Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ 1

LỜI NÓI ĐẦU tk % Sách “Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ” được biên soạn làm giáo trình cho chương trình cao học của Bộ môn Hoá hữu cơ, Khoa Hoá.. Sách cũng hữu ích cho sinh viên các nă

do épsudt o áp su “NI CS mau vao'méy: | TU SÀN Ce Dawdd 3

Ld nung -

Cột sắc ni

3 HINH -

N - ee há lễ :

05 „`

NJ2 - P5277 ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN KIM PHI PHỤNG

PHƯƠNG PHÁP CÔ LẬP

HỢP CHẤT HỮU CƠ

NHÀ XUẤT BẢN

ố Ô-GHÍ-MINH — 2007

DHSFKT

SEV g2704i_

ĐẠI H

LỜI NÓI ĐẦU

tk %

Sách “Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ” được biên soạn làm giáo trình cho chương trình cao học của Bộ môn Hoá hữu cơ, Khoa Hoá

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí

Minh Sách cũng hữu ích cho sinh viên các năm cuối bậc đại học, học viên cao học, nghiên cứu sinh chuyên ngành Hoá học và Sinh học, cũng

như các nghiên cứu viên ở các Viện Hoá hoặc Sinh Hoá khi cần cô lập

một hợp chất hữu cơ từ cây cổ, từ một phản ứng hóa học hoặc từ các sinh

khối

Việc sử dụng các kỹ thuật sắc ký khác nhau nhằm cô lập hợp chất

hữu cơ là một hoạt động mà tất cả những ai làm việc trong các phòng thí

nghiệm hoá cũng như sinh đều phải tiến hành thường xuyên, tuy nhiên ở Việt Nam sách trình:bày về các loại kiến thức này vẫn còn rất ít Sách

trình bày phân kiến thức cơ bản và cung cấp những kiến thức chuyên sâu

về các phương pháp sắc ký, mỗi vấn đề đều có thêm những hình ảnh minh

hoạ để người đọc dễ hiểu

Sách gồm có chín chương và một chương phụ lục:

Chương 1: Kỹ thuật chiết tách-hợp chất hữu cơ khỏi cây cổ

Chương 2: Phương pháp nhận danh các loại hợp chất tự nhiên

Chương 3: Phương pháp sắc ký cột

Chương 4: Phương pháp sắc ký lớp mồng

Chương 5: Phương pháp sắc ký trao đổi ion

Chương 6: Phương pháp sắc ký gel

Chương 7: Phương pháp sắc ký khí (GC)

Chương 8: Phương pháp sắc ký lồng hiệu năng cao (HPLC)

Chương 9: Điện di

Biên soạn một quyển sách về một lĩnh vực chuyên sâu, hiện đại trong khi ở Việt Nam chưa có nhiều sách về kỹ thuật này nên chúng tôi gặp không ít khó khăn về thuật ngữ Những thuật ngữ được sử dụng trong sách là theo quyển "Từ điển Kỹ thuật tổng hợp Anh - Việt" của Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, 1991 Với phần lớn các thuật ngữ, chúng tôi cố gắng phiên dịch và đều có ghi lại trong ngoặc đơn nguyên mẫu bằng tiếng Anh, còn một số ít thuật ngữ chúng tôi đành để ở nguyên dạng tiếng Anh

Các hình ảnh trong bài đều là hình ảnh minh hợa

Đây là lần đầu tiên biên soạn quyển sách này nên chúng tôi sẽ khó tránh khỏi những sai sót, rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu để chúng tôi có thể hoàn thiện hơn trong những lần tái bản

Cuối cùng chúng tôi xin chân thành cám ơn PGS-TS Nguyễn Ngọc

Sương, người cô kính yêu Tấm gương lao động khoa học miệt mài của cô

là kim chỉ nam để tôi đõi theo mà tiến tới trong khoa học Cô luôn cho tôi những lời khuyên quý báu trong cuộc sống cũng như trong công tác giảng dạy; cô đã dành thời giờ đáng lẽ để nghỉ ngơi mà đọc giúp bản thảo, giúp

tôi kịp thời chỉnh sửa, hoàn tất

Xin chân thành cảm ơn

Thành phố Hồ Chí Minh tháng 05 năm 2007

TÁC GIÁ

Nguyễn Kim Phi Phụng

MỤC LỤC

Trang

Chương 1: KỸ THUẬT CHIẾT TÁCH HỢP CHẤT TỰ NHIÊN

RA KHỎI CÂY CỎ

1 Quá trình khảo sát hố-thực vật của một cây

1.1 Lựa chọn nghiên cứu trên một lồi cây của một họ

1.2 Xác định tên khoa học cho cây .-.-e-ecesererrrrertrrirerrtiiee 10

1.3, Xử lý mẫu cây sau khi thu hái

1.4 Dung mơi để chiết tách hợp chất ra khỏi mẫu cây

1.5 Lựa chọn qui trình để chiết tách hợp chất ra khỏi mẫu cây

2 Các kỹ thuật chiết tách hợp chất ra khỏi cây . -

2.1 Kỹ thuật chiết lỏng-lỗng

2⁄2 Kỹ thuật CHIẾ(tẤH-lƠHE (ouungaanadaeeaeiaareeaneee

2.3 - Các chat gây trở ngại cho việt chiết tách Chất giả tạo

2.4 Một số thủ thuật khi cơ lập hợp chất hữu cơ

3 Phân tích sơ bộ hĩa-thực vật một số cao chiết

3.1 - Tìm hiểu một số đặc điểm của cao chiết

3.2 Phân tích hố-thực vật của cao chiết

Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NHẬN DANH CÁC LOẠI HỢP CHẤT

TỰ NHIÊN

† AlCAlỌd con nh srrieereeetrairroeieD-ETT94052T-107001n0194 50 80 1.1 Đại Cương ecrecrerreerrrrrririiiitiiiiritrttirrrreirrrirniiertrltl ren 80

1.2 Phương pháp định tính sự hiện diện alkaloid trong bột cây

1.3 Các thuốc thử để định tính alkaloid

14, Phương pháp chiết tách alkaloid ra khối cây

2 Flavonoid

2.1 Đại cương

2.2. Các thuốc thử Kết: định tính sự hiện diện của flavonoid - 93

519

2.3, Phương pháp chiết tách flavonoid ra khối cây -sereeererrre 95

3 Sesquiterpen lacton

3.1 Đại cương , R

3.2 Các thuốc thử để định tính sesquiterpen lactơn

3.3 Phương pháp chiết tách sesquiterpen lacton:ra khỏi cây : 103

4 Terpenoid Steroid "— "`

4.1 Đại cương VY K2024848.3868001008005.8i.0

4.2: - Các thuốc thử để định tinh terpenoid, steroid

4.3: Phương pháp chiết tách terpenoid, steroid.ra khỏi cây -

SẼ Chất ĐỀO tosicceeaaananisesaoinasssieseiaae 844988 XVH8INEASXSESSEPEnSSi.nR-SRĐ 116 5.1 Đại Cương -stecnrHHg i11 6k cee 116

5.2- - Các thuốc thử để định tính sự hiện diện của chất béo

5.3: - Phương pháp chiết tách chất béo ra khỏi cây

6 Hợp chat glycosid

6:2 Phương pháp chiết tách glycosid ra khỏi cây c ee.e.e 127 6.3 Phương pháp thủy giải glycosid để xác định phan đường 128 6.4 Các thuốc thử để định tính phần đường,

6.5 Các thuốc thử để định tính saponin

6.6 _ Các thuốc thử để định tính glycosid tỉm . s- ccservccecrscxe

6.7 Các thuốc thử để định tính aglycon iridoid -¿ sccs-ccscrxee 138

7 Hợp chất phenol 28 YEHEebEiNiXiSEXSkSELESE1A)603i56E ikfEteblsfbzloeg j2853z858668E 138

7A Đại cương

7.22 Cc thuốc thử để định tính sự hiện diện của phenol

7.3 Phương pháp chiết tách phenol ra khổi cây

Chương 3: SẮC KÝ CỘT

1 Các nguyên tắc căn bản của kỹ thuật sắc ký

1.1 Phân loại sắc ký theo bản chất hai pha sử dung

151

„153

520

12 Phân loại sắc ký theo bản chất hiện tượng xẩy ra trong quá trình

tách chất nie -15 1.3 Phân loại sắc ký theo cấu hình 2©:scrkerzkevrrcrzscvrsezree pees LSS

2: Các loại pha tĩnh sử dụng trong sắc ký : lv bôgg oe 1GE

Qi .,SIHEB S@Ì ve nggynaesdgotisdtuaaa "cốc 6 16 2.2 .Alumina

2.3 Kieselguhr-Celite

24

2.5

8: Sắc Ký CỐI NỔ coacealoassaseeeileaaesaaadiaeealikae-da wẩ0ut6 03 eerie’ 18¢

3.1 Lựa chọn chất hấp thu và dung môi khởi đầu giải ly : 181 3.2 Tỉ lệ giữa lượng mẫu chất cần tách đối với kích thước cột 182 3.3 Nạp chất hấp thu vào cột

3.4 Đặt mẫu chất cần tách lên đâu cột sắc ký

3.5 Các kỹ thuật giải ly chất ra khỏi cột

3.6 Dung môi giải ly và kỹ thuật tăng dẫn tính phân cực cho dung

môi giải ly

3.7 Vận tốc giải ly cột

3.8 Theo dõi quá trình giải ly cột

3.9 Tổng kết quá trình sắc ký cột ceeerrrirrrrrrrrrrrerrrrrrrie

3.10 Các phương pháp xác định cấu trúc hoá học một hợp chất 20C

4 Một vài kỹ thuật sắc ký cột khác . -eeeeesereee game 202

4.1 Sắc ký cột khô

4.2 Sắc ký chớp nhoáng

4.3 Sắc ký nhanh-cột khô

Chương 4: SẮC KÝ LỚP MÔNG

1 Kiến thức tổng quát về sắc ký lớp mỏng

1.1 So sánh sắc ký lớp mồng với các kỹ thuật sắc ký khác

1⁄2 Sắc ký hấp thu

1.3 - Các chất hấp thu dùng trong sắc ký lớp mỏng :-: -.-.-c+ ¿4.219

1.4 - Chất cho thêm VÀO itiictcbb tt da há g0 4181 kxreerererrrrroe 224 T.5 Dung mOi gidi dy o.oo 224

2 Cae chuan bi trudc khi sac ky I6p mOng -eoeeceeeeeee eens 228

2:T:-;Chuẩn' Bị:Vi'đUẦn á:itccec3togiiltántng Honda ng an 4848140084 65 228

2.2 : Chấm mẫu lên bẩn mỏng : - ¿-.©2222+ 222cc 2CEAecEE.vzEEE22Serxve 229 2.3 Giải ly bản mồng

3 Thực hành tráng sắc ký lớp mỏng -5c2ssccsreerrassee 234

3.1 Chuẩn bị tráng tấm bản mỏng

3.2 Các kỹ thuật tráng tấm bản mồng

3.3 - Hoạt hoá chất hấp thu

3.4 Hiện hình các vết sau khi giải ly -sccs22E 11 E022 10212 rEeEcreeree

4 Các công dụng của sắc ký lớp mỎng ccsssxcccccseeree 244

4.1 ` Để công bố đặc điểm của hợp chất vừa chiết tách cô lập 244

4.2 Để kiểm tra xem hai hợp chất có giống nhau 2222221122 sne 245

4.3 Để tìm hiểu sơ bộ về tính chất của mẫu chất cần khảo sát 247 4.4 Để chuẩn bị cho việc sắc ký cột

4.5 - Để theo đõi diễn tiến của một phần ứng hoá học

4.6 Để kiểm tra biết một hợp chất kém bển

4.7, DE cO lap hop chat escsccssssscscsssssesssmssnsassesssssssssuesessessssssess

5 Sắc ký lớp mỏng của một số hợp chất hữu cơ

5.1 Sắc ký lớp mồng của amino acid _

5.2 Sắc ký lớp mỏng của peptid, protein

5.3 Sắc ký lớp mồng của carbohydrat

5.4 Sắc ký lớp mồng của lipid

5.5 Sac ký lớp mỏng của flavonoid

5.6 - Sắc ký lớp mồng của carotenoid

3.7 Sắc ký lớp mỏng của clorophyl

5.8 Sắc ký lớp mỏng của quinon

Chương 5: SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION

1 Các kiến thức căn bản về sắc ký trao đổi ion

1.1 Các đặc điểm tổng quát của nhựa trao đổi ion

1.2 Lý thuyết về sự trao đổi ion

1.3 - Các nguyên liệu sử dụng làm nhựa trao đổi ion -.c-ccccc

2 Một số kiến thức căn bản trong thực nghiệm trên nhựa

trao AGI 10M son bi nh nh HE hen Ha hang niấnhúhiuguaNggấngclimŠLögggigdaenÓ

2.1 Chọn loại nhựa trao đổi ion phù hợp

2.2 Thí nghiệm để biết số lượng nhựa cần thiết

2.3 Chọn loại dung dịch đệm

2.4 Làm trương nở nhựa trước khi thực nghiệm + 302

2.5, Tái tạo nhựa TổỔn trữ nhựa c2.-<cccertrriietriiirrrieiireriririr 304

3 Sắc ký trao đổi ion, sử dụng cột hoặc becher - 305

3.1 Lựa chọn kích thước cột sắc ký e ceerreeeerreeerrrtriresie

3.2 Nhỏi nhựa vào cột Nạp mẫu chất vào đầu cột

3.3 Giải ly cột trao đổi ion

3.4 Vận tốc giải ly cột

3.5 Sắc ký trao đối ion sử dụng becher -.-es-erseseerrrrrtrrrrrrtrree

4 Một số áp dụng của sắc ký trao đổi ion -. e-eresererrrer 312

4,1 Các hợp chất anion -cssserrrrerrrrrtrrttrrrtrrrrtttrrtrrrrtrrtretrrrr 313 4.2 Các hợp chất cation -s ceccceerrrrrtrrrirrrrrrrtrrrtrrrirrrtrerterrrrr 315

Chương 6: SẮC KÝ GEL

323

1 Nguyên tắc căn bản của sắc ký gel -eererrtrrrrrrrrree

2 Nguyên liệu làm thành hạt gel

2.1 Gel dextran

2.2, Gel polyacrylamid

2.3 Gelstyragel crrceerrrrrrrrrrrereerrrrdrrrrdrmtinrtrrrnr

3 Các nguyên tắc căn bản về thực hành sắc ký gel -. -se+

523

3.1 NGI gel vào cột ccccceretrsrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrerrrkter 3.2 Nạp mẫu chất vào đầu cột

3.3 Triển khai sắc ký

3.4 - Gel Sephadex LH-20

4 Sắc ký lớp mỏng với kỹ thuật sắc ký gel ——

4.1 Kích thước tấm bản gel 52527S222 E11 2 cxcrkerrerrcrrfreerkcree 339

4.2 Lượng gel cần để tráng bản 222+1222vs2211021712.,12222ecrey 339

4.3 Phương pháp triển khai bản mồng ESÌ 2 EINGNS2 ĐETEDADEKEUPEGSPvETREntulNgg 340

5: Các ứng dụng của sắc ký gel

5:1 Để xác định trọng lượng một đại phân tử

5.2 Để tách một hỗn-hợp thành các nhóm hợp chất riêng rẽ

5.3 Để loại bổ muối ra khỏi một hợp chất hoặc dung dịch

5.4 Để loại bổ các chất màu tạp bẩn ra khỏi hợp chất đang khảo sát 348

1 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tách chất trong sắc

1.2, Đặc trưng của các loại cột sắc ký khí s nu TS SH nghe 359

1.3: Độ phân giải HH rererese 360

2 Các bộ phận của máy sắc ký khí .2.22222S, 363

2.1 Khí mang

2.2 Bộ phận đưa mẫu vào máy

2.3 Cột sắc ký khí —

2.4, Bộ phận phát hiện tín hiệu

3 Nguyên liệu làm pha tĩnh trong sắc ký khí 368 3.1 Loại cột nhồi trong sắc ký khí-lồng

4: Các loại đầu dò trong máy sắc ký khí -~.c-errs 380

4.1 Đầu dò dẫn nhiệt

4.2: Đầu đò ion hóa ngọn lửa

4.3, Dau dd Dat din th oe cessssessseesssesssneesseeessseesessessssesesesssescssenssses 384 4.4, Du dd nitrogen-phosphor.i.s sscccsecscisessssesssseecssecssseesneeesseessseesssssssseees BOT

4.5 Đầu dò trắc quang ngọn lửa

4:6 Đầu dò quang ion hoá

4.7 GC-MS va GC-IR

5 Chuẩn bị mẫu trước khi phân tích bằng sắc ký khí

S.L Su silyl hod

5:2 - Sự acy] hoá

5.3: Sự alkyl hóa, sự ester hoá

6 Các yếu tố ảnh hưởng đến việc tách mẫu

6.1: - Lựa chọn loại cỘt : . -csscsrreererrtrrtterrrrrrirrirtrerrrrrrrrirrrtrerrrririe 6.2 Lựa chọn nhiệt độ, chương trình nhiệt độ

6.3 Một số vấn để thường gặp trong quá trình sắc ký khí

7 Các ứng dụng của sắc ký khí

Chương 8: SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

1 Các bộ phận của máy HPLC - -: ——¬

b1 Bình chứa dung môi giải ly cột : ::-:

12 Máy bơm

143 Cột sắc ký

1⁄4 Bộ phận chích mẫu vào máy

ES ĐÂU HỒ áo da GQRgouaindelisesassaiosaalnseesaibeeeelskelrrarAN8018/010100

2 Các loại pha tĩnh để nhồi cột sắc ký HPLC «.es-eee 413

2.1 Pha thường c2cccceeeie28rrreiderrerte

22 PHP CONG! keisesaasesesadlsaaaseseeenaeeeoie G2220

3 Các loại đầu dò trong HPLC -. -sseccsoienerrerierrntrerrreer 426

3.1: Đầu dò đo hấp thu tia tử ngoại

3:2, Đầu dò mạng diod quang

3.3 Đầu dò phát huỳnh quang

3.4, Đầu dò chỉ số khúc xạ cv tetrretirrrtrirrriirrrrrrrierrerrrrrre

3:5 Đầu dò đo độ dẫn điện initio hee ied ND) s00 eh veear i albedo 433

3.6 Đầu dò amper kế

3.7 Đầu dò LC-IR

3.8 Đầu dò LC-MS

3.8.1 Giao điện tia nhiệt

3.8.2 Giao diện ion hoá ở áp suất khí quyển

3.8.3 Giao diện phun ion

38.4 Giao diện chùm tia hạt

4 Điều chế các hợp chất phân tích thành chất dẫn xuất 448

4.1 Tạo dẫn xuất trước khi hợp chất đi vào cột sắc ký 449 4.2 Tạo dẫn xuất sau khi hợp chất đi ra khỏi cột sắc ký 450

Chương 9: ĐIỆN DI

1 Các kiến thức căn bản về điện di . - << cc<c<scecr<se

dele Cân Đán ݧulÿ:của điện i ursiesssabsotorunsdoliagiHittibbduisdtogiasuastoa

1.2 Các yếu tố ảnh hưởng lên vận tốc điện di

1.2.1 Điện trường

1.2.2 Dung dịch dém

1.2.3 Môi trường chất mang

I.3 Hiện hình bẩn gel điện di

1.4 Điện di với pH liên tục Điện di với pH không liên tục

1.5 Cô lập hợp chất nhờ điện di (LÊ bosssasasresasixanlleee

2 Điện di làm biến tính mẫu phân tích .- 2 te cessse 468

2.1 Điện đi với gel SDS polyacrylamid 5 sSs ta s2 SH nhe H ren 468 2.2 Điện di với gel SDS polyacrylamid trong điều kiện khử s2 471

3 Điện di hội tụ veccsscsesscslessscssssvsseessnseelesssseeatdasesssssessseesecce: nhớ thoi 473 3.1 Cấu trúc của chất điện ly lưỡng tính ee 474

526