Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro giống gừng trâu (zingiber officinale (willd ) roscoe)

Trong khi đó việc nhân nhanh giống gừng bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào có ưu điểm là cây nuôi cấy in vitro sạch bệnh ngay từ đầu, cây con tạo ra đồng đều về chất lượng và tuổi sinh l

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN PHƯƠNG QUÝ

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG

QUY TRÌNH NHÂN NHANH IN VITRO GIỐNG GỪNG TRÂU

(ZINGIBER OFFICIALE (WILLD.) ROSCOE)

Hà Nội - 12/2017 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN PHƯƠNG QUÝ

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG

QUY TRÌNH NHÂN NHANH IN VITRO GIỐNG GỪNG TRÂU

(ZINGIBER OFFICIALE (WILLD.) ROSCOE)

Hà Nội - 12/2017

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Lê Khả Tường

TS Lê Quỳnh Mai

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian từ khi bắt đầu làm luận văn đến nay, em đã nhận được

sự quan tâm, chỉ bảo, giúp đỡ của thầy cô, gia đình và bạn bè xung quanh

Với tấm lòng biết ơn vô cùng sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất

từ đáy long đến quý Thầy Cô Khoa Sinh học của trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội đã dùng những tri thức và tâm huyết của mình để

có thể truyền đạt cho chúng em trong vốn kiến thức quý báu suốt thời gian học tập tại trường

Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn GS TSKH Lê Khả Tường và TS Lê Quỳnh Mai đã tận tâm chỉ bảo hướng dẫn em qua từng buổi học, từng buổi nói chuyện, thảo luận về đề tài nghiên cứu Nhờ có những lời hướng dẫn, dạy bảo đó, bài luận văn này của em đã hoàn thành một cách suất sắc nhất Một lần nữa, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy cô

Luận văn này đã được hoàn thành tại Trung tâm tài nguyên Thực vật Để đạt được kết quả này, em xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới ban lãnh đạoTrung tâm tài nguyên Thực vật, phòng ngân hàng gen invitro và đặc biệt xin gửi lời cảm ơn đến cô Phạm Thị Kim Hạnh đã trực tiếp tận tình chỉ bảo, dìu dắt, giúp đỡ em Nhờ những sự chỉ bảo hường dẫn quý giá đó mà trong suốt quá trình triển khai, nghiên cứu và hoàn thành đề tài một cách tốt nhất

Em xin được gửi lời cảm ơn tới ban giám hiệu cùng các đồng nghiệp tại Trường Đại học Hùng Vương nơi em đang học tập và công tác đã tạo điều kiện tốt nhất để em có thể tập trung học tập hoàn thành tốt luận văn này

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 3

1.1 Đặc điểm hình thái, thành phần dinh dưỡng cây gừng 3

1.1.1 Đặc điểm hình thái 3

1.1.2 Thành phần hóa sinh, dinh dưỡng của gừng 4

1.1.3 Đặc điểm của giống gừng G10 6

1.2 Công nghệ nuôi cấy lát mỏng tế bào 7

1.2.1 Ưu điểm - Nhược điểm công nghệ nuôi cấy lát mỏng tế bào 7

1.2.2 Ứng dụng của công nghệ nuôi cấy lớp mỏng tế bào 8

1.2.3 Kỹ thuật nuôi cấy ngoài vườn ươm 9

1.3 Những nghiên cứu về nuôi cấy mô cây gừng 10

1.3.1 Những nghiên cứu trên thế giới 10

1.3.2 Những nghiên cứu trong nước 14

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Vật liệu nghiên cứu 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu 17

2.2.1 Phương pháp đánh giá đặc điểm nông sinh học 17

2.2.2 Phương pháp khử trùng mẫu 18

2.2.3 Phương pháp nuôi cấy lớp tế bào mỏng từ các lát cắt tế bào 18

2.2.4 Phương pháp nuôi trồng ngoài vườn 18

2.2.5 Môi trường nuôi cấy in vitro 18

2.2.6 Bố trí thí ngiệm 19

2.2.7 Thu thập số liệu 21

2.2.8 Phân tích và xử lý số liệu 22

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Kết quả điều tra, đánh giá đặc điểm sinh học giống gừng G10 24

3.2 Nghiên cứu quy trình nhân giống vô tính in vitro cho giống gừng G10 25

3.2.1 Thiết lập hệ nuôi cấy vô trùng 25

3.2.2 Nghiên cứu môi trường nuôi cấy tạo chồi và callus từ lát cắt mô non 27

3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng nhân và tạo chồi của callus 29

3.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng nhân nhanh chồi được tạo thành từ lát cắt mô non 32

3.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đên sự phát triển hoàn chỉnh cây con in vitro 34

3.3 Nghiên cứu quy trình nuôi trồng ngoài vườn ươm cho giống gừng G10 37

3.3.1 Nghiên cứu huấn luyện cây trước khi đưa ra vườn ươm 37

3.3.2 Ảnh hưởng của giá thể đến cây ngoài vườn ươm 38

3.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của phân bón đến cây ngoài vườn ươm 40

3.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đến cây ngoài vườn ươm 41

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.2 Diện tích, năng suất, sản lượng gừng ở một số nước trên thế giới 11 Bảng 2.1 Phương pháp đánh giá sinh trưởng, phát triển 17 Bảng 2.2 Thành phần môi trường MS 19 Bảng 3.1 Đặc điểm nông sinh học của một số giống gừng được trồng tại

trung tâm tài nguyên Thực vật 24 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến sinh trưởng của mẫu chồi 25 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng phát sinh hình thái của

mẫu lát cắt mô non (sau 6 tuần) 27 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của chất điều hóa sinh trưởng đến khả năng nhân của

callus và hình thái callus sau giai đoạn nhân 29 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của casein hydrolysate đến quá trình phát sinh phôi và

tái sinh của callus 31 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của VTM B1 đến khả năng nhân và sức sống của chồi 33 Bảng3.7 Ảnh hưởng của NAA đến sinh trưởng và phát triển cây con in vitro

34 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của trạng thái môi trường đến sinh trưởng của cây gừng

G10 (sau 15 ngày) 36 Bảng 3.9 Ảnh hưởng của thời gian tập huấn cây gừng G10 trước khi đưa ra

vườn ươm 37 Bảng 3.10 Ảnh hưởng của các loại giá thể đến tỷ lệ sống của cây con giống

gừng G10 ngoài vườn ươm (sau 1 tháng) 39 Bảng 3.11 Ảnh hưởng của phân bón đến cây con ngoài vườn ươm 40 Bảng 3.12 Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sinh trưởng cây gừng G10

ngoài vườn ươm 42

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình thái các bộ phận cây Gừng (Zingiber officinale)[36] 4

Hình 3.1 Mẫu nuôi cấy sau khi khử trùng 26

Hình 3.2 Mẫu cát lát được nuôi cấy trong môi trường 28

Hình 3.3 Hệ số nhân callus tương ứng với các hàm lượng NAA bổ sung trong môi trường nuôi cấy 30

Hình 3.4 Mẫu trong môi trường nhân nhanh callus 30

Hình 3.5 Mẫu nuôi cấy trong môi trường bổ sung 1,5g/l casein hydrolysate sau 1,5 tháng 32

Hình 3.6 Chồi được nuôi cấy trong môi trường bổ sung vitamin B1 34

Hình 3.7 Cây gừng G10 in vitro trong môi trường ra rễ sau 1 tháng 35

Hình 3.8 Cây ra rễ ở môi trường lỏng sau 15 ngày nuôi cấy 37

Hình 3.9 Cây con ở cường độ ánh sáng 5000lux sau 8 tuần 43

MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài

Gừng (Zingiber officinale Rosc) là cây dược liệu truyền thống ở Việt Nam

cũng như ở nhiều nước nhiệt đới và cận nhiệt đới với mục đích chủ yếu là làm gia

vị, thực phấm và dược liệu Tại các nước phương Tây, gừng được sử dụng làm nguyên liệu cho việc sản xuất bánh nướng, bánh ngọt, mứt tết… Bia gừng và rượu gừng cũng được sử dụng rộng rãi làm đồ uống hay thực phẩm chức năng Đặc biệt, gừng còn được sử dụng như một loại dược liệu truyền thống hỗ trợ điều trị các bệnh tiêu hóa, thần kinh, tim mạch và xương khớp [2] Để cung cấp nguyên liệu cho các nhà máy chế biến, gừng được sản xuất tại nhiều nước trên thế giới như Ấn Độ, Trung Quốc, Jamaica, Đài Loan… Theo kết quả thống kê chưa đầy đủ, sản lượng tiêu thụ gừng trên thế giới đạt khoảng 2,5 triệu tấn/năm [42] Trong đó đứng đầu là

Ấn Độ, Trung Quốc, Indonesia, Vương quốc Anh, Hoa Kỳ, Ả Rập Saudi, Nepal và Thái Lan với sản lượng khoảng 1,7 triệu tấn/năm, tương ứng với 70% sản lượng gừng toàn cầu[42]

Gừng là cây trồng có hoa nhưng lại không có khả năng hình thành hạt vì vậy việc nhân giống và phát triển các thế hệ tiếp theo đều được thực hiện bằng con đường sinh sản vô tính từ củ gừng Với phương pháp nhân giống truyền thống từ việc phân chia hom từ nguồn củ sống trên đồng ruộng có nhiều nhược điểm như nguy cơ lây nhiễm bệnh cao, các hom giống không đồng nhất về tuổi sinh lý, tiêu tốn nhiều số lượng củ giống Từ đó làm tăng giá thành sản xuất và tăng chi phí đầu

tư Các giống gừng năng suất cao chưa được chọn lọc bài bản Các yếu tố này làm cản trở việc gừng thành hàng hóa và xuất khẩu gừng ở nước ta

Trong khi đó việc nhân nhanh giống gừng bằng công nghệ nuôi cấy mô tế

bào có ưu điểm là cây nuôi cấy in vitro sạch bệnh ngay từ đầu, cây con tạo ra đồng

đều về chất lượng và tuổi sinh lý với số lượng lớn kết hợp với khâu chọn giống tốt, công nghệ vườn ươm và các biện pháp phòng trừ tổng hợp tạo ra được ngành công nghệ sản xuất gừng chất lượng cao Kỹ thuật nhân giống gừng bằng phương pháp

nuôi cấy mô tế bào đã thành công ở nhiều nước châu Á như tại Malayxia, Indonesia

và Ấn độ Nhân dòng vô tính gừng thông qua nhân nhanh chồi đỉnh đã được công

bố bởi Hosoki & Sagawa(1977), Balachandran(1990), Rout & Das(1997) Nhờ phương pháp này có thể tăng nhanh diện tích sản xuất những giống gừng có chất lượng cao, sạch bệnh đồng thời nhân giống bằng nuôi cấy mô có thể giảm mức đầu

tư giống tiết kiệm đến 40% chi phí giống ban đầu [3] Tuy vậy hiện nay ở nước ta

do tốc độ phát triển nhanh của cây gừng nên công nghệ nuôi cấy mô gừng thông thường vẫn chưa có đủ khả năng đáp ứng được nhu cầu khối lượng cây giống cho

các địa phương Nuôi cấy in vitro với công nghệ nuôi cấy lát mỏng phát sinh callus

trong môi trường phù hợp, sau một thời gian ngắn có thể tạo ra một khối lượng lớn callus để tái sinh thành cây hoàn chỉnh là một giải pháp mới có khả năng sản xuất hàng loạt cây giống đạt tốc độ nhanh nhất nhằm khắc phục những hạn chế nêu trên của nuôi cấy mô truyền thống

Kết hợp với nhu cầu thị trường, hiện nay giống gừng trâu (G10) đã được chọn lọc có chất lượng tốt và phát triển rất mạnh ở Trung Quốc và đang là giống gừng có tiềm năng phát triển lớn ở Việt Nam[18]

Trên cơ sở đó chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xây dựng quy

trình nhân nhanh in vitro giống gừng trâu (Zingiber officinale (Willd.)

Roscoe)” tại Phòng nuôi cấy mô thuộc Ngân hàng gen cây trồng quốc gia - Trung

tâm Tài nguyên Thực Vật - Viện khoa học nông nghiệp Việt Nam

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI

1.1 Đặc điểm hình thái, thành phần dinh dưỡng cây gừng

Cây gừng Zingiber officinale (Willd.) Roscoe thuộc ngành Ngọc Lan

(Magnoliophyta), lớp Hành (Liliopsida), phân lớp Thài Lài (Commelinidae), bộ

Gừng (Zingiberales), họ Gừng (Zingiberaceae), chi Zingiber Gừng có nguồn gốc

nhiệt đới thuộc vùng Ấn Độ-Malaysia từ thời cổ đại

1.1.1 Đặc điểm hình thái

Hình thái cơ bản của loài gừng trồng (Zingiber officinale) bao gồm các bộ

phận cơ bản là thân rễ, thân giả, lá và hoa

Thân rễ còn gọi là củ, có hình thái rất đa dạng, nằm ngang dưới mặt đất Thân rễ được chia thành nhiều nhánh cùng nằm trên một mặt phẳng, mỗi nhánh lại chia thành nhiều đốt Trong điều kiện nhiệt độ và độ ẩm đất thích hợp, sau trồng 2 tuần trên thân rễ mẹ (còn gọi củ hay hom giống) xuất hiện mầm và nhiều lông hút Sau trồng 4 tuần, hệ thống lông hút bắt đầu thực hiện chức năng hấp thu nước và dinh dưỡng để cung cấp cho mầm Sự phát triển của mầm chính là sự hình thành các chồi hướng lên mặt đất và các chồi khác nằm ngang dưới mặt đất Các chồi hướng lên mặt đất sẽ phát triển thành thân giả và lá khí sinh làm nhiệm vụ quang hợp Các chồi nằm ngang dưới mặt đất sẽ hình thành các nhánh của thân rễ trên cùng một mặt phẳng Sự tăng tiến về kích thước và khối lượng thân rễ đạt giá trị cực đại sau trồng 8-10 tháng tùy thuộc vào giống và điều kiện canh tác Chất lượng

củ của mỗi giống thường đạt giá trị cao nhất vào thời điểm bộ lá bắt đầu chuyển sang màu vàng [14]

Thân giả được hình thành do các bẹ lá ôm chặt lấy nhau, không phân nhánh Cây thường có mùi thơm hay hắc tùy thuộc vào đặc điểm của các giống [14] Lá đơn, mọc cách, các lá xếp thành hai hàng, thường hướng lên trên, đôi khi nằm ngang gần như song song với mặt đất; có khi lá chỉ là bẹ lá dạng vảy Lá gồm các phần: bẹ lá, cuống lá, lưỡi lá và phiến lá; Bẹ lá: mở đến gốc Cuống lá

hình lòng máng nông hoặc sâu Lưỡi lá là phần giữa bẹ lá và cuống lá, từ bẹ lá kéo dài lên Phiến lá hình mác, trứng hẹp, bầu dục, ít khi hình tròn, gốc phiến nhọn, hình nêm hay gần tròn; đầu phiến thường nhọn, đôi khi thót nhỏ thành

dạng đuôi Cụm hoa: Cụm hoa mọc từ thân rễ sát mặt đất, có hình dạng chùy,

không phân nhánh [35]

Hình 1.1 Hình thái các bộ phận cây gừng (Zingiber officinale)[36]

AS: Thân giả, R: Thân rễ, F1: Hoa, P: Cuống hoa, S: Cụm hoa

1.1.2.Thành phần hóa sinh, dinh dưỡng của gừng

Cây gừng là cây gia vị, cây dược liệu truyền thống ở các vùng nhiệt đới trên

thế giới Thành phần sinh hoá của gừng rất đa dạng và phong phú với trên 400 hợp chất sinh học có giá trị dược lý khác nhau trên cơ thể người và động vật Cùng với

sự đa dạng về thành phần dinh dưỡng, mùi thơm và vị cay của gừng là những yếu tố căn bản tạo nên những món ẩm thực hấp dẫn đồng thời là nguyên liệu không thể thiếu trong công nghệ chế biến thực phẩm ở nhiều nước trên thế giới Đặc biệt gừng còn được sử dụng như một loại dược liệu truyền thống hỗ trợ điều trị các bệnh tiêu hóa, thần kinh, tim mạch và xương khớp

Các nhà khoa học đã khẳng định tinh dầu là thành phần sinh hoá quan trọng nhất của gừng Tinh dầu có mặt trong tất cả các bộ phận của cây gừng nhưng ở củ

có hàm lƣợng cao nhất [21] Củ gừng chứa 2 - 3% tinh dầu (Bảng 1.1) với thành phần chủ yếu là các hợp chất hydrocarbon sesquiterpenic: β-zingiberen (35%), ar-curcumenen (17%), β-farnesen (10%) và một lƣợng nhỏ các hợp chất alcol monoterpenic nhƣ geraniol, linalol, borneol Trong nhựa dầu chứa 20 - 25% tinh dầu và 20 - 30% chất cay Thành phần chủ yếu của chất cay là zingeron, shogaol và gingerol Trong tinh dầu gừng còn chứa α-camphen, β-phelandren, eucalyptol và các gingerol Cineol trong gừng có tác dụng kích thích khi sử dụng tại chỗ và có tác dụng diệt khuẩn trên nhiều chủng loại khác nhau [27]

Bảng 1.1 Thành phần sinh hóa gừng khô (trong 100 g) [21]

Với công dụng làm thực phẩm và dược liệu, trên thế giới hiện nay nhu cầu tiêu thụ gừng đạt khoảng 2,5 triệu tấn để cung cấp nguyên liệu cho các nhà máy chế biến

1.1.3 Đặc điểm của giống gừng G10

a, Nguồn gốc

Trên cơ sở khảo sát đánh giá nguồn gen gừng từ ngân hàng gen cây trồng quốc gia năm 2006, Trung tâm tài nguyên thực vật đã phân lập 230 nguồn gen gừng thành những nhóm giống khác nhau Trong đó nhóm giống có tiềm năng năng suất cao, chống chịu khá gồm 10 giống mang ký hiệu G1, G1, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9 và G10 đã được so sánh tại ngân hàng gen cây trồng quốc gia giai đoạn 2007-

2009 Trong đó giống G10 luôn được đánh giá cao nhất về sinh trưởng, chống chịu

và năng suất Giống G10 có nguồn gốc từ giống Hongya - Trung quốc, được Hội giống cây trồng Việt Nam nhập nội năm 2005 Trên cơ sở đó giống G10 đã được khảo nghiệm cơ bản tại Bắc Kạn, Hòa Bình và Hưng Yên cùng với các giống đối chứng địa phương trong giai đoạn 2010-2012[18]

b, Đặc điểm hình thái

Giống G10 có khả năng sinh trưởng phát triển, thích ứng tốt, có tiềm năng năng suất cao Theo các số liệu từ các tỉnh Bắc Kạn, Hòa Bình và Hưng Yên, giống gừng G10 có các chỉ tiêu phát triển vượt trội thời gian sinh trưởng 250 - 260 ngày, chiều cao cây 70,6- 73,4 cm, chỉ số diện tích lá cao nhất vào giai đoạn sau mọc 150 ngày, tương ứng với 4,66- 5,43 m2lá/m2 đất, đường kính củ đạt 24-26 cm, năng suất đạt 30,6-32,5 tấn/ha[18]

c, Thành phần dinh dưỡng

Giống gừng trâu G10 có đầy đủ các thành phần sinh hóa trong củ như các giống gừng khác Kết quả nghiên cứu trên giống G10 được nuôi trồng tại Bắc Kạn, Hòa Bình và Hưng Yên cho thấy trong các giống gừng triển vọng ở khu vực, giống gừng trâu G10 có hàm lương vitamin C 9,67 mg/ 100g là một trong những giống gừng có hàm lượng vitamin C cao nhất, đặc biệt về chỉ tiêu hàm lượng tinh dầu và kẽm thì giống G10 đạt cao nhất với hàm lượng tinh dầu lên đến 4,91 g/100mg và hàm

lượng kẽm 1,88mg/ 100g chất khô Từ đó kết luận giống gừng trâu G10 là giống có chất lượng cao nhất trong bộ giống gừng triển vọng được khảo nghiệm[18]

1.2 Công nghệ nuôi cấy lát mỏng tế bào

Trong các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, công nghệ nuôi cấy lát mỏng tế bào có được nhiều ưu điểm phù hợp cho phát triển gừng

1.2.1 Ưu điểm - Nhược điểm công nghệ nuôi cấy lát mỏng tế bào

Lớp mỏng tế bào bao gồm các lớp tế bào (từ 3-4 lớp tế bào) được cắt ngang và dọc khi nuôi cấy Lớp mỏng tế bào thường thuô ̣c 1-2 loại mô nhất định của một cơ quan thực vâ ̣t Người ta sử du ̣ng phương pháp nuôi cấy lớp mỏng để nghiên cứu sự tương tác giữa các mô trong q uá trình phát sinh cơ quan hoặc để nâng cao khả năng tái sinh của tế bào Lớp mỏng tế bào đă ̣c biê ̣t phản ứng nhanh với môi trường , nhanh chóng ta ̣o được các chương trình biê ̣t hóa và tái sinh cây đồng nhất Các lát mỏng nếu được nuôi cấy trong môi trường thích hợp sẽ hình thành cấu trúc giống phôi gọi là callus, các thể này có thể nhân nhanh với số lượng lớn và biệt hóa thành chồi mà không cần thông qua trung gian mô sẹo Từ số lượng ít mẫu ban đầu, sau

khi đưa vào nuôi cấy in vitro, áp dụng công nghệ nuôi cấy lớp mỏng phát sinh

callus kết hợp với môi trường phù hợp, sau một thời gian ngắn tạo ra số lượng lớn callus, sau đó tái sinh thành cây

Với số lượng mẫu ban đầu nhỏ, ứng dụng công nghệ nuôi cấy lớp mỏng tế bào

ta dễ dàng thu được số lượng lớn callus sau đó thu được số lượng lớn cây con

Ứng dụng công nghệ nuôi cấy lớp mỏng tế bào, khi cắt mẫu, các mô thực vật

bị tổn thương, nhiều enzyme hoặc các polysacharide sinh ra rất cần cho quá trình cảm ứng sinh trưởng và phát triển của thực vật Các tế bào của lát mỏng được tiếp xúc trực tiếp với môi trường nuôi cấy, từ đó sự phát sinh hình thái được thể hiện ở hầu hết các tế bào, với những lát cắt mô rất mỏng (không quá 1mm) thì mọi tế bào của đối tượng đều tham gia vào hoạt động hút các chất[19]

Lớp mỏng tế bào đặc biệt phản ứng nhanh với môi trường, nhanh chóng tạo được các chương trình biệt hóa và tái sinh cây đồng nhất Tùy theo mục tiêu nghiên cứu mà độ dày của lớp mỏng có thể khác nhau, đối với nhân nhanh có thể sử dụng

lát cắt mô hoặc cơ quan Từ lớp mỏng tế bào có thể hình thành mô sẹo phôi hóa, phôi, chồi, củ siêu nhỏ pử các loại cây thân thảo, đặc biệt là cây khó tái sinh như cây ngũ cốc, thân gỗ[41]

Sản phẩm tạo ra từ nuôi cấy lát mỏng tế bào có đặc điểm là đồng đều về mặt sinh lý, di truyền và có thể ứng dụng cho mọi loại thực vật Tuy nhiên điều kiện môi trường lý tưởng phù hợp cho sự tồn tại của mẫu còn phụ thuộc vào loài và phải thử nghiệm lại tất cả các điều kiện in vitro bao gồm chất dinh dưỡng, chất điều hòa sinh trưởng, ánh sáng, nhiệt độ,…[44]

1.2.2.Ứng dụng của công nghệ nuôi cấy lớp mỏng tế bào

Nuôi cấy tế bào lớp mỏng đã được ứng du ̣ng ở nhiều loa ̣i cây trồng , đặc biệt đươ ̣c ứng du ̣ng ở rất nhiều loài lan Từ lớp mỏng tế bào có thể hình thành mô sẹo phôi hóa, phôi, chồi, củ siêu nhỏ ở các loại cây thân thảo , đă ̣c biê ̣t là cây khó tái sinh như cây ngũ cốc , thân gỗ [41].Công trình nghiên cứu đầu tiên về nuôi cấy lớp mỏng tế bào được Trần Thanh Vân (1973) thực hiê ̣n ở cây thuốc là Nicotiana tabacum [45] Sau đó, nhiều công trình nghiên cứu cơ bản về kỹ thuâ ̣t nuôi cấy lớp

mỏng tế bào đã được thực hiện Ở cây 1 lá mầm, để tạo cây phôi vô tính người ta sử dụng phương pháp cắt lớp mỏng tế bào ngang [10] Kết quả nghiên cứu cho thấy quy trình thích hợp có tần số tạo chồi cao được thực hiện thành công trên các đối

tương như: Trên cây Măng cụt (Garcinia mangostana), lát cắt dọc từ hạt và lóng

thân cây con cho thấy sự tạo chồi thích hợp ở 1-2mg/l BAP với 8,4 chồi/lát mỏng ở hạt và 17,3 chồi/lát mỏng ở lóng thân Các tỉ lệ tạo chồi tương ứng là 91,6% ở thạt

và 60% ở lóng thân [12] Lát cắt dọc trên chồi non cây cam (Poncirus trifoliate) 1

năm tuổi cho số chồi cao nhất là 33 chồi/lát mỏng với các nồng độ BAP 3mg/l; NAA 0,5mg/l và hiệu suất là 90% [10]

Năm 2000, Hoàng Thị Nga đã nghiên cứu ứng dụng phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào trong nhân nhanh một số giống hoa lan Vật liệu khởi đầu là

mắt ngủ, sau đó mắt ngủ phát triển thành chồi, tiến hành cắt lát mỏng chồi in

vitro này và nghiên cứu sự ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng (ĐHST)

Kinetin, NAA, IAA, 2,4-D đối với sự cảm ứng phát sinh thể pro của lát cắt tế

bào cũng như sự phát triển tiếp của chồi hình thành từ thể pro [12] Đây là một hướng rất tốt để nâng cao hệ số nhân nhanh và đảm bảo sự đồng đều về mặt di truyền đối với một lượng lớn cá thể tạo thành Nếu phương pháp này được kết hợp với phương pháp tạo nguồn vật liệu ban đầu tốt thì đây sẽ là hướng để phát triển lên quy mô công nghiệp

Tuy nhiên công nghệ nuôi cấy lát mỏng tế bào cây gừng thì hiện tại trong nước chưa có công trình nghiên cứu nào công bố Trong các công trình của nước ngoài rất ít tài liệu nhắc đến

1.2.3 Kỹ thuật nuôi cấy ngoài vườn ươm

Tuy nhiên việc ứng dụng các công nghệ hiện đại chỉ có thể đa ̣t kết quả cao

khi cây giống in vitro đươ ̣c đưa ra vườn ươm với giá thể trồng và các điều kiê ̣n

chăm sóc thích hợp Đặc điểm cơ bản trong vườn ươm hiện đại là giá thể , thành phần quang phổ , cường độ và thời gian chiếu sáng , đô ̣ ẩm và nhiê ̣t đô ̣ không khí , các kỹ thuật tưới bón thích hợp Hê ̣ thống vườn ươm thích hợp giúp cho cây sinh trưởng tốt hơn trong thời gian ngắn hơn[19]

Giá thể: Giá thể là nơi trụ bám của hệ rễ , ảnh hưởng đến sinh trưởng , phát

triển của cây Giá thể cho gừng gồm những vâ ̣t liê ̣u dễ kiếm rẻ tiền như: đất phù

sa, cát,trấu hun, xơ dừa, cũng có khi rất đắt tiền như rong biển đã qua xử lý, hay các loại giá thể đã tổng hợp đươ ̣c phối trô ̣n công phu Tuy nhiên cần lưu ý đặc điểm của mỗi loại giá thể để sử dụng cho hợp lý

Nhiệt độ: mỗi loài cây sẽ có nhiệt độ sinh trưởng thích hợp khác nhau Các

giống gừng thường được nuôi trồng thích hợp ở nhiệt độ từ 20ºC đến 28ºC

Ánh sáng: Thực vật cần năng lượng nhất định đủ để sinh trưởng phát triển,

sự sinh trưởng của cây gừng có thể bị đình trệ hoặc cháy lá khi nhiệt độ cao và thừa lượng ánh sáng

Phân bón: Theo các tác giả Trần Văn Huân, Văn Tích Lượm chỉ ra các loại

phân bón thường sử dụng cho cây in vitro là Growmore, Yogen, Miracrle, HVP,

Phân bón đầu trâu, phân cá (Fish emulsion)[8] Nhóm vô cơ hỗn hợp: phối hợp 3 loại cơ bản N, P, K và các vi lượng + 1 ít sinh tố nhóm B Để thuận tiện cho việc sử

dụng thích hợp với từng giai đoạn phát triển của cây, các nhà khoa học đã sản xuất

ra nhiều phân bón vô cơ hỗn hợp với nhiều công thức có tỉ lệ N:P:K khác nhau Công thức 30:10:10 có tác dụng phát triển lá, sử dụng cho nhóm cây con, cây mới

ra ngôi hoặc cây mới tách chiết

Công thức cân bằng 20:20:20 dùng cho nhóm cây đã lớn giúp cho cây phát triển cân đối và cứng cáp Công thức 15:30:15 hoặc 7:17:35 sử dụng cho nhóm cây

đã phát triển và sẵn sàng ra hoa Muốn sử dụng phân bón được tốt nhất cần các điều kiện ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm thích hợp, vì vậy nên chọn những ngày trời quang có ánh nắng đầy đủ và nên bón vào buổi sáng, khi ánh nắng còn dịu, tránh bón phân sau 10h vì khi đó ánh nắng và nhiệt độ đã gay gắt không có lợi Trước khi bón nên tưới nước qua 1 lượt để tạo độ ẩm thích hợp, chờ một lát cho lá khô bớt khi đó mới bón phân, đây là lúc cây có thể hấp thụ tốt nhất Những ngày bón phân buổi chiều nên tưới đẫm cho cây để có thể rửa trôi hết những phân bón lần trước mà cây không

sử dụng hết, như vậy sẽ an toàn cho cây hơn, không nên bón phân vào ngày mưa vì phân sẽ bị trôi[8]

Như vậy, Công nghệ nhân giống lựa chọn của đề tài là công nghê ̣ nuôi cấy lát mỏng tế bào, gây tổn thương, phương pháp tạo phôi vô tính, tái sinh cây nhân

nhanh, hoàn thiên cây con và kĩ thuật ngoài vườn ươm sau in vitro

1.3 Những nghiên cứu về nuôi cấy mô cây gừng

1.3.1 Những nghiên cứu trên thế giới

Gừng đã được sản xuất tại nhiều nước trên thế giới Tổng sản lượng của gừng trên thế giới năm 2014 là 1.683,00 nghìn tấn với tổng diện tích 310.430 ha Trung Quốc, Ấn Độ, Nepal và Thái Lan là nhà sản xuất chính của gừng trên thế giới, tương ứng với sản lượng 396,60; 385,330; 210,790 và 172,680 tấn Đặc biệt trong giai đoạn 2008 - 2011 Ấn Độ được xem là nước có tốc độ tăng trưởng sản lượng gừng cao nhất trên thế giới [42] Sản xuất gừng trên thế giới trong những năm gần đây có xu hướng tăng lên do nhu cầu tiêu thụ tăng cao, đặc biệt là trong chế biến

thực phẩm, gia vị và thuốc chữa bệnh[42]

Bảng 1.2.Diện tích, năng suất, sản lượng gừng ở một số nước trên thế giới

Quốc gia Diện tích

(nghìn ha) Năng suất (tấn/ha) (nghìn tấn) Sản lượng

xơ là nội dung trọng tâm của các nước trồng gừng trên thế giới Theo hướng này trường Đại học Nông nghiệp Orissa và các Trung tâm AICRPS tại Himachal Pradesh thuộc Ấn Độ đã tiến hành thu thập, nhập nội, đánh giá tuyển chọn với số lượng hàng trăm mẫu giống/năm trong giai đoạn 1999-2000 [21]

Nghiên cứu phát triển nguồn gen gừng có năng suất, chất lượng và chống chịu cao luôn là mong ước của các nhà chọn tạo giống Theo hướng đó Viện nghiên cứu dược liệu Ấn Độ đã nghiên cứu, tuyển chọn và phát triển giống gừng từ ngân hàng gen cây trồng quốc gia Giống Calicut là một nguồn gen đã được khai thác theo định hướng ấy Calicut đã được đánh giá là có nhiều triển vọng với năng suất

cao trung bình 23,2 tấn/ha, hàm lượng chất khô 23,0%, hàm lượng dầu tổng số 1,72%, Oleoresin (nhựa dầu) 4,48%, chất xơ 3,26% đồng thời là một giống chín sớm vào ngày thứ 200 sau trồng và chống chịu khá với bệnh thối rễ [46] Hiện nay Calicut là một trong những giống gừng thương mại được sản xuất với quy mô lớn tại nước này Nghiên cứu tuyển chọn những giống gừng có chất lượng cao đáp ứng nhu cầu thị trường trong và ngoài nước từ lâu đã thu hút các nhà khoa học Ấn Độ Ghana, một vùng đất có lịch sử lâu đời về sản xuất, chế biến và xuất khẩu các sản phẩm gừng đã và đang là điểm nghiên cứu thu hút nhiều nhà chọn tạo giống đến từ các viện và trường đại học của Ấn Độ [42] Nghiên cứu chọn tạo giống có hàm lượng gingerol cao là một trong những mục tiêu hàng đầu của Ấn Độ nhằm cạnh tranh với thị trường đang diễn ra gay gắt tại Hoa Kỳ vào trước những năm 2000 Để thực hiện mục tiêu này các nhà khoa học đã tiến hành tuyển chọn 2 giống số 1 và số

2, có nguồn gốc Ấn Độ Hai giống số 1 và số 2 đã được nghiên cứu tại 2 tiểu vùng khí hậu khác nhau với kết quả là giống số 2 có hàm lượng 6 -10% gingerol, tăng 3 -

5 lần so với các giống gừng thương mại hiện đang có mặt tại Hoa Kỳ Giống số 2 hiện đã và đang là giống thương mại của vùng Ghana và các vùng có điều kiện tương tự với quy mô 3000 ha/năm và mang lại một nguồn thu nhập đáng kể cho người dân vùng chuyên canh gừng ở Ghana Khai thác phát triển nguồn gen gừng theo hướng chống chịu và thích ứng với biến đổi khí hậu hiện đang là một quan tâm lớn của nhiều nhà khoa học trên thế giới A Mishra, S K Mohanty đã khai thác phát triển 7 nguồn gen gừng theo hướng chống chịu hạn Kết quả cuối cùng đã tuyển chọn được 3 giống tính chịu hạn cao là ACC-35, ACC-117 và SG-666 Các giống này được đánh giá là chịu hạn khá trong hầu hết các thời kỳ sinh trưởng, phát triển Hiện nay các giống này đã trở thành giống chủ lực cho các vùng khô hạn hay có lượng mưa thấp < 600 mm/năm, đồng thời là nguồn vật liệu quan trọng của các chương trình chọn tạo giống chống chịu ở nhiều bang của Ấn Độ và các nước có điều kiện tương tự[42]

Áp dụng công nghệ nuôi cấy mô trong nhân giống gừng sạch bệnh

Việc nhân giống gừng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào đã cho kết quả khả quan ở nhiều nước Đông Nam Á như ở Malayxia, Indonesia và Ấn Độ [45] Nhờ phương pháp này có thể tăng nhanh diện tích sản xuất những giống gừng có chất lượng cao, sạch bệnh Nhân giống vô tính gừng thông qua nhân nhanh chồi đỉnh đã được công bố bởi Hosoki và Sagawa, 1977[33]; Balachandra, 1990[26]; Rout và Das, 1997[38] Tại Indonexia các thí nghiệm nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô từ chồi non ở nách lá của loài gừng đen (Z.spectabile) trong môi trường Murashige-Skoog có bổ sung chất điều hoà sinh trưởng IAA (indole-3-acetic acid), NAA (Naphthalene - acetic acid) và BA (6-benzyladenin) đã cho kết quả cao

và được xem là một phương pháp quan trọng để khuyến cáo cho các vùng trồng gừng [47]

Những nghiên cứu đã tìm ra phương pháp nuôi cấy gừng hiệu quả cho 6 loài gừng địa phương ở Bangladesh Môi trường hiệu quả tạo Callus là MS + 1mg/l IAA + 3mg/l BAP, môi trường tái sinh chồi là MS + 4mg/l BAP + 3mg/l kinetin + 1mg/l IAA, môi trường tạo rễ là MS/2 + 2mg/l IBA + 2mg/l NAA, đạt 43,46% số mẫu tạo

rễ Cây ra vườn ươm có tỉ lệ sống sót và sinh trưởng tốt đạt 66,67-84,62%[22]

Nghiên cứu của tác giả S Sathyagowri (2011) ở SriLanka cho thấy tầm quan trọng của nguồn mẫu đầu tiên có ảnh hưởng đến sự tái sinh của cây gừng in vitro Phương pháp nhân giống thông qua thân rễ còn nhiều hạn chế Vì vậy đã có 1 nghiên cứu để lựa chọn mẫu ban đầu phù hợp đưa vào nuôi cấy, mẫu thân rễ có chồi được khử trùng bằng Etanol 70% trong 1 phút sau đó khử trùng bề mặt bằng Captan 0,3% kết hợp với Doxycycline 0,2% trong 10 phút, tiếp tục khử trùng bằng dung dịch 20% Clorox trong 20 phút Cắt các mẩu thân rễ với kích thước dài 0,5; 1,0; 2cm và cấy trên môi trường MS bổ sung 3,0mg/l BAP + 0,5mg/l NAA Kết quả cho thấy kích thước mẫu 0,5cm đạt tỉ lệ mẫu sống sót cao 66,67%, mẫu phát sinh hình thái đạt 44,44% trên môi trường 5,0mg/l BAP + 0,5mg/l NAA, chồi tái sinh sau 6

tuần nuôi cấy Chồi mới được cấy chuyển sang môi trường 3,0mg/l BAP + 0,5mg/l NAA để tái sinh cây con[40]

Tại Ấn độ đã tái sinh cây in vitro thông qua phôi vô tính của giống gừng chất

lượng cao “Garubathan” Nghiên cứu cho thấy sự hình thành chồi tốt hơn từ phôi vô tính tái sinh lần 2 Phôi vô tính tạo thành từ chồi trên môi trường MS bổ sung 2,4D

và BAP, nhân lên trên môi trường MS bổ sung 2% đường sacrose + 10% nước dừa + 1mg/l 2,4D + 1mg/l BAP Số lượng và chất lượng chồi tạo thành từ phôi vô tính tốt nhất trên môi trường 3/4MS bổ sung 5mg/l BAP [43]

Ngoài ra phôi vô tính được tạo trực tiếp hoặc gián tiếp từ thân trên của 2 giống gừng Nuôi cấy đoạn thân trên môi trường bổ sung 2,4D đã tạo callus màu vàng dạng hạt cứng (I) và calluss màu trắng nhạt, dính và mềm (II) Callus dạng II được làm khô sau 40-60 ngày nuôi cấy, sau đó chúng tách rời dạng hạt và chuyển sang dạng phôi hóa và tiếp tục chuyển thành phôi vô tính trên môi trường chứa 2mg/l BAP Những phôi vô tính này chín và nảy mầm trên môi trường bổ sung BAP (0,2-2mg/l) và NAA (0,2-1mg/l) Calluss dạng I cũng tạo được phôi vô tính nhưng chỉ tạo rễ ở tất cả các công thức nuôi cấy Phôi vô tính được tạo trực tiếp từ đoạn thân hoặc lá gốc trên môi trường bổ sung đơn lẻ TDZ hoặc kết hợp IBA Nhưng nghiên cứu trước đã chỉ ra rằng phôi vô tính của cây gừng có thể được tạo ra

từ các mô khác nhau của biểu bì, bao lá mầm, đỉnh chồi và đỉnh rễ[20]

Một nghiên cứu tại Hàn quốc so sánh năng suất và chất lượng của củ và cây gừng bản địa Seosanjong trồng ngoài đồng ruộng: 1 từ cây con in vitro 2 Từ cây con củ mầm tự nhiên Kết quả cho thấy trong cùng điều kiện nuôi trồng cây nguồn gốc in vitro có tốc độ sinh trưởng tốt hơn, cây cao hơn, chồi mới nhiều hơn, đặc biệt trọng lượng tươi cụm củ gừng sau khi thu hoạch nặng hơn 486g so với cây con từ

củ mầm tự nhiên[32]

1.3.2 Những nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, nhu cầu tiêu thụ gừng làm gia vị, bánh kẹo, mứt, dược liệu, trà cũng như phục vụ nhu cầu xuất khẩu đang ngày càng tăng lên Tuy nhiên, sản xuất

gừng vẫn mang tính truyền thống, nhỏ lẻ, chưa tương xứng với tiềm năng và lợi thế phát triển cây gừng Quy mô sản xuất gừng ở nước ta ước tính khoảng < 40.000 ha/năm, tập trung chủ yếu tại các tỉnh trung du, miền núi phía Bắc, Bắc Trung Bộ

và Tây Nguyên

Trong những năm gần đây các giống gừng trâu bản địa ở hầu hết các vùng trồng gừng đã được ưu tiên phát triển để phục vụ cho nhu cầu xuất khẩu Tuy nhiên hầu hết các vùng chuyên canh gừng, năng suất thường bấp bênh, không ổn định và có thể giảm từ 10-50% do sự gây hại của một số loại bệnh Đây là một trong những yếu tố hạn chế lớn đang đe dọa ngành sản xuất gừng ở nước ta hiện nay Trong đó

bệnh héo xanh vi khuẩn Pseudomonas solanacearum (nay là Ralstonia

solanacearum) là đối tượng nguy hiểm nhất Vi khuẩn này tồn tại chủ yếu trong đất

trồng và thân rễ từ nhiều năm sau đó lây nhiễm qua các vết xây sát trên củ giống hay trên thân cây khí sinh [2] Vì vậy củ giống và đất bị nhiễm bệnh là con đường lây lan chủ yếu của bệnh héo xanh, bệnh khô vằn trên cây gừng, đồng thời có nguy

cơ ngày càng nghiêm trọng hơn cho những năm sau nếu không có sự can thiệp bằng một giải pháp thích hợp

Gừng là cây trồng có hoa nhưng không có khả năng hình thành hạt Vì vậy, việc nhân giống và phát triển các thế hệ tiếp theo phải thực hiện bằng con đường sinh sản vô tính từ củ thông qua các mẫu nhánh nhỏ được tách ra từ thân rễ, mỗi nhánh dài 3,0 - 7,5cm, nặng 30 - 150g và có ít nhất một chồi hoặc một đỉnh sinh trưởng Lượng giống cần cho mỗi ha đất canh tác cần khoảng 1,0 - 2,5 tấn tuỳ giống

và điều kiện canh tác [17] Độ lớn của các mẩu gừng giống có ảnh hưởng trực tiếp đến tốc độ sinh trưởng và năng suất trên đơn vị diện tích Điều này đã làm tăng vốn đầu tư và chi phí đầu vào của quá trình sản xuất, từ đó làm ảnh hưởng đến khả năng

mở rộng và phát triển sản xuất cây gừng Do đó phương thức sản xuất tạo giống gừng bằng phương pháp nuôi cấy mô là một giải pháp hiệu quả để giải quyết vấn đề tạo giống chất lượng với số lượng lớn, giảm giá thành đáp ứng được nhu cầu sản xuất gừng trong nước và hướng tới xuất khẩu

Đã có nghiên cứu về nhân giống gừng bằng phương pháp nuôi cấy mô của tác giả Trần Thị Đính, mẫu được rửa sạch, kích thước 2-3cm đưa vào khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 10 phút đạt tỉ lệ tái sinh chồi 66,7% Cấy mẫu chồi lên môi trường MS bổ sung 1mg/l TDZ, 0,5mg/l NAA để nhân chồi, tạo cây hoàn chỉnh trên môi trường MS bổ sung 1mg/l BAP, 0,5mg/l kinetin, 0,5mg/l NAA [3]

Năm 2009, tại Trường Đại học An Giang đã có công trình nghiên cứu “Cải

tiến quy trình nhân giống gừng (Zingiber officinale Rosc.) bằng phương pháp nuôi

cấy mô tế bào” Đề tài đã thực hiện 4 thí nghiệm và xác định xử lý khử trùng mẫu với hóa chất Ca(OCl)2 thời gian 25-30 phút, nồng độ 10% đạt hiệu quả khử trùng cao nhất đạt 70% Nhân chồi tốt trên môi trường MS bổ sung 2mg/l BA cho chồi gừng tăng trưởng và phát triển nhanh Kích thích tạo rễ nhanh trên môi trường bổ sung 1mg/l NAA Tạo cây hoàn chỉnh với 2 kích thích tố BA 0,5-2mg/l và NAA 1mg/l Cây con được thuần hóa trong điều kiện nhà lưới đạt tỉ lệ sống cao [9]

Tóm lại, nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân in vitro thông qua nuôi cấy

chồi giống gừng G10 để tạo ra 1 số lượng cây con lớn sạch bệnh đồng đều là hết sức cấp bách góp phần làm tăng năng suất, chất lượng, đồng thời giảm giá thành cây giống tạo ra củ gừng thương phẩm đủ tiêu chuẩn tiêu dùng và xuất khẩu

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu

Gừng trâu G10 (Zingiber officiale (Willd.) Roscoe) được tuyển chon trong

tập đoàn cây trồng tại vườn thực nghiệm Trung tâm tài nguyên Thực vật được dùng

để đánh giá đặc điểm nông sinh học giống gừng G10

Chồi của giống gừng G10 được lấy từ củ cái, to khỏe, không nhiễm sâu bệnh,

có chiều dài từ 3,0-12,0 cm, có đường kính gốc từ 0,5-2,0 cm được dùng làm nguồn

mẫu cho nuôi cấy mô

Cây in vitro đủ tiêu chuẩn được đưa ra nuôi cấy ngoài vườn ươm

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp đánh giá đặc điểm nông sinh học

Được thực hiện theo hướng dẫn của Viện tài nguyên di truyền thực vật quốc

tế (IPGRI) nay là Trung tâm đa dạng sinh học quốc tế (International Bioversity) trên

cơ sở mô tả đặc điểm nông sinh học cây họ gừng Trong đó các chỉ tiêu cơ bản được

thưc hiện trong nghiên cứu này được trình bày trên bảng 2.1:

Bảng 2.1 Phương pháp đánh giá sinh trưởng, phát triển

Chỉ tiêu Phương pháp tiến hành

Cao cây Trung bình chiều cao của 10 cây đại diện (3 lần nhắc lại)

Số cây/khóm Trung bình số cây của 10 khóm đại diện/ô (3 lần nhắc lại)

DTL/cây Trung bình diên tích lá của 10 cây đại diện/ ô (3 lần nhắc lại)

theo phương pháp của Shouichi Yoshida và CS năm 1964 trong công thức 1:DTL (cm2/khóm)=KDR Trong đó K= 0,725, D= chiều dài lá, R=chiều rộng lá

DTL/khóm Trung bình diện tích lá/ cây x số cây/khóm của 10 khóm đại diện

(3 lần nhắc lại)

Dài củ Trung bình chiều dài củ của 10 cây đại diện (3 lần nhắc lại) Đường kính củ Trung bình đường kính củ ở vị trí lớn nhất của 10 củ đại diện/ô

bằng thước kẹp panme (3 lần nhắc lại) Khối lượng

củ/khóm

Trung bình khối lượng củ của 10 khóm đại diện/ô (3 lần nhắc lại)

2.2.2 Phương pháp khử trùng mẫu

Chồi ex vitro được cắt kích thước khoảng 3-5 cm, tách bỏ 1 phần lá bao bên

ngoài Rửa sạch bằng xà phòng loãng, tráng bằng cồn 70%, tráng nước cất sau đó khử trùng bằng 20% NaClO trong 5-15 phút, tráng nước cất 3 lần Tiếp tục rửa sạch mẫu 3 lần bằng nước cất vô trùng rồi đưa mẫu vào môi trường nuôi cấy

2.2.3 Phương pháp nuôi cấy lớp tế bào mỏng từ các lát cắt tế bào

Chồi in vitro kích thước 2 -3 cm, bỏ phần mô già, lấy phần mô non từ gốc

lên ngọn cắt thành từng lát 0,7-1,0mm và cấy vào môi trường (MT)

2.2.4 Phương pháp nuôi trồng ngoài vườn

- Phương pháp huấn luyện cây trước khi đưa ra vườn ươm: Đưa cây ra từ từ

để cây thích nghi dần với các điều kiện (nhiệt độ, ánh sáng, ) bên ngoài

- Phương pháp xử lý giá thể

- Phân bón được sử dụng là Grow more, Komix sông Gianh

- Phương pháp che sáng: Bằng giàn che với cường độ ánh sáng dưới giàn che

là 3000 lux, 4000 lux, 5000 lux, ≥8000lux

- Tưới nước đủ ẩm định kỳ 1 ngày/ lần khi mùa xuân và mùa đông, thời tiết đạt ẩm độ 60-80% Tưới nước đủ ẩm định kỳ 1,2,3,4 lần/ngày khi mùa hè hoặc mùa thu

2.2.5 Môi trường nuôi cấy in vitro

Chuẩn bị môi trường: Môi trường cơ bản sử dụng cho nuôi cấy là: Môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) Thành phần môi trường được thể hiện như sau

- Ánh sáng được cung cấp bởi đèn neon với cường độ ánh sáng là 2500 - 3000 lux

- Nhiệt độ nuôi cây 25±2oC

2.2.6 Bố trí thí ngiệm

*Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn mẫu và chất khử trùng để tạo mẫu vô trùng

Mẫu được khử trùng bằng NaClO 20% trong 5, 10, 15, 20 phút và cấy vào môi

trường: MS + 5 g/l agar + 30g/l đường sucrose + 1mg/l PVP + 100mg/l nước dừa

*Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu lát cắt

Các mẫu lát cắt cấy trên các công thức môi trường MS + 100mg/l nước dừa + 5 g/l agar + 30g/l đường sucrose bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng như sau (ĐHST)

BAP 0-5 mg/l; 2,4D 0,5 - 5mg/l Thí nghiệm nuôi cấy trong tối 15 ngày sau đó đưa ra chiếu sáng bình thường Thời gian nuôi cấy 1,5 tháng

*Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng nhân

của callus có nguồn gốc từ tế bào lát cắt mô non

Callus phát sinh từ thí nghiệm 2 cấy chuyển sang môi trường nhân MS + 100mg/l nước dừa + 5 g/l agar + 30g/l đường sucrose bổ sung 2mg/l BAP và 0,0 - 1mg/l NAA

*Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của khả năng tái sinh chồi từ callus

Callus từ thí nghiệm 3 cấy chuyển sang môi trường MS + 100mg/l nước dừa + 5 g/l agar + 30g/l đường sucrose bổ sung bổ sung Cazein 0-1,5g/l

*Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của vitamin B1 đến khả năng nhân và sức sống

của chồi

Các chồi mới tạo thành cấy chuyển sang môi trường nhân chồi MS + 100mg/l nước dừa + 5 g/l agar + 30g/l đường sucrose + 0,1mg/lKi + 1,0 mg/l BAP bổ sung vitamin B1 0-4mg/l

*Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của NAA đến sinh trưởng và phát triển cây in

vitro Chồi sau khi nhân đạt kích thước 4-6cm cấy chuyển sang môi trường tạo cây

hoàn chỉnh, môi trường MS + 100ml/l nước dừa+5 g/l agar + 30g/l đường sucrose + 3mg/l Vitamin B1 + bổ sung 0; 0,2; 0,3; 0,4mg/l NAA

*Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của trạng thái môi trường đến khả

năng tạo tạo rễ và phát triển cây hoàn chỉnh

Cấy chuyển cây ra rễ đã đủ cứng cáp chuyển sang môi trường ở trạng thái lỏng, bán

lỏng, đặc Xác định trạng thái môi trường để cây sinh trưởng tốt cả trong in vitro và

cây đưa ra ngoài vườn

*Thí nghiệm 8: Nghiên cứu huấn luyện cây trước khi đưa ra vườn ươm

Để bình cây ra nhiệt độ Trong phòng 0-7 ngày (ánh sáng mạnh hơn in vitro + ngoài

vườn) 0-7 ngày (ánh sáng tự nhiên cường độ thấp) Đưa cây ra cát ẩm, đưa cây ra bầu giá thể

*Thí nghiệm 9: Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến sinh trưởng của cây

trồng sau in vitro ngoài vườn ươm

Giá thể sử dụng là (đất phù sa : xơ dừa) tỉ lệ (1:1), (đất phù sa: cát) tỉ lệ (1:1), 100% đất phù sa, 100% cát, 100% xơ dừa

*Thí nghiệm 10: Ảnh hưởng của loại phân bón và liều lượng đến sinh trưởng

và phát triển của cây con

Grown more có (N:P:K) tỉ lệ (30:20:10, (30:10:10) và Phân komix Sông Gianh

Thời gian định kỳ phun 7-10 ngày/lần

*Thí nghiệm 11: Nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sinh

trưởng của cây sau in vitro ngoài vườn ươm

Công thức che sáng dao động (3000 – 8000 lux)

Tổng số mẫu nuôi cấy

Tổng số mẫu nhiễm + Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = ───────────── x100

Tổng số mẫu nuôi cấy

Mẫu phát sinh hình thái

+ Tỷ lên mẫu phát sinh hình thái (PSHT) = ───────────── x100 Tổng số mẫu nuôi cấy

Tổng số callus tạo thành (g) + Hệ số nhân callus = ─────────────

Tổng số callus nuôi cấy (g)

+ Chiều cao chồi (cm) = Tổng số chồi theo dõi Tổng chiều cao chồi

+ Số lá = Tổng mẫu nuôi cấy Tổng số lá

Tổng số chồi ra rễ + Tỷ lệ ra rễ (%) = ───────────── x100

Tổng số chồi nuôi cấy

Tổng số rễ + Số rễ = ────────

Tổng số chồi nuôi cấy

Tổng chiều dài rễ + Chiều dài rễ = ───────────

Tổng số rễ theo dõi

*Các chỉ tiêu trong nhà lưới

+ Cao cây (cm): Đo chiều cao từ mặt đất đến đỉnh sinh trưởng của cây

+ Số lá/cây (lá): Đếm số lá/cây

+ Số ngày bắt đầu ra lá mới (Số ngày bắt đầu ra lá mới): Đếm số ngày trước khi cây

in vitro bắt đầu ra lá mới đầu tiên

*Đánh giá cảm quan: màu sắc lá, rễ

2.2.8 Phân tích và xử lý số liệu

Các thí nghiệm thực hiện cùng một thời điểm, được lặp lại 3 lần Số lượng mẫu trong 1 thí nghiệm là 30 mẫu Số liệu sau khi thu thập được xử lý theo chương trình thống kê Irristat Tính toán số liệu kiểu ngẫu nhiên 1 nhân tố Phân tích kết

quả với 2 giá trị LSD 0.05 và CV%

-LSD 0.05 là giá trị sai khác nhỏ nhất Ta dùng kết quả trung bình của các công thức để so sánh hiệu số từng cặp trung bình với nhau và so với giá trị sai khác nhỏ nhất (LSD 0.05) để kết luận cặp đôi công thức đƣợc so sánh có khác nhau thật

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả điều tra, đánh giá đặc điểm sinh học giống gừng G10

Tại vườn thực nghiệm của trung tâm tài nguyên Thực vật, chúng tôi đã tiến hành đánh giá sinh trưởng của một số giống gừng cùng với giống gừng G10 được nuôi trồng và thu hoạch trong giai đoạn 2016- 2017 Kết quả theo các chỉ tiêu khảo sát được thể hiện ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Đặc điểm nông sinh học của một số giống gừng được trồng tại

trung tâm tài nguyên Thực vật

củ/khóm

g 475,5 365,9 446,5 197,2 383,2

Sự phát triển của thân lá gừng là cơ sở đầu tiên làm tăng trưởng khả năng tích lũy chất khô Đánh giá sự tăng trưởng thân giả thông qua tốc độ phát triển chiều cao cây và diện tích lá( DTL) qua các giai đoạn được xem là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá tiềm năng phát triển của cây gừng

Củ gừng là cơ quan dinh dưỡng cao nhất đồng thời là mục đích quan trọng nhất của hầu hết những nghiên cứu ứng dụng trên cây gừng Vì vậy các chỉ tiêu

về củ gừng chính là các chỉ tiêu quan trọng nhất để đánh giá tính ứng dụng của cây gừng Các giống gừng khác nhau thì có kết quả khác nhau về chiều dài đường kính và khối lượng củ nhằm đánh giá được năng suất của cây gừng

Qua kết quả đánh giá các đặc điểm nông sinh học của một số giống gừng, ta thấy trong hầu hết các chỉ tiêu đưa ra thì giống gừng G10 được xem là có ưu thế lớn nhất vượt xa các giống còn lại về đường kính củ và khối lượng củ/ khóm là những chỉ tiêu quan trọng để đánh giá được năng suất của giống gừng

Giống gừng G10 với chiều cao cây đạt 72,5 cm, DTL/khóm là 5388 cm2, chiều dài củ đạt 9,5 cm đường kính củ 30,4 mm và khối lượng củ/khóm 475,5g Kết quả điều tra này tương đương với kết quả nghiên cứu trước đây của giống gừng này tại các khu vực Hòa Bình, Bắc Kạn, Hưng Yên[22] Kết quả giúp khẳng định tiềm năng phát triển của giống gừng này tại Hà Nội

3.2 Nghiên cứu quy trình nhân giống vô tính in vitro cho giống gừng G10

3.2.1 Thiết lập hệ nuôi cấy vô trùng

Để tạo mẫu sạch thí nghiệm khử trùng mẫu chồi với NaOCl (20%) trong 5, 10,

15, 20 phút đã được tiến hành Mẫu sau khi khử trùng được cấy vào môi trường: MS +

5 g/l agar + 30g/l đường sucrose + 1mg/l PVP + 100mg/l nước dừa Hiệu quả khử trùng của các mốc thời gian khác nhau được đánh giá qua tỉ lệ mẫu sống và sạch sau 10

Số mẫu ban đầu

Mẫu (sau 10 ngày) Mẫu nội nhiễm

Mẫu sống (sau 45 ngày)

Mẫu chết (%)

Mẫu nhiễm (%)

sau 45 ngày

A B

Hình 3.1 Mẫu nuôi cấy sau khi khử trùng

c, mẫu sống sau khi khử trùng d, các mẫu được nuôi ấy trong PTN

Khi khử trùng trong 5-10 phút mẫu chết tỉ lệ rất thấp (0,0- 3,3%) nhưng tỉ lê ̣ mẫu nhiễm lại cao Khử trùng tăng lên 15 phút thì tỉ lệ sống cao đạt 63,3%, số mẫu chết tăng lên 26,7%, mẫu nhiễm 10% và mẫu không tiếp tục nhiễm Nếu tiếp tục tăng thời gian khử trùng thì số mẫu sống giảm mạnh chỉ còn 21%

Từ kết quả phân tích, ta có thể nhận thấy khử trùng bằng NaClO 20% trong

15 phút là công thức khử trùng phù hợp nhất cho tỉ lệ mẫu sống cao nhất Mẫu sau khi khử trùng rửa sạch 3 lần bằng nước cất và cấy vào môi trường (MT): MS + 30g/l đường sucrose + 5g agar + 1mg/l PVP +100ml/l nước dừa Sau 15 ngày xuất hiện chồi

Các chồi này lớn lên sau 45 ngày được chồi kích thước 2-3cm là vật liệu để nuôi cấy cắt lát

3.2.2 Nghiên cứu môi trường nuôi cấy tạo chồi và callus từ lát cắt mô non

Các chồi in vitro kích thước 2-3 cm được bỏ phần mô già, lấy phần mô non

từ gốc lên ngọn cắt thành từng lát 0,7-1,0mm và các lát mẫu được cấy vào môi trường chứa các chất điều hòa sinh trưởng để tạo nguồn vật liệu nhân (hình 3.3 a) Kết quả thu được sau 6 tuần được thể hiện ở bảng 3.3

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu

lát cắt mô non (sau 6 tuần)

Chất

ĐHST

Nồng

độ (mg/l)

Tỉ lệ mẫu PSHT (%)

Dạng hình thái phát sinh Chất lượng mẫu mới

1 48 Chồi, callus Mềm,yếu, phát sinh rễ

2 54 callus, tiền chồi Mềm, nát, phát sinh

vào môi trường BAP đến 3mg/l, hình thái dạng chồi và callus sinh trưởng tốt (hình 3.2 c) Nếu bổ sung liều cao hơn thì chất lượng chồi kém hơn, callus bất định, dang khối cứng khó tái sinh thành cây

Đối với môi trường bổ sung 2,4D hình thái mẫu phát sinh kém hơn so với môt trường bổ sung BAP Khi bổ sung nồng độ thấp 0,5-2mg/l mẫu có phát sinh hình thái nhưng chất lượng mẫu kém chồi yếu và có xuất hiện rễ Khi bổ sung 2,4D 3mg/l xuất hiện callus dạng mềm, có thể hòa vào môi trường lỏng tách riêng từng tế bào hoặc cụm tế bào thuận lợi cho việc tiến hành nhân callus và tái sinh cây ( hình 3.2 b) Nếu bổ sung đến 5mg/l 2,4D callus trở lên mềm, mọng nước, kém phát triển,

dễ chết

a b c

Hình 3.2 Mẫu cát lát được nuôi cấy trong môi trường

a, mẫu cắt lát đưa vào MT

b, mẫu trong MT bổ sung 3mg/l 2,4D

c, mẫu trong MT bổ sung 3mg/l BAP

Sau khi so sánh tỉ lệ PSHT, sức sống và dạng hình thái của mẫu tạo thành cho thấy môi trường bổ sung BAP tỉ lệ PSHT cao tạo chồi tốt hơn so với bổ sung 2,4 D Đặc biệt khi bổ sung 3mg/l BAP đạt tỉ lệ PSHT cao với kết quả là các chồi

và tiền chồi có sức sinh trưởng tốt chất lượng chồi ổn định Như vậy đây là môi trường phù hợp để nuôi cấy cắt lát mẫu, tạo chồi tiền chồi làm vật liệu để tiến hành nhân chồi

3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng nhân và tạo chồi của callus

Callus có thể được nhân sinh khối để gia tăng số lượng và tạo chất lượng tốt chuẩn bị cho giai đoạn phát sinh chồi Giai đoạn nhân callus cho tiềm năng lớn trong công tác nhân nhanh, có thể tạo ra số lượng chồi nuôi cấy không giới hạn Trong nghiên cứu, callus phát sinh ở giai đoạn lát mỏng được cấy chuyển sang môi trường nhân là nền khoáng MS, bổ sung 30g/l đường, 5g agar, 100ml/l nước dừa và 2mg/l BAP kết hợp với dải nồng độ NAA khảo sát từ 0,1 đến 1mg/l (bảng 3.4)

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của chất điều hóa sinh trưởng đến khả năng nhân của

callus và hình thái callus sau giai đoạn nhân

Nồng độ

BAP

(mg/l)

Nồng độ NAA (mg/l)

(C)ban đầu (g)

(C)sau 30 ngày (g)

Hệ số nhân Nhận xét mẫu callus

Hình 3.3 Hệ số nhân callus tương ứng với các hàm lượng NAA bổ sung trong

môi trường nuôi cấy

Hình 3.4 Mẫu trong môi trường nhân nhanh callus

A mẫu trong MT bổ sung 0,2mg/l NAA

B mẫu trong MT bổ sung 0,5 mg/l NAA

Ở giai đoạn nhân callus ta thấy khối lượng callus đã được nhân với hệ số lớn với khối lượng gia tăng gấp 3 lần thể hiện được tiềm năng trong việc nhân nhanh số lượng lớn với khối lượng vật liệu nhỏ.Từ kết quả ta kết luận callus trên môi trường