lại càng ít thuận lợi hơn (trừ một số vùng đặc thù)

Về quy mô và tổ chức sản xuất: Hầu hết những cơ sở sản xuất hoa cắtcành ở nước ta còn ở quy mô nông hộ nhỏ, tổ chức sản xuất đơn lẻ, với diện tíchtrung bình từ 2.000 đến 3.000 m2 /hộ Hộ sản xuất hoa lớn cũng chỉ từ 1 đến 2

ha Ở quy mô sản xuất này không thể áp dụng những kỹ thuật tiến bộ như nhàkính, nhà lưới, sân bãi, mặt bằng, dây chuyền chế biến, bảo quản vận chuyểnlạnh,…để đưa ngành sản xuất hoa trở thành sản xuất công nghiệp Từng hộ nôngdân sản xuất nhỏ lẻ, thiếu hợp tác là trở ngại lớn cho việc tạo nguồn hàng hóalớn và đa dạng với chất lượng cao, đồng nhất Trên thực tế, đã có nhiều hợpđồng xuất khẩu không thể thực hiện được do không thể tổ chức cung cấp sảnphẩm theo yêu cầu, trong khi tiềm năng sản xuất là rất lớn

Kỹ thuật trồng hoa ở nhiều nơi vẫn chủ yếu dựa vào kinh nghiệm vàphương pháp nhân giống cổ truyền như gieo từ hạt, trồng từ củ, mầm, nhánh.Các phương pháp này dễ trồng, giá thành cây giống thấp nhưng chất lượnggiống không cao, dễ bị thoái hóa, làm giảm chất lượng hoa vì vậy tuy chủng loạihoa của Việt Nam khá phong phú nhưng thiếu giống hoa đẹp, chất lượng cao.

Về ứng dụng công nghệ cao: Đã được cải thiện đáng kể, như thay đổi cơcấu giống, nuôi cấy mô, kỹ thuật canh tác và bảo vệ thực vật tiên tiến; áp dụngcông nghệ nhà lưới có mái che sáng Tuy nhiên, sự thay đổi này diễn ra khôngđồng đều giữa các vùng sản xuất vì nhiều lý do (khí hậu thời tiết, trình độ thâmcanh, khả năng đầu tư, khả năng tiếp cận kỹ thuật tiến bộ và thị trường…) ĐàLạt có thể coi là địa bàn có tiến bộ nhanh nhất trong cả nước về phát triển sảnxuất hoa cắt cành [19]

2.3 Giới thiệu chung về hoa cát tường Hoa cát tường

2.3.1 Vị trí, tên gọi và xuất xứ

- Tên khoa học: Eustoma grandiflorum

- Tên khác: Lisianthus, Prairie Gentian,Texas bluebell, Tulip Gentian, Bluebell, Lire de san pedro

- Tên Việt Nam: Cát tường

Cát tường- tên khoa học Eustoma grandiflorum (Raf.) Shinn có nguồn gốc

từ miền tây nước Mỹ, có khả năng chịu lạnh tốt, du nhập vào Đà Lạt nước ta lần

đầu tiên khoảng hơn chục năm về trước với nhiều chủng loại và màu sắc đadạng như: kem, tím, vàng, hồng, hồng phai, tím đậm, trắng viền tím…

Hiện tại cát tường là giống hoa được người tiêu dùng rất ưa chuộng vàđang được sản xuất làm hoa thương phẩm Hoa cát tường được sản xuất nhiều ở

Đà Lạt vì điều kiện khí hậu và thổ nhưỡng nơi đây rất phù hợp với đặc điểmsinh trưởng của nó Ngoài ra, cát tường còn được coi là hoa chủ lực và làm lênthương hiệu nhiều vườn hoa như vườn hoa Lang Biang Farm Tại đây, vớidiện tích trồng hoa 6ha thì trồng hoa cát tường là chủ yếu đã cho những cànhhoa thân cao, hoa lớn Đó chính là điểm mạnh đưa hoa cát tường của LangBiang Farm không chỉ nổi tiếng ở Đà Lạt mà cả ở TP Hồ Chí Minh

Hiện nay, do nhu cầu chơi hoa Cát tường ngày càng tăng, hoa sản xuất rakhông đủ cầu Vì vậy, năm vừa qua, Hiệp hội hoa Đà Lạt đã tổ chức hội thảochuyên đề về qui trình kỹ thuật canh tác, thu hoạch hoa Cát tường với sự có mặtcủa 10 nhà khoa học và hơn 40 người trồng hoa trên địa bàn Đà Lạt để trồng hoacát tường có hiệu quả và cung cấp tốt nhất nhu cầu của người tiêu dùng [19]

2.3.2 Đặc điểm thực vật học

2.3.2.1 Rễ:

Rễ của hoa cát tường thuộc loại rễ cọc, có nguồn gốc từ mầm rễ của hạt

Rễ của cây phát triển theo chiều sâu mà ít phát triển theo chiều ngang do vậycây có khả năng chịu hạn cao

2.3.2.2 Thân:

Thân thảo, đứng, có khả năng phân nhánh mạnh Có nhiều đốt, giòn, dễgẫy, thân cây càng lớn càng cứng Các đốt sát gốc thường to và ngắn hơn cácđốt trên ngọn Các đốt ở ngọn cây dài và nhỏ Cây cao từ 15 – 60 cm

2.3.2.3 Lá:

Lá đơn mọc đối, không có lá kèm Lá có hình ôvan hoặc hình bầu dục dàituỳ từng giống, đầu lá nhọn, lá không có cuống mà ôm sát lấy thân Mép lákhông có răng cưa Phiến lá có thể to hay nhỏ tuỳ thuộc vào đặc điểm từng

giống Từ mỗi nách lá thường phát sinh một mầm nhánh Lá cát tường có màuxanh biếc, mảnh dẻ, mọng nước, bề mặt lá có phủ một lớp sáp mỏng Trên lá có

từ 3 – 5 gân, gân lá song song., trong đó gân giữa ăn sâu và rõ hơn cả

Ở cát tường góc lá có sự thay đổi theo tuổi của lá, các lá mới hình thành

có góc lá đứng, sau đó các lá mở ngang và rũ xuống

2.3.2.4 Hoa:

Hoa đối xứng, lưỡng tính Đài hoa, cánh hoa liền nhau Các nhị hoa trêntràng nằm so le với các thuỳ tràng hoa Đáy nhụy hoa có một đĩa mật Các hoađính noãn vách bên Cụm hoa hình xim Tràng hoa có nhiều màu sắc khác nhau,

có loại cánh đơn và loại cánh kép tuỳ từng giống

2.3.2.5 Quả:

Quả nang tự nở nhìn màu lá có thể xác định màu của quả

2.3.2.6 Hạt:

Có kích thước nhỏ, với nội nhũ nhiều dầu Phôi mầm lớn Nảy mầm kém

2.3.3 Đặc điểm sinh trưởng

Hoa cát tường phát triển tốt ở điều kiện 70 - 80 Klux ánh sáng tự nhiên

Do vậy vào mùa xuân hay mùa hè có cường độ ánh sáng cao nên thường phảiche lưới cho hoa Hoa cát tường thích hợp với vụ dài ngày, có số giờ chiếu sángtrong ngày tối ưu là 16 giờ trong ngày thì sẽ cho chất lượng bông cao nhất Tính

cả thời gian từ lúc gieo hạt cho đến khi cây ra hoa là từ 20 – 23 tuần

Nhiệt độ tối thích cho hoa cát tường sinh trưởng và phát triển là từ 18 –

20oC vào ban ngày và 15 – 18 oC vào ban đêm Nhiệt độ vào ban đêm thấp hơn

15oC sẽ làm trì trệ quá trình sinh trưởng của cây Vào ban ngày, khi nhiệt độ caohơn 28 oC sẽ làm cho hoa nở sớm, rút ngắn quá trình sinh trưởng của hoa và chohoa kém chất lượng Tùy theo từng chủng loại giống mà có yêu cầu về nhiệt độ

và quang chu kỳ khác nhau, do vậy trước khi trồng nên tìm hiểu chủng loạigiống mà bố trí mùa vụ thích hợp

2.3.4 Phân loại hoa cát tường

Giống hoa cát tường gồm có hai loại: Giống hoa kép và hoa đơn

2 3.4.1.Giống hoa kép

- Nhóm Avilia: nhóm này thích hợp ở điều kiện ánh sáng yếu và nhiệt độmát Do vậy nhóm giống này thường trồng vào vụ đông Các màu thường làtrắng ngà, viền xanh, hồng cánh sen, đỏ tía

- Nhóm Balboa: nhóm này thích hợp nhiệt độ và cường độ ánh sáng caohơn Thích hợp trồng vụ xuân đến hè Phát triển tốt ở điều kiện quang chu kỳngày dài Các màu thường là xanh, viền xanh, xanh tía

- Nhóm Catalina: thích hợp với điều kiện ngày dài và thời tiết ấm áp Cácmàu thường là xanh tía và màu vàng

- Nhóm Candy: thích hợp với cường độ ánh sáng trung bình và quang chu

kỳ ngày ngắn Nhóm này cho hoa nở đồng loạt và có nhiều màu để chọn lựa

- Nhóm Echo: Nhóm này là nhóm phổ biến trong giống hoa cát tường.Không thích hợp với cường độ ánh sáng quá cao hay thấp, thích hợp cho vụđông xuân Các màu phổ biến trong giống này là xanh bóng, xanh tía, hồng,hồng tía, trắng tuyền

- Nhóm Mariachi: Nhóm này thích hợp trồng trong chậu Đặc điểm giốngnày là có số cánh hoa nhiều, cánh hoa mỏng hơn các giống khác nên nhìn rấtđẹp Các màu phổ biến trong giống này là trắng, hồng, hồng nhạt, xanh………

2.3.4.2 Giống hoa đơn

- Nhóm Flamenco: là nhóm thích hợp với cường độ ánh sáng cao vàquang chu kỳ ngày dài Thân hoa dài và mảnh Các màu là xanh bóng, hồng,vàng, trắng

- Nhóm Heidi: thích hợp với cường độ ánh sáng trung bình và quang chu

kỳ ngày ngắn Có nhiều màu để chọn lựa

- Nhóm Laguna: là nhóm thích hợp với cường độ ánh sáng cao và quangchu kỳ ngày dài Thân hoa dài khoảng 48 cm, một cây trung bình có ba thân và

25 nụ hoa Có hai màu là xanh đậm và xanh tía

- Nhóm Malibu: thích hợp với cường độ ánh sáng trung bình và trong mùaxuân và mùa thu Có nhiều màu là hoa cà, xanh đậm, trắng, hồng, trắng viềnxanh

- Nhóm Yodel: Thân hoa dài khoảng 45 - 50cm Có nhiều màu là xanhđậm, xanh, hoa cà, hồng phấn, hồng, trắng [19]

2.4 Sơ lược về nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là lĩnh vực nuôi cấy mô, tế bào và các cơquan hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo trongđiều kiện vô trùng

Cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật chính là tínhtoàn năng và khả năng phân hoá, phản phân hoá của tế bào thực vật Tế bàođược coi là đơn vị cấu trúc và chức năng của mọi cơ thể sinh vật Sự phân hoá,phản phân hoá tế bào cùng với đặc tính vốn có của nó là “ tính toàn năng”, là cơ

sở lý luận vững chắc để xây dựng kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào nhằm tái sinh cây

hoàn chỉnh từ các tế bào tách rời, có khả năng sống và phát triển độc lập Dựatrên cơ sở đó mà công nghệ nuôi cấy mô, tế bào thực vật ra đời.

Năm 1992, Haberlandt lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi một tế bào bất

kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thànhmột cơ thể hoàn chỉnh Theo quan niệm sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ

đã được phân hoá đều chứa toàn bộ lượng thông tin di truyền (ADN) cần thiếtcủa cả cơ thể thực vật đó và nếu gặp điều kiện thích hợp thì mỗi tế bào đó đều

có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh gọi là “tính toàn năng” của tế bàothực vật [12] Biểu hiện của tính toàn năng chính là sự phân hoá và phản phânhoá, và thực chất sự phân hoá và phản phân hoá tế bào là kết quả của sự hoạthoá, phân hoá các gen vốn có trong tế bào tại thời điểm nào đó trong quá trìnhphát triển cá thể hay trong điều kiện nhất định, một số gen được hoạt hoá để tạonên các đặc tính mới và ngược lại, một số gen khác có thể bị đình chỉ hoạt độnglàm mất đi những đặc tính vốn có trước đó của tế bào Điều này xảy ra theo mộtchương trình đã được mã hoá trong cấu trúc của phân tử AND của mỗi tế bàokhiến quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hoà

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật thực chất

là kết quả của quá trình phân hoá tế bào Kỹ thuật nuôi cây mô, tế bào xét chocùng đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật(khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách địnhhướng dựa vào sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào trên cơ sở tính toànnăng của tế bào thực vật Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy,người ta thường bổ sung vào mộ trường nuôi cấy hai nhóm chất điều tiết sinhtrưởng thực vật là auxin và cytokinin [9]

2.5 Ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật

+ Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý làm vật liệu cho công tác giống+ Nhân nhanh các loài hoa, cây cảnh khó trồng bằng hạt

+ Duy trì nhân nhanh các dòng bố mẹ và các dòng lai để tạo hạt giốngcây, cây hoa và cây trồng khác

+ Nhân nhanh kết hợp làm sạch virus

+ Bảo quản tập đoàn gen

2.6 Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào và ứng dụng trong nhân nhanh giống cây trồng

2.6.1 Giới thiệu quy trình nhân giống vô tính in vitro

Ngày nay, hầu hết các nhà nghiên cứu đều thống nhất rằng thành công của

vi nhân giống chỉ đạt được khi nó trải qua 5 giai đoạn, chứa không phải 3 giaiđoạn như Murashige (1974) đã nêu ra trước đây Trong đó giai đoạn 0 (giai đoạnchuẩn bị) là đặc biệt quan trọng [11]

Giai đoạn 0: Khử trùng mô cấy

Đây là giai đoạn tối quan trọng, thậm chí quyết định toàn bộ quy trình nhângiống in vitro Mục đích của giai đoạn này là tạo được vật liệu thực vật vô trùngvào nuôi cấy in vitro Khử trùng mô thực vật người ta thường sử dụng một sốchất hoá học như HgCl2, Ca(OCL)2, NaOCL, H2O2 tuỳ thuộc từng loại mô thựcvật mà lựa chọn nồng độ và thời gian xử lý hoá chất thích hợp

Giai đoạn 1: Tái sinh mô nuôi cấy

Trong nhân giống in vitro, mẫu nuôi cấy thường sử dụng là chồi đỉnh hoặcchồi nách của cây mẹ Ngoài ra tùy từng đối tượng mà người ta còn sử dụng cácmẫu nuôi cấy là thân, rễ, lá, đài hoa, cánh hoa… Mục đích của giai đoạn này làtái sinh một cách định hướng các mô nuôi cấy Quá trình này được điều khiểnchủ yếu dựa vào tỷ lệ thích hợp chất auxin/cytokinin ngoại sinh đưa vào môitrường nuôi cấy tuy nhiên, cần phải quan tâm đến tuổi sinh lý mẫu cấy Thườngcác mô non chưa phân hoá có khả năng tái sinh cao hơn các mô trưởng thành đãchuyên hóa sâu Theo Anderson mẫu cấy của cây được lấy vào thời kỳ sinhtrưởng mạnh cho kết quả rất khả quan trong tái sinh chồi

Giai đoạn 2: Nhân nhanh chồi

Để tăng hệ số nhân, người ta thường đưa thêm vào môi trường dinhdưỡng nhân tạo các chất điều hoà sinh trưởng (auxin, cytokinin, gibberellin…)các chất bổ sung khác như nước dừa, nước chiết nấm men, dịch thuỷ phân

casein… kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp Tuỳ thuộc vàotừng đối tượng nuôi cấy người ta có thể nhân nhanh bằng sự kích thích cụm chồi(nhân cụm chồi), hay kích thích sự phát triển của các chồi nách, hoặc thông quaviệc tạo cây từ phôi vô tính.

Giai đoạn 3: Tạo cây hoàn chỉnh

Khi đạt kích thước nhất định các chồi được chuyển từ môi trường ở giaiđoạn 3 sang môi trường ra rễ Thường sau 1-2 tuần, từ những chồi riêng lẻ này

sẽ xuất hiện rễ và chở thành cây hoàn chỉnh Ở giai đoạn này người ta thường bổsung vào môi trường nuôi cấy các chất auxin, vì auxin là hoocmon thực vật quantrọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy, trong nhóm này, các chất IAA,IBA, 2,4D, NAA được sử dụng nhiều nhất, nghiên cứu nhiều nhất [16]

Giai đoạn 4: Đưa cây ra đất

Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh (có đủ thân, rễ, lá) từ ống nghiệm ra đất làbước cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro, là bước quyết định khả năngứng dụng quá trình này trong thực tiễn sản xuất

Cây lấy từ ống nghiệm phải rửa sạch agar bám trên bề mặt rễ để tránh sựxâm nhập của côn trùng và nấm mốc

Đây là giai đoạn chuyển cây con từ trạng thái sống dị dưỡng sang sốnghoàn toàn tự dưỡng Do đó để đảm bảo cho cây có tỷ lệ sống cao thì cần phảiđưa cây vào vườn ươm, ươm trên các giá thể từ 10-15 ngày Lúc này rễ mớiđược sinh ra, lá non bắt đầu hình thành Sau đó, chuyển cây ra đất với chế độchăm sóc bình thường

2.6.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân giống vô tính in vitro 2.6.2.1 Ảnh hưởng của các nhân tố vật lý

* Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào và quátrình trao đổi chất Trong nuôi cây in vitro, mỗi loài có biên độ nhiệt độ thíchnghi khác nhau

Nhiệt độ trong bình nuôi cấy thường cao hơn nhiệt độ ngoài bình một vài

độ và phần đáy bình thường sẽ ấm hơn so với phần nắp bình

Nhiệt độ trung bình của bình nuôi cho nhiều loại cây thường là 25oC( giao động từ 17-30oC) Các cây nhiệt đới cần nhiệt độ trung bình của buồngnuôi ở mức cao hơn khoảng 27 oC (giao động 24-32 oC)

Sự chênh lệch nhiệt độ ban ngày (khi chiếu sáng) thường được duy trìgiảm 4-8 oC so với nhiệt độ ban ngày Ví dụ nhiệt độ ban ngày là 25oC, ban đêm

là 20 oC, hay nhiệt độ ban ngày là 28oC, ban đêm là 24oC Sự chênh lệch nhiệt

độ như vậy hỗ trợ sự trao đổi khí của bình nuôi và cải thiện sự sinh trưởng củacây nuôi cấy

Với mỗi loài cây khác nhau có khoảng nhiệt độ thích hợp khác nhau Vídụ: cây khoai tây sinh trưởng rất nhanh ở nhiệt độ ngày/đêm là 22oC /18oC, khinhiệt độ ngày đêm là 27oC /22oC cây sinh trưởng chậm hẳn

Tốc độ sinh trưởng của mẫu cấy thường giảm dần khi nhiệt độ buồng nuôithấp hơn nhiệt độ tối thích nhưnng giảm xuống rất nhanh khi nhiệt độ buồngnuôi cao hơn nhiệt độ tối thích [9]

Ánh sáng trong bình và ngoài bình khác nhau rất nhiều Sự phân bố ánhsáng trong bình phụ thuộc vào điện tích nắp bình, loại bình và sự sắp xếp bìnhtrên giá đặt bình nuôi

Thông thường cường độ ánh sáng trong buồng nuôi thấp hơn 10 lần so vớiánh sáng tự nhiên ban ngày, dao động trong khoảng 40-140mmol/m²/s (tươngđương 3.000- 10.000 lux) Việc sử dụng cường độ chiếu sáng thấp trong nuôi

cấy in vitro nhằm tiết kiệm chi phí năng lượng, giảm hiệu ứng nhà kính và domẫu cấy chủ yếu sống theo phương thức dị dưỡng.

Tỷ lệ quang tử của vùng ánh sáng màu đỏ/ gần đỏ và xanh/ đỏ ảnh hưởngđến sự phát sinh hình thái sự phát sinh hình thái xảy ra khi ánh sáng có bướcsóng thuộc vùng ánh sáng màu xanh (400- 600nm), màu đỏ (620- 680nm), gầnmàu đỏ (700- 800nm) và gần màu tím (300- 400nm)

Quang chu kỳ trong buồng nuôi thường được duy trì ở chế độ 16 giờchiếu sáng/ngày [9]

2.6.2.2 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường nuôi cấy

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật môi trường có vai trò rất quan trọng vì

nó cung cấp chất dinh dưỡng đảm bảo cho sự sinh trưởng, phát triển của mônuôi cấy Nhu cầu xinh dưỡng cho sự phát triển bình thường của mô nuôi cấy rấtkhác nhau Tuỳ thuộc vào loài, giống, thậm chí các mô được lấy từ những cơquan khác nhau trên cùng cơ thể thực vật cũng có nhu cầu dinh dưỡng khácnhau [14]

Cho đến nay người ta đã tìm ra nhiều loại môi trường dinh dưỡng khácnhau như: White (1934), Heller (1953), MS (Murashige and Skoog) (1968),Nish (1969), Knop (1977), Anderson (1984) Trong đó môi trường MS đượcnhiều tác giả công nhận là thích hợp cho nhiều loài thực vật

Các công thức môi trường có nhiều điểm khác nhau nhưng chúng thườnggồm các thành phần cơ bản sau:

* Nguồn Cacbon hữu cơ

Khi nuôi cấy in vitro tế bào, mô thực vật sống chủ yếu theo phương thức

dị dưỡng Vì vậy, cần nguồn cacbon hữu cơ và thường dùng là đường saccaroza

và với liều lượng 10-20g/l Trong một số trường hợp đặc biệt, có thể sử dụngnguồn đường khác như glucoza, maltoza, galactoza va lactoza [9]

* Các nguyên tố đa lượng

Các nguyên tố khoáng chất cần thiết cho thực vật khi nồng độ lớn hơn0,5mM/l gọi là nguyên tố đa lượng

Các nguyên tố: N, P, K, S, Mg, Ca là cần thiết và thay đổi tuỳ theo đốitượng nuôi cấy Nói chung, nồng độ mỗi nguyên tố nói trên trong môi trườnglớn hơn 30g/l Chúng là nguyên liệu để tế bào xây dựng nên thành phần cấu trúccủa mình [9]

* Các nguyên tố vi lượng

Các nguyên tố khoáng cần thiết cho thực vật có nồng độ nhỏ hơn 0,5mM/lgọi là nguyên tố vi lượng

Các nguyên tố vi lượng thường dùng trong môi trường nuôi cấy in vitro:

Fe, Cu, Zn, Mn, Bo, Mo, I, Co Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trongcác hoạt động của enzim Chúng được dùng với nồng độ mỗi nguyên tố nhỏ hơn30mg/l và tuỳ thuộc vào loại môi trường mà hàm lượng và tỷ lệ của chúng sẽthay đổi

Trong đó môi trường nuôi cấy Fe thường được dung dưới dạng muối phức(chetat): Fe- EDTA, Fe- citrate [9]

* Các Vitamin

Mô, tế bào nuôi cấy in vitro có thể tự tổng hợp vitamin nhưng không đủcho hoạt động sống của chúng nên cần bổ sung thêm vitamin vào môi trườngnuôi cấy

Đáng chú ý là các vitamin: thiamin (B1), axit nicotinic (B3), pyridoxine(B6), riboflavin Nồng độ thường dùng khoảng 1mg/l Các vitamin này đóng vaitrò quan trọng trong tế bào vì chúng là các co-enzim

Myo-inositol cần được bổ sung vào một lượng khá lớn 50-100mg/l, chấtnày tỏ ra có tác dụng khá rõ đến sự phân chia của tế bào [9]

* Các chất điều tiết sinh trưởng

Các chất điều tiết sinh trưởng thực vật (phytohoocmon) là các chất hữu cơ

có bản chất hoá học rất khác nhau được tổng hợp với một lượng rất nhỏ ở các cơquan, bộ phận nhất định của cây và từ đấy vận chuyển đến tất cả các cơ quan,các bộ phận khác nhau để điều tiết cho hoạt động sinh lý, các quá trính sinhtrưởng, phát triển của cây và đảm bảo mối quan hệ hài hoà giữa cơ quan, bộphận trong cơ thể Vì vậy nó là thành phần quan trọng bậc nhất trong môi trườngnuôi cấy Nhờ các chất này các nhà nghiên cứu có thể chủ động điều khiển quátrình phát sinh hình thái thực vật in vitro Có hai nhóm chất được sử dụng rộngrãi là auxin và cytokynin

- Nhóm auxin gồm một số hợp chất có chứa nhân indol trong phân tửAuxin gây ra một loạt các biến đổi sinh trưởng của mẫu qua sự hoạt hoá phânchia và giãn nở tế bào, kích thích các quá trình tổng hợp và trao đổi chất, thamgia sự điều chỉnh phân hóa rễ, chồi… Trong vài trường hợp mẫu đã tạo đủ lượngauxin nội sinh cho nhu cầu của chúng không cần bổ sung auxin ngoại sinh

Các auxin thường có hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp, phạm vi sử dụng là0,1-1,0mg/l tuỳ theo mục đích và vật liệu nuôi cấy Các auxin được thêm vào sẽkết hợp với auxin nội sinh để điều khiển chiều hướng và cường độ quá trình sinhtrưởng

Những chất thuộc nhóm auxin hay dụng: NAA (Napthalene acetic acid),IBA (Idol acetic acid), IAA (ido acetic acid), 2,4D (2,4 Dichlophenoxy aceticacid) Chất NAA, IAA dụng cho quá trình ra rễ ở đa số thực vật, và do IAA kémbền nhiệt nên ít dùng 2,4D sử dụng rất hiệu quả trong việc tạo mô sẹo (callus) ởnhiều loại thực vật, nó không dùng trong phương pháp tái sinh cơ quan Auxinthường hoà tan trong etanol hoặc NaOH loãng [11]

- Cytokinin là nhóm các chất điều hoà sinh trưởng dẫn xuất là ađênin, cóvai trò sinh lý tương tự nhau Trong phôi, quả non và trong rễ cytokinin có hàm

lượng cao nhất Cytokinin liên quan chặt chẽ với sự phân bào, duy trì sự trẻ hoácủa các cơ quan, làm giảm hiện tượng ưu thế ngọn, kích thích sự phân hoá chồi

từ các mô sẹo nuôi cấy, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ…

Vì thế trong giai đoạn đầu của của phát sinh phôi soma sự có mặt của auxin làcần thiết những giai đoạn sau phôi phải được nuôi cấy trên môi trường cócytokinin để biệt hoá chồi

Các cytokinin thường sử dụng trong nuôi cấy là: BAP (N6- Benzyl aminopurin), kinetin (6- Furfurry amino purin) với nồng độ biến đổi từ 1-2mg/l thíchhợp cho nhiều loại mô nuôi cấy Các mức độ thấp hơn của cytokinin biểu hiệnhiệu quả kích thích kém, dẫn đến sự tạo chồi và sinh trưởng của chồi giảm Hàmlượng cytokinin cao sẽ hoạt hoá hình thành chồi bất định, chồi nhiều nhưng cókích thước nhỏ, để kéo dài chồi phải chuyển chúng sang môi trường có nồng độcytokinin thấp hơn và có thể bổ sung thêm cả GA3 (Gibbebrellic acid) Ngoài ranồng độ cao của cytokinin có thể kìm hãm sự hình thành và phát triển của rễ.[11] [15]

- Ngoài ra trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật người ta còn sử dụng một sốchất điều hoà sinh trưởng khác như GA (Gibberellin acid), ABA (Abxixic acid)

…

Đặc điểm cơ bản của các GA là kích thích kéo dài dóng, đốt và sự sinhtrưởng của cây Phản ứng kéo dài thân chủ yếu do sự tăng trưởng của tế bào, bêncạnh đó mầm của hạt mà bản chất là hoạt hoá các quá trình tổng hợp enzim thuỷphân tinh bột So với auxin và cytokinin thì GA là nhóm ít dùng vì có biểu hiện

ức chế sinh trưởng và phát sinh hình thái thực vật in vitro, đặc biệt với mô tế bàomột lá mầm GA được đưa vào môi trường trong trường hợp cần thiết để kéo dàichồi bất định hoặc kích thích tái sinh chồi ở một số loài thực vật [15]

Trong nuôi cấy mô tế bào, ABA có tác dụng tạo phôi vô tính, kích thích

sự chín của phôi, kích thích sự phát sinh chồi ở nhiều loài thực vật Các tác dụng

cơ bản của ABA: Tham gia vào sự rụng lá, hoa, quả ở hầu hết các cây trồng vàgây ra sự nứt quả ABA cần được sản sinh khi các yếu tố ức chế cây trồng như

mất nước và nhiệt độ thấp đóng băng Tham gia vào sự ngủ nghỉ, kéo dài thờigian ngủ nghỉ và làm chậm sự nảy mầm của hạt Ức chế sự kéo dài thân và được

sử dụng để kiểm soát sự kéo dài cành, gây ra sự đóng khí khổng Vì vậy ABAđược sử dụng nhằm kìm hãm sinh trưởng của chồi hoặc tham gia bảo quảnlương thực và quỹ gen in vitro Trong nuôi cấy phôi, thêm ABA vào môi trường

là rất cần thiết do ABA giúp phôi chống lại sự khô hoá Ngoài ra, ABA còn kíchthích sự dữ trữ lipit, protein và và cacbonhydrat cần thiết cho phôi nảy mầm.[11]

* Các hợp chất tự nhiên

Là thành phần được sử dụng nhưng không phải là thành phần bắt buộc.Chúng làm tăng thành phần dinh dưỡng và chất có hoạt tính sinh lý cho môitrường nên kích thích sự sinh trưởng và phân hoá của mẫu cây Thường baogồm:

- Nước dừa: Thường chứa các axit amin, axit hữu cơ, đường, ARN, AND.Đặc biệt trong nước dừa có chứa những hợp chất quan trọng cho nuôi cấy invitro đó là: myoinositol, các hợp chất có hoạt tính auxin, các glucosit củacytokinin

Dịch nghiền của một số rau, quả tươi (khoai tây, cà rốt, chuối, táo…).Thành phần hoá học có: đường, axit nucleic, axit amin, vitamin, khoáng…

Dịch thuỷ phân casein (casein hydrolysat) hay peptone chủ yếu được sửdụng làm nguồn bổ sung axit amin

Bột chuối khô hoặc bột nghiền từ chuối xanh được sử dụng trong nuôi cấy

mô một số cây trồng như: phong lan…[9]

* Chất làm đông cứng môi trường- Agar

Agar là một loại polysaccarit của táo Ở 80oC thạch ngậm nước chuyểnsang trạng thái sol, còn ở 40oC thì trở về trạng thái gel Khả năng ngậm nướccủa thạch khá cao: 6- 12g/l nước Thạch ở dạng gel nhưng vẫn để cho các ionvận chuyển dễ dàng và có độ thoáng khí cao Nồng độ trung bình 6-8g/l

* Độ pH của môi trường

pH môi trường nuôi cấy thích hợp cho đa số loại cây dao động từ 5,5-6,0Trường hợp pH thấp thạch có thể không đông sau khi khử trùng, môitrường pH cao làm cứng môi trường

Khi pH<4 và pH>7 sẽ làm kết tủa một số muối vô cơ và phân giải một sốchất hữu cơ dẫn đến làm chết mẫu cấy [9]

PHẦN III: VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU

3.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là cây hoa Cát tường (Eustoma grantdiflorum(Raf.)

3.1.2 Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu vào mẫu ban đầu là chồi, lá của cây hoa Cát tường

3.1.3 Địa điểm nghiên cứu

Các thí nghiệm thuộc giai đoạn in vitro được tiến hành tại phòng nuôi cấy

mô trong điều kiện nhân tạo chủ động điều chỉnh ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm

Các thí nghiệm thuộc giai đoạn in vivo được tiến hành tại khu vườn thínghiệm có mái che, thoáng mát, chế độ tưới sương mù của Viện Di truyền Nôngnghiệp

3.1.4 Thời gian nghiên cứu

Đề tài được thực hiện trong khoảng thời gian 12/01/2010 -> 16/05/2010

3.2 Nội dung, phương pháp nghiên cứu

Môi trường sử dụng trong thí nghiệm là môi trường MS Skoog, 1962) có bổ sung 3% saccarose+ 6,8 g/l agar+ 100 mg/l Inositol và cácchất điều khiển sinh trưởng thực vật theo yêu cầu của mỗi thí nghiệm

(Murashige-Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên và nhắc lại 3 lần

- Giai đoạn 1: Giai đoạn tạo nguồn mẫu ban đầu

Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đến tỷ lệ

sống của mẫu

Các chồi, lá của cây hoa cát tường được rửa sạch bằng nước thường rồingâm trong nước xà phòng lắc kỹ trong 2-3phút Sau đó rửa dưới vòi nước chohết xà phòng rồi tráng lại bằng nước cất cho vào bình tam giác rồi đưa vào

được khử trùng sơ bộ bằng cồn 70% trong 30 giây, việc này còn làm tăng khảnăng tiếp xúc giữa tế bào và hóa chất khử trùng Sau khi loại bỏ nước trong bìnhtam giác chứa mẫu ta khử trùng bằng HgCl2 theo công thức thí nghiệm (bảng3.1) Lấy mẫu ra khỏi dung dịch khử trùng, tráng 3-5 lần bằng nước cất (đã khửtrùng) rồi cấy vào môi trường.

Bảng 3.1: Nghiên cứu các phương pháp khử trùng mẫu

Chất khử

trùng Công thức

Nồng độ(%)

Thời gian khử trùng

(phút)

Số mẫuđưavào

Các mẫu sau khi khử trùng được cấy vào môi trường:

MS+ 3% đường+ 6,8g/l agar+ 100mg/l Inositol (Công thức đối chứng)

- Giai đoạn 2: Giai đoạn tái sinh và nhân nhanh

Ảnh hưởng của phytohoocmon lên khả năng tái sinh và nhân nhanh chồi

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ BAP tới tái sinh và nhân nhanh chồi

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của BAP đến tái sinh và nhân nhanh chồi của cây hoa

Môi trường cơ bản: MS+ 3% đường+ 6,8g/l agar+ 100mg/l Inositol

Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ kinetin tới tái sinh và nhân nhanh chồi

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của Kinetin đến tái sinh và nhân nhanh chồi của cây

Công thức Nồng độ Kinetin (mg/l) Số mẫu cấy

Môi trường cơ bản: MS+ 3% đường+ 6,8g/l agar+ 100mg/l Inositol

Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA tới sự tái sinh và nhân

nhanh chồi

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA tới sự tái sinh và nhân

nhanh chồi của cây hoa Cát tường

Công thức Nồng độ BAP

(mg/l)

Nồng độ NAA(mg/l

Môi trường cơ bản: MS+ 3% đường+ 6,8g/l agar+ 100mg/l Inositol

- Giai đoạn 3: Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh

Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh

Công thức Nồng độ α-NAA (mg/l) Số mẫu cấy

Môi trường cơ bản: MS+ 3% đường+ 6,8g/l agar+ 100mg/l Inositol

Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của tổ hợp α-NAA và IBA tới quá trình ra rễ

Công thức Nồng độ IBA

(mg/l)

Nồng độ α-NAA(mg/l)

Môi trường cơ bản: MS+ 3% đường+ 6,8g/l agar+ 100mg/l Inositol

- Giai đoạn 4: Giai đoạn vườn ươm

Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây in vitro

Bảng 3.7: Ảnh hưởng của các loại giá thể đến khả năng sinh trưởng, tỷ lệ

sống của cây hoa Cát tường

3.3 Điều kiện thí nghiệm

Quá trình nuôi cấy ở điều kiện ánh sáng nhân tạo có:

+ Cường độ chiếu sáng: 2000- 3000 lux

+ Thời gian chiếu sáng: 10 h/ngày

+ Nhiệt độ phòng nuôi cấy luôn ổn định từ 24 – 27 oC

+ Ẩm độ trong phòng nuôi cấy: 60 – 70 %

3.4 Các chỉ tiêu theo dõi

* Thí nghiệm in vitro

Đánh giá kết quả của các thí nghiệm in vitro được theo dõi qua các chỉtiêu:

Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) =

Tổng số mẫu nhiễm

x100Tổng số mẫu khử trùng

Tỷ lệ mẫu sống (%) =

Tổng số mẫu sống

x100Tổng số mẫu sống

Tổng số mẫu sạch

Tổng số chồi nuôi cấy

Chiều cao TB của chồi(cm) = Chiều cao chồi x100

Tổng số chồi theo dõi

Tổng số chồi ra rễ

* Thí nghiệm ngoài vườn ươm

Để đánh giá kết quả ngoài vườn ươm được theo dõi theo chỉ tiêu sau:

Tỷ lệ sống (%) =

Tổng số cây sống

x100Tổng số cây đưa ra giá thể

Chiều dài TB rễ dài nhất(cm) = Tổng chiều dài rễ dài nhất x100

Tổng số rễ dài nhất

3.5 Xử lý số liệu bằng

Xử lý số liệu bằng chương trình IRRISTAT 5.0

PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

- Giai đoạn 1: Giai đoạn tạo nguồn mẫu ban đầu

4.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng

đến tỷ lệ sống của mẫu

Đây là giai đoạn đầu tiên và quyết định sự thành công của toàn bộ quátrình đưa đối tượng nuôi cấy ngoài tự nhiên vào điều kiện nuôi cấy in vitro Giaiđoạn này cần đạt các tiêu chuẩn tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tạiphân hoá và sinh trưởng tốt

Thông thường để khử trùng mẫu người ta thường sử dụng các hoá chấtnhư Clorua thuỷ ngân – HgCl2 , Hypoclorit Canxi – Ca(OCl)2, Hydroperoxi-H2O2 với nồng độ và thời gian thích hợp