kl le thi tu oanh 062396s

Với qui trình nuôi cấy phôi dừa hiện nay, thời gian nuôi trong phòng thí nghiệm với điều kiện vô trùng là 12 tháng, chuyển ra vườn ươm trồng trong điều kiện có kiểm soát nhiệt độ, độ ẩm,

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG

TP HỒ CHÍ MINH-2011

i

LỜI CẢM ƠN

Để có được kết quả như ngày hôm nay, em xin chân thành gửi lời cảm

ơn đến chị Trần Thị Ngọc Thảo, người đã tin tưởng giao cho em đề tài này và cũng là người luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài

Em cũng xin gửi lời tri ân đến toàn thể thầy, cô bộ môn công nghệ sinh học thuộc khoa khoa học ứng dụng, trường đại học Tôn Đức Thắng Thầy cô đã tạo cho em nền tảng kiến thức căn bản và quan trọng để có thể áp dụng trong lúc thực hiện đề tài cũng như trong suốt quá trình làm việc sau này

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến Viện nghiên cứu dầu và cây có dầu đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài này

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 1 năm 2011

Sinh viên

Lê Thị Tú Oanh

ii

MỤC LỤC Trang phụ bìa Nhiệm vụ luận văn Lời cảm ơn Mục lục Danh mục các bảng Danh mục ảnh Danh mục các chữ viết tắt

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.2 MỤC ĐÍCH 2

1.3 YÊU CẦU 2

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về đối tượng nghiên cứu 3

2.1.1 Vị trí phân loại 3

2.1.2 Đặc điểm về hình thái 3

2.1.2.1 Rễ 3

2.1.2.2 Thân 4

2.1.2.3 Lá 4

2.1.2.4 Hoa .5

2.1.2.5 Trái .6

2.1.3 Nhu cầu sinh thái 7

2.1.3.1 Điều kiện nhiệt độ- khí hậu 7

2.1.3.2 Ánh sáng 7

2.1.3.3 Đất đai 7

2.1.4 Ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên sự phát triển của phôi 8

2 2 Phương pháp nhân giống dừa 12

2 3 Tình hình nghiên cứu kỹ thuật ghép phôi dừa ở nước ngoài .12

iii

2.4 Tình hình nghiên cứu kỹ thuật ghép phôi dừa ở trong nước 13

CHƯƠNG 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành .14

3.2 Nội dung nghiên cứu 14

3.3 Vật liệu nghiên cứu 14

3.3.1 Nguyên liệu 14

3.3.2 Dụng cụ và thiết bị cần thiết cho quá trình nghiên cứu 14

3.4 Phương pháp nghiên cứu 16

3.4.1 Chọn nguyên liệu 16

3.4.2 Khử trùng và tách lấy phôi ghép .16

3.4.3 Phương thức tiến hành ghép phôi dừa 16

3.4.4 Bố trí thí nghiệm 17

3.4.4.1 Thăm dò phương pháp khử trùng giá thể ghép .17

3.4.4.2 Thăm dò kỹ thuật ghép phôi dừa 19

3.4.4.3 Thăm dò môi trường làm đầy giữa phôi ghép và giá thể ghép 19

3.4.4.4 Thăm dò thời gian nuôi cấy phôi trước khi tiến hành ghép .20

3.4.5 Phương pháp thu thập và thống kê số liệu 20

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22

4.1 Thăm dò phương pháp khử trùng giá thể ghép .22

4.2 Thăm dò kỹ thuật ghép phôi dừa 24

4.3 Thăm dò môi trường làm đầy giữa phôi ghép và giá thể ghép 32

4.4 Thăm dò thời gian nuôi cấy phôi trước khi tiến hành ghép .38

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

5.1 Kết luận 42

5.2 Kiến nghị 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

iv

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1: Công thức thí nghiệm “Thăm dò phương pháp khử trùng giá thể

ghép” 17 Bảng 3.2: Công thức thí nghiệm “Thăm dò kỹ thuật ghép phôi dừa” 19 Bảng 3.3: Công thức thí nghiệm “Thăm dò môi trường làm đầy giữa phôi ghép

và giá thể ghép” .20 Bảng 3.4: Công thức thí nghiệm “Thăm dò thời gian nuôi cấy phôi ghép trước

khi tiến hành ghép” 20 Bảng 4.1: Tỉ lệ trái nhiễm tương ứng với các nghiệm thức khử trùng được tiến

hành 22 Bảng 4.2: Tỉ lệ trái nhiễm tương ứng với các nghiệm thức thăm dò kỹ thuật

ghép được tiến hành 24 Bảng 4.3: Tỉ lệ trái sống không nhiễm sau 8 tuần ghép 25 Bảng 4.4: Tỉ lệ trái nhiễm và trái sống không nhiễm tương ứng với các nghiệm

thức thăm dò môi trường làm đầy được tiến hành 32 Bảng 4.5: Tỉ lệ trái nhiễm, tỉ lệ trái sống không nhiễm tương ứng với các

nghiệm thức thăm dò thời gian nuôi cấy phôi trước khi ghép 38

v

DANH MỤC ẢNH Ảnh 2.1: Rễ dừa 4

Ảnh 2.2: Hoa dừa 6

Ảnh 2.3: Nuôi cấy phôi dừa in vitro 12

Ảnh 3.1: Máy khoan dừa 15

Ảnh 3.2: Kính hiển vi quang học 15

Ảnh 3.3: Khoan giá thể ghép tại mắt nảy mầm 18

Ảnh 3.4: Giá thể ghép sau khi khoan 18

Ảnh 4.1: Khử trùng vết cắt trên giá thể ghép 23

Ảnh 4.2: Rửa sạch javen trên giá thể ghép bằng nước cất vô trùng 26

Ảnh 4.3: Dùng dao tách tách phần nắp của giá thể ghép 26

Ảnh 4.4: Giá thể ghép sau khi đã tách phần nắp 27

Ảnh 4.5: Lát mỏng phần vỏ nâu bên trên phôi của giá thể ghép 27

Ảnh 4.6: Tách bỏ phôi của giá thể ghép 28

Ảnh 4.7: Ghép phôi vào giá thể ghép 28

Ảnh 4.8: Lắp đầy khoảng trống giữa phôi ghép và giá thể ghép bằng môi trường làm đầy 29

Ảnh 4.9: Đặt lát mỏng vỏ nâu về vị trí cũ 29

Ảnh 4.10:Đặt nắp vỏ về vị trí sao cho lỗ nảy mầm ở vị trí phôi sẽ nảy mầm 30

Ảnh 4.11: Bịt kín mối ghép bằng keo sillicon 30

Ảnh 4.12: Trái ghép hoàn chỉnh 31

Ảnh 4.13: Trái ghép được trồng trong xơ dừa đã qua hấp khử trùng và đưa ra vườn ươm 31

Ảnh 4.14: Cơm dừa hóa nâu do khoan trúng phần cơm dừa 34

Ảnh 4.15: Trái ghép bị nhiễm và phần cơm dừa bị khoét hóa nâu 34

Ảnh 4.16: Trái đối chứng nảy mầm 35

Ảnh 4.17: Trái dừa bình thường nảy mầm 35

vi

Ảnh 4.18: Tế bào cơm dừa được chụp qua kính hiển vi, độ phóng đại 40X 36

Ảnh 4.19: Tế bào ở lớp cơm dừa bọc phôi được chụp dưới kính hiển vi, độ phóng đại 40X 36

Ảnh 4.20: Tiêu bản cắt ngang của phôi 37

Ảnh 4.21: Lát cắt ngang qua đỉnh sinh trưởng của phôi dừa 37

Ảnh 4.22: Phôi dừa được nuôi cấy sau một tuần 40

Ảnh 4.23: Phôi dừa được nuôi cấy sau hai tuần 40

Ảnh 4.24: Phôi dừa được nuôi cấy đến khi ra chồi, ra rễ 40

Ảnh 4.25: Ảnh cho thấy sự khác biệt về kích thước giữa phôi ghép và mắt ghép trên giá thể ghép 41

Ảnh 4.26: Phôi dừa được nuôi ra chồi, ra rễ bị chết sau khi ghép lên giá thể ghép 41

vii

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BA 6-Benzylaminopurine GA3 Gibberelic acid

IBA Indole-3-butyric acid

NAA Naphthaleneacetic acid

Y3 Môi trường Eeuwens (1976)

1

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Dừa (Cocos nucifera L.) là một trong những cây trồng quan trọng

thuộc vùng nhiệt đới ẩm Với hơn 12 triệu ha được trồng ở 90 quốc gia, chủ yếu là vùng Châu Á Thái Bình Dương Philippines, với 3,2 triệu ha, là nước sản xuất và trồng dừa lớn thứ 2 thế giới (dẫn đầu là Indonesia với 3,8 triệu ha)

Cây dừa đã phát triển trên 50 triệu vùng đất nghèo tài nguyên và những nơi có nền nông nghiệp sản xuất nhỏ lẻ Cây dừa cũng được trồng ở những vùng biên và vùng duyên hải

Cây dừa được biết đến như ”Cây của cuộc sống” vì tất cả các phần của chúng đều có thể được sử dụng và tính phổ biến rộng rãi của chúng trong đời sống người dân địa phương Từ quả dừa có thể tạo ra nhiều sản phẩm khác nhau như dầu dừa, cơm dừa và các sản phẩm thân thiện với môi trường, dùng làm vật dụng gia đình và hàng xuất khẩu Ở một số nước ở Thái Bình Dương, nguồn tài nguyên duy nhất để xuất khẩu sang các nước khác là các sản phẩm từ dừa

Tuy nhiên, việc trồng và sản xuất dừa trên thế giới đang giảm qua các thập kỷ và gần 2/3 các giống dừa cần phải được trồng mới, nâng cao sản lượng

và cần phải thích hợp với nhiều vùng đất khác nhau Điều này đã đặt ra yêu cầu cần phải có những chương trình nhân giống chất lượng cao, dựa vào sự sẵn có của nguồn gen phù hợp

Hiện nay, việc sưu tầm và vận chuyển nguồn gen thông qua kỹ thuật

nuôi cấy phôi trong ống nghiệm (in vitro) đã trở thành một biện pháp mang tính

thực tế và an toàn về mặt kiểm dịch thực vật

Với qui trình nuôi cấy phôi dừa hiện nay, thời gian nuôi trong phòng thí nghiệm với điều kiện vô trùng là 12 tháng, chuyển ra vườn ươm trồng trong điều kiện có kiểm soát nhiệt độ, độ ẩm, chế độ ánh sáng, lượng nước tưới, sau khoảng 12 tháng cây dừa được xuất vườn Như vậy thời gian nuôi cấy đến khi

2

cây con đạt tiêu chuẩn xuất vườn là khá dài, mất nhiều thời gian, hao tổn khá nhiều kinh phí, nhân lực, năng lượng, hóa chất làm giá thành cây giống tăng cao

Với mong muốn khắc phục những nhược điểm của phương pháp nuôi cấy phôi, đồng thời muốn tìm ra một phương thức mới cho việc nhân giống các giống dừa, đề tài “ Thăm dò kỹ thuật ghép phôi dừa” được đưa ra

1.3 Yêu cầu

Tiến hành các nghiệm thức khử trùng nhằm tìm ra nghiệm thức khử trùng giá thể ghép hiệu quả nhất, giảm số lượng trái nhiễm trong quá trình ghép

Tiến hành các kỹ thuật ghép, dựa trên số liệu thu thập được, đưa ra kỹ thuật ghép hiệu quả nhất

Khảo sát môi trường có bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật thích hợp cho sự nảy mầm của phôi ghép

Khảo sát khả năng thích ứng của phôi ghép trên giá thể ghép dựa vào

sự phát triển của phôi qua thời gian nuôi cấy trước khi ghép

3

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về đối tượng nghiên cứu: cây dừa Ta ( Cocos nucifera L.)

Chi: Coconuts (cocos)

Loài: Cocos nucifera L

2.1.2 Đặc điểm về hình thái của cây dừa Ta

2.1.2.1 Rễ

Dừa Ta có rễ bất định, không có rễ cọc Lúc mới mọc có màu trắng sau chuyển sang màu đỏ nâu Rễ không có lông hút mà chỉ có những rễ nhỏ là

rễ dinh dưỡng Những rễ này hình thành trên rễ chính và có hoạt động như rễ

hô hấp, giúp cho cây trao đổi khí Trong điều kiện nước ngập liên tục sẽ ảnh hưởng đến khả năng hô hấp của bộ rễ, làm cho cây dừa giảm sức tăng trưởng

do cây dừa là cây chịu nước nhưng không chịu ngập Rễ già sẽ chết và rễ mới phát triển liên tục

Tuần đầu tiên sau khi nảy mầm, cây dừa con sẽ mọc ra một rễ cấp một

có chiều dài trung bình 5cm, mười ngày sau sẽ mọc ra rễ thứ hai, sau sáu tuần

sẽ có trung bình 3 rễ cấp một, với chiều dài rễ dài nhất khoảng 20cm Khi cây dừa 5 năm tuổi sẽ có khoảng 548 rễ cấp 1 và đạt số lượng 5.200 rễ cấp 1 khi cây 13 năm tuổi Số lượng rễ cấp 1 ở cây dừa trưởng thành biến động từ 2.000 đến 16.500 rễ Hệ thống rễ dừa phần lớn tập trung ở xung quanh gốc trong vòng bán kính 1,5-2m Rễ có thể ăn sâu đến 4m, trong đó 50% rễ tập trung ở 50cm lớp đất mặt

mà thân dừa chỉ phát triển mạnh sau 4-5 năm Gốc dừa là một trong những đặc điểm để phân biệt nhóm giống dừa cao và dừa lùn.Dừa thường có gốc phình to đến rất to Do cấu tạo của thân không có tầng sinh mô thứ cấp nên những tổn thương trên thân dừa không thể phục hồi được và đường kính thân cũng không phát triển theo thời gian Đồng thời thân phát triển từ đỉnh sinh trưởng nên khi

bị đuông tấn công cây sẽ bị chết

Chiều cao thân là một trong những đặc điểm để đánh giá điều kiện sinh trưởng và phát triển của cây, dựa trên đặc điểm này làm tiêu chuẩn để chọn giống theo phương pháp truyền thống Tóm lại, thân dừa là đặc điểm dùng để đánh giá sự sinh trưởng của cây Thân dừa to, không bị tổn thương, sẹo to, khít là cây dừa sinh trưởng mạnh cho năng suất cao

2.1.2.3 Lá

Một cây dừa có khoảng 30 đến 35 tàu lá, mỗi tàu lá dài 5-6m vào thời

kỳ trưởng thành Ở cây trưởng thành, một tàu lá dừa gồm hai phần Phần cuống

lá không mang lá chét, lồi ở mặt dưới, phẳng hay hơi lõm ở mặt trên, đáy

5

phồng to, bám chặt vào thân và khi rụng sẽ để lại một vết sẹo trên thân Phần mang lá chét mang trung bình từ 90-120 lá chét mỗi bên Đỉnh sinh trưởng sản xuất lá liên tục, cứ một lá xuất hiện trên tán thì có thêm một chồi lá xuất hiện

và một lá già rụng đi

Một cây dừa tốt, mỗi năm ra ít nhất 14-16 lá (24-26 ngày/lá) đối với nhóm dừa cao và 16-18 lá (20-22 ngày/lá) đối với nhóm dừa lùn Mùa khô dừa

ra lá nhanh hơn so với mùa mưa Một tàu lá dừa luôn luôn có đời sống 5 năm,

từ khi tượng đến khi xuất hiện 2,5 năm và từ khi xuất hiện đến khi khô, rụng là 2,5 năm Nếu điều kiện tự nhiên bất lợi lá sẽ ra chậm hơn, số lá ít đi chứ không rút ngắn đời sống của lá Điều kiện dinh dưỡng và nước đầy đủ cây ra nhiều lá

sẽ làm cho số lá trên tán cây nhiều hơn (35-40 tàu) Nếu gặp điều kiện bất lợi thời gian ra lá kéo dài, số lá trên tán cây sẽ ít Ở vùng khô hạn, trên tán lá có một số lá khô nhưng không rụng, đó là điều kiện rất đặc trưng chứng tỏ cây bị thiếu nước

Quan sát tán lá của cây dừa ta có thể đánh giá được khả năng sinh trưởng và cho năng suất của cây Đây là một trong những chỉ tiêu dùng để tuyển chọn cây làm giống Tán lá phân phối đều chứng tỏ cây mạnh và có khả năng cho nhiều trái

2.1.2.4 Hoa

Hoa dừa thuộc loại đơn tính, hoa đực và hoa cái riêng rẽ nhưng ở trên cùng một gié hoa Mỗi phát hoa có thể mang trung bình từ 5-10g phấn hoa Mỗi hoa đực chứa khoảng 272 triệu hạt phấn có kích thước rất nhỏ Chỉ khoảng 40% hạt phấn có khả năng thụ phấn trong mỗi phát hoa Thời gian để hoa cái đầu tiên nở hoa đến hoa cái cuối cùng thụ phấn xong trên cùng một phát hoa gọi là pha cái, kéo dài từ 5-7 ngày

Hoa đực có 6 bản bao hoa mọc thành 2 vòng, và 6 nhị Hoa cái có bao hoa như hoa đực và 3 tâm bì Thời gian để hoa đực đầu tiên mở đến hoa đực cuối cùng mở gọi là pha đực, kéo dài 18-22 ngày Thời gian xuất hiện của pha đực và pha cái hình thành nên kiểu thụ phấn khác nhau và là một trong những đặc tính quan trọng để phân biệt giữa các giống Trên giống dừa Ta, pha đực

Quá trình hình thành trái trải qua các giai đoạn:

Trước tiên túi phôi phát triển thành khoang trống ở giữa trái, thể tích xoang tăng dần Từ tháng thứ 3, gáo bắt đầu hình thành Lúc đầu lớp tế bào có thành mềm, về sau hóa gỗ dần dần Nước dừa bắt đầu tích tụ ở xoang từ tháng thứ 3 và thể tích nước tăng dần, đạt tối đa vào tháng thứ 7 Nước dừa phát sinh

từ dung dịch dưỡng chất bên ngoài, được cây hấp thu và được hệ thống mạch dẫn truyền tới trái Sau đó dung dịch dinh dưỡng này được các lớp tế bào bên trong làm thay đổi thành phần do các phản ứng sinh hóa xảy ra ở tế bào

Lúc trái gần chín (11-12 tháng tuổi), gáo gần như hóa gỗ, trở nên rất cứng và không thấm nước Tuy nhiên quá trình trao đổi khí và chất vẫn còn tiếp tục một cách hạn chế ở con mắt mềm vì ở nơi đây lớp tế bào nội bì mỏng

và ít

7

Từ tháng thứ 7, cơm dừa bắt đầu hình thành Tế bào ở lớp cơm dừa hấp thụ nước dừa nên lượng nước giảm dần, để lại một khoảng trống chứa không khí ở trong xoang Dưỡng chất có trong nước dừa và oxygen có trong lớp khí này cần cho quá trình nảy mầm của phôi về sau

Nước dừa lúc 7-8 tháng tuổi uống rất ngon do sự hài hòa giữa độ chua (acid) và độ ngọt (các chất đường) Nước dừa khô lạt hơn, đục hơn và ít hơn,

do đó khi lắc trái ta nghe có tiếng kêu bên trong

Vỏ dừa dày từ 1-5cm tùy theo giống, phần cuống có thể dày đến 10cm Gáo dừa có độ dày khoảng 3-6mm Thu hoạch trái ở giai đoạn 10 tháng sau khi đậu trái có thể giảm năng suất do trái chưa phát triển đầy đủ nhưng ở giai đoạn

từ 11 tháng trở đi thì trái có thể dùng làm giống

2.1.3 Nhu cầu sinh thái

2.1.3.1 Điều kiện nhiệt độ - khí hậu

Nhiệt độ thích hợp cho cây dừa là 270C và dao động từ 20-340C Nhiệt

độ thấp dưới 150C gây ra hiện tượng rối loạn sinh lý của cây Do tác động của nhiệt độ nên trồng dừa ở độ cao trên 500m thường cho năng suất không cao

Cây dừa có thể trồng trên các vùng có lượng mưa trung bình hằng năm

từ 1000-4000mm Lượng mưa lý tưởng từ 1500-2300mm và phân bố tương đối đều trong năm Ẩm độ thích hợp là 80-90%, ẩm độ thấp hơn 60% có thể gây ra hiện tượng trái non

2.1.3.2 Ánh sáng

Dừa là cây ưa sáng, cần tối thiểu 2000 giờ chiếu sáng trong mỗi năm,

120 giờ chiếu sáng mỗi tháng (4 giờ/ ngày)

- Ở nồng độ thấp làm biến đổi các hoạt động sinh lý (kích thích, điều hoà hay cản các quá trình sinh lý của thực vật)

- Ở nồng độ cao chúng trở thành chất độc cho thực vật (đặc biệt là với con người)

- Chất điều hoà sinh trưởng nội sinh ít bền và dễ kiểm soát hơn so với các chất điều hoà ngoại sinh Do vậy trong thực tế các chất điều hoà tổng hợp được sử dụng rất phổ biến

Chất điều hoà sinh trưởng thực vật được phân làm 5 nhóm chính là: Auxin, Cytokinin, Gibberilin, Acid Abscisic và Ethylen Mỗi chất có những tác dụng sinh lý khác nhau trên quá trình sinh trưởng của thực vật tự nhiên

và thực vật trong nhân giống in-vitro

Auxin:

Auxin là hormon đầu tiên trong cây được phát hiện vào năm 1934, là một hợp chất tương đối đơn giản: indol-3-acetic acid (IAA) Auxin được tổng hợp trong ngọn thân, trong mô phân sinh (ngọn, lóng) và lá non (tức nơi có sự phân chia tế bào nhanh) từ tryptophan được tổng hợp trong lá trưởng thành dưới ánh sáng Sau đó auxin được di chuyển đến rễ và tích tụ trong rễ

Auxin chủ yếu của thực vật là indole-3-acetic acid (IAA), ngoài ra còn

có các dẫn xuất của nhân indole như indole-3-butyric (IBA), α-naphtalen acetic acid (NAA), 2,4 dichlorophenoxy acetic acid (2,4-D)

9

Tác dụng sinh lý của Auxin:

 Sự kéo dài và phân chia tế bào: do auxin có tác dụng kích thích mạnh lên sự kéo dài chiều ngang của tế bào, làm cho tế bào phình

to lên Sự kéo dài của các tế bào gây lên sự tăng trưởng của cơ quan và toàn cây

 Kích thích sự tăng trưởng chồi non

Gibberellin:

Gibberellin là nhóm hormon thứ hai được phát hiện vào năm

1955-1956 Đó chính là axit gibberellic (GA3) Gibberellin cũng được xem là một hormon quan trọng của thế giới thực vật

Ngày nay, người ta đã phát hiện ra rễ trên 60 loại gibberellin trong cây

và kỳ diệu là GA1,GA2, GA3, GA60 , trong đó GA3 có hoạt tính hóa học mạnh nhất GA3 được sản xuất bằng con đường lên men và chiết xuất sản phẩm từ dịch nuôi cây nấm

Gibberellin được tổng hợp chủ yếu trong lá non, một số cơ quan non đang sinh trưởng như phôi hạt đang nảy mầm, quả non, rễ non sự vận chuyển nó trong cây theo hệ thống mạch dẫn và không phân cực như auxin

GA trong cây cũng có thể ở dạng tự do hoặc ở dạng liên kết với hợp chất khác

Vai trò của GA3 :

 Hiệu quả rõ rệt nhất của GA là kích thích mạnh mẽ sự sinh trưởng

về chiều cao của thân, chiều cao của cành, của rễ, sự kéo dài của lóng cây hòa thảo Hiệu quả này có được là do ảnh hưởng kích thích đặc trưng của GA lên sự dãn theo chiều dọc của tế bào, GA

GA liều cao (hay phối hợp với cytokinin) kích thích sự tăng trưởng

lá (diện tích có thể gấp đôi bình thường)

 Sự phát triển chồi cây và nảy mầm của hạt

 GA làm chậm hiện tượng ngủ của chồi do ngày ngắn cảm ứng (mùa thu), và gỡ sự ngủ của các chồi cây gỗ (đối kháng AAB)

 Trong phần lớn các trường hợp, GA có hoạt động bổ sung cho auxin Thông thường, GA làm tăng hàm lượng auxin trong các mô

mà nó kích thích Tuy nhiên, hai chất này có hoạt động độc lập Cytokinin:

Cytokinin là hormon thứ ba được phát hiện năm 1963 Khi nuôi cấy

mô thực vật, người ta phát hiện ra một nhóm chất hoạt hóa sự phân chia tế bào mà thiếu chúng thì sự nuôi cây mô không thành công, đó là 6-furfurilaminopurin, tức kinetin Kinetin chỉ hoạt động khi có auxin hiện diện, không có auxin sự phân chia tế bào do cytokinin không xảy ra Ngược lại, không có cytokinin thì auxin tạo thành các tế bào khổng lồ (không có sự phân vách) Kinetin không có trong thiên nhiên Cytokinin tự nhiên chủ yếu

là zeatin Các cytokinin tổng hợp được sử dụng khá rộng rãi trong nuôi cấy

mô tế bào là kinetin và benzyl adenine (BA)

Cơ quan tổng hợp cytokinin là hệ thống rễ, từ rễ cytokinin được vận chuyển lên các bộ phận trên mặt đất theo hướng ngược chiều auxin nhưng không có tính phân cực rõ rệt như auxin Ngoài rễ ra, một số cơ quan non đang sinh trưởng cũng có khả năng tổng hợp một lượng nhỏ bổ sung thêm cho nguồn cytokinin của rễ

11

Vai trò của cytokinin:

 Hoạt động trong sự tăng trưởng tế bào : Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào với điều kiện có auxin Cytokinin tác động trên cả hai bước của sự phân chia tế bào là phần nhân và phân bào Cytokinin giúp sự gia tăng kích thích tế bào và sinh tổng hợp protein Trong thân và rễ, cytokinin cản sự kéo dài tế bào, nhưng kích thích sự tăng rộng tế bào (sự tăng trưởng củ) Cytokinin cũng kích thích sự gia tăng kích thước tế bào lá trưởng thành (auxin không có tác dụng này)

 Hoạt động trong sự tạo cơ quan: tùy theo tỷ lệ auxin/cytokinin (A/C) trong môi trường nuôi cấy

+ Auxin/cytokinin cao kích thích sự tạo rễ + Auxin/cytokinin thấp kích thích sự tạo chồi

 Như vậy, cytokinin hỗ trợ auxin trong sự tăng trưởng nhưng đồng thời cũng có sự đối kháng giữa auxin (giúp sự tạo rễ) và cytokinin (giúp sự tạo chồi), sự cân bằng hai loại hormon này là một trong những yếu tố kiểm soát sự phát triển

 Hoạt động của cytokinin trong sự trưởng thành của diệp lạp : trong tối cây mầm bị hoàng hóa, nếu lá hoàng hóa được xử lý cytokinin trước sự chiếu sáng, diệp lục tố và các enzym quang hợp sẽ được tổng hợp mạnh hơn khi lá được chiếu sáng (sự kích thích không xảy ra trong tối)

Ethylene:

Là một loại hormone ở thể khí (CH2=CH2), có nguồn gốc từ các vùng

có nồng độ auxin cao Nó hoạt hoá sự chín đồng thời kích thích sự phát triển về phía bên của các tế bào kéo dài

Acid abscisic:

Là một loại hormone làm chậm sự sinh trưởng, duy trì trạng thái ngủ,

có nguồn gốc từ các tế bào chịu stress

12

2.2 Phương pháp nhân giống dừa hiện nay

Trồng dừa theo phương pháp truyền thống:

Chọn trái dừa giống: Chọn trái dừa không quá non, không quá già, trái

đủ độ chín, khoảng 10- 11 tháng tuổi Cuốn trái không bị thối nhũn Trái giống đều đặn, không dị dạng và sâu bệnh

Vạt vỏ trên đầu trái cho dễ thấm nước Để trái nằm ngang cho nước dừa dễ tiếp xúc với mộng dừa, cung cấp dinh dưỡng cho mộng phát triển ra chồi non Dăm dừa xuống đất, tủ mụn dừa và tưới ẩm thường xuyên Khi trái lên 4-5 lá đem trồng ra vườn

Trồng dừa theo phương pháp nuôi cấy phôi in vitro :

Lấy phôi từ trái dừa khoảng 10-11 tháng tuổi, đem cấy vào môi trường dinh dưỡng thay thế cho nội nhũ, nuôi trong điều kiện vô trùng, phôi nảy mầm

và phát triển thành cây con Khi cây con có từ 4-5 lá thì đem ra vườn ươm

Ảnh 2.3: Nuôi cấy phôi dừa in vitro

2.3 Tình hình nghiên cứu kỹ thuật ghép phôi dừa ở nước ngoài

Được tài trợ và phát triển bởi trường đại học Queensland (Australia) thông qua dự án ACIAR- HORT/1998/061 Nghiên cứu mang tính tiên phong được thực hiện đầu tiên tại Brisbane, tuy nhiên tỉ lệ thành công là rất thấp Sau đó, dự án này được tiếp tục nghiên cứu bởi nhà khoa học Osmundo Orense tại trung tâm ARC (Albay Research Centre) Philippines Tuy nhiên,

2.4 Tình hình nghiên cứu kỹ thuật ghép phôi dừa ở trong nước

Cho đến hiện nay, vẫn chưa có bất kì công trình khoa học nào nghiên cứu về kỹ thuật ghép phôi dừa được công bố trong nước

14

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành

Đề tài được thực hiện tại phòng nuôi cấy mô của trạm thực nghiệm Bình Thạnh thuộc Viện Nghiên Cứu Dầu Và Cây Có Dầu (1143 Bình Qưới, phường 28, quận Bình Thạnh, thành phố Hồ Chí Minh)

Thời gian tiến hành đề tài bắt đầu từ 18/10/2010 đến 20/01/2011

3.2 Nội dung nghiên cứu

 Thăm dò phương pháp khử trùng giá thể ghép

 Thăm dò kỹ thuật ghép

 Thăm dò môi trường làm đầy giữa phôi ghép và giá thể ghép

 Thăm dò thời gian nuôi cấy phôi ghép trước khi tiến hành ghép

3.3 Vật liệu nghiên cứu

3.3.1 Nguyên liệu

Dừa Ta được thu mua từ huyện Cầu Kè, tỉnh Trà Vinh

3.3.2 Dụng cụ và thiết bị cần cho quá trình nghiên cứu

- Dao cấy, dao tách, pince, đĩa petri, giá đỡ

- Một số dụng cụ cần thiết khác dùng trong pha chế môi trường

15

Hình ảnh của một số thiết bị sử dụng trong quá trình thực hiện đề tài:

Ảnh 3.1: Máy khoan dừa

Ảnh 3.2: Kính hiển vi quang học

Khử trùng phôi cấy trong tủ cấy vô trùng:

 Ngâm phôi dừa trong cồn 960 trong vòng 1-2 phút

 Ngâm phôi dừa trong javen 100% trong 20 phút

 Rửa lại bằng nước cất vô trùng khoảng 5-6 lần

 Dùng dao tách tách lấy phôi ra khỏi lớp cơm dừa

 Ngâm phôi đã được tách vào javen 10% trong vòng 1-2 phút

 Tiếp tục rửa lại phôi 3 lần bằng nước cất vô trùng

 Phôi đã sẵn sàng cho các thí nghiệm tiến hành

3.4.3 Phương thức tiến hành ghép phôi dừa

 Dừa sau khi đem về được lột bỏ lớp vỏ bên ngoài, làm vệ sinh sạch sẽ

 Đem đi khoan

Các bước thao tác trong tủ cấy vô trùng:

 Khử trùng vết cắt với javen

 Rửa sạch javen bằng nước cất vô trùng 5-6 lần

 Để vết cắt khô

 Dùng dao tách tách lớp vỏ đã khoan

 Dùng dao cấy lấy phôi của giá thể ghép

 Thay thế phôi đã lấy bằng phôi dừa dùng để ghép

17

 Đậy lớp vỏ đã tách trở về vị trí cũ

 Bịt kín mối ghép bằng keo sillicon

 Để trong phòng cấy vô trùng một ngày, sau đó đem ra trồng với

xơ dừa đã qua hấp khử trùng

 Duy trì độ ẩm cho quá trình nảy mầm bằng cách thường xuyên tưới nước cho trái ghép

3.4.4 Bố trí thí nghiệm

3.4.4.1 Thăm dò phương pháp khử trùng giá thể ghép

Thí nghiệm một yếu tố gồm 6 nghiệm thức được bố trí theo khối đầy

đủ hoàn toàn ngẫu nhiên, được lặp lại 3 lần với số lượng 5 trái/ nghiệm

18

Phương thức tiến hành khử trùng cho giá thể ghép:

Trái đối chứng sẽ được ngâm javen ở phần có mắt nảy mầm theo tỉ lệ:

Đối với nghiệm thức N1, N2, N3:

 Giá thể ghép được đem đi khoan

 Khử trùng vết cắt với javen theo tỉ lệ như bảng trên Thao tác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng

Đối với nghiệm thức N4, N5, N6:

 Giá thể ghép được khử trùng với javen 20% trong 60 phút

 Giá thể được đem đi khoan

 Khử trùng vết cắt với javen theo tỉ lệ như bảng trên Thao tác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng

Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ nhiễm, tỉ lệ nảy mầm

Thời gian theo dõi trái ghép: 8 tuần (được tính từ lúc ghép)

Phương pháp được chọn (Nx) được dùng làm phương pháp khử trùng cho các thí nghiệm tiếp theo