Khi đun sôi sẽ chuyễn sang màu đỏ cam do protein bị biến tính, phức hợp carotenoid bị phá vỡ, màu carotenoid trở lại bình thường.[8] 1.2.3.2 Khả năng hấp thụ ánh sáng Hệ thống liên kết
QUAN
Giới thiệu về da
Da là cơ quan lớn nhất trên cơ thể người, chiếm khoảng 2m² và chiếm từ 15–20% trọng lượng cơ thể Với vai trò là hàng rào bảo vệ tự nhiên, da giúp duy trì thân nhiệt ổn định, ngăn ngừa mất nước và bảo vệ cơ thể khỏi các tác nhân gây hại từ môi trường như vi khuẩn, bụi bẩn và tia UV từ ánh nắng mặt trời.
Biểu bì da gồm hai lớp chính: lớp sừng và lớp tế bào non Lớp sừng được hình thành từ các tế bào keratin hóa, đóng vai trò bảo vệ các lớp da bên trong khỏi tác động bên ngoài Trong khi đó, lớp tế bào non chứa các melanin bào sinh, là yếu tố quyết định sắc tố và màu sắc của làn da.
Chân bì là lớp da nằm ngay dưới biểu bì, đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì cấu trúc và độ săn chắc của da nhờ chứa collagen và elastin Đây là mạng lưới các sợi liên kết có chức năng nâng đỡ và nuôi dưỡng da, đồng thời chứa các thành phần thiết yếu như mạch máu, dây thần kinh, tuyến mồ hôi và tuyến bã nhờn, giúp da khỏe mạnh và hoạt động hiệu quả.
Lớp hạ bì là tầng sâu nhất của da, nằm dưới lớp chân bì, chứa nước, mô liên kết và mô mỡ, giúp duy trì độ ẩm và độ đàn hồi cho da Với vai trò như một lớp đệm tự nhiên, hạ bì bảo vệ cơ thể khỏi các tác động bên ngoài và hỗ trợ liên kết giữa da và các cơ quan bên dưới, góp phần giữ cho làn da khỏe mạnh và ổn định.
Cấu trúc lớp sừng (Stratum corneum, SC): [2,3]
Corneocyte là những protein phức tạp được cấu tạo từ các sợi keratin xếp chặt chẽ, có khả năng giữ nước trong thớ và nằm trong lớp vỏ đã được sừng hóa, phủ lớp lipid bảo vệ Các corneocyte liên kết với nhau thông qua corneodesmosome, đóng vai trò như những “viên gạch” tạo nên hàng rào bảo vệ da, giúp duy trì độ ẩm và ngăn ngừa tác nhân gây hại từ môi trường.
- Intercellular lipid (lipid gian bào): lớp lipid liên tục điền đầy khoảng trống giữa các “viên gạch” Có cấu trúc crystalline lamellar Đóng vai trò nhƣ
Hình 1.2 Cấu trúc lớp sừng
1.1.3 Các đường thẩm thấu vào da [2,4]
Transappendageal: qua các lỗ chân lông hay tuyến mồ hôi, không qua lớp stratum corneum
Transepidermal: qua lớp stratum corneum Gồm:
• Intercellular: đi theo lipid gian bào
• Transcellular: đi xuyên qua các corneocyte
Hình 1.3 Các đường thẩm thấu
Hình 1.4 Con đường gian bào và xuyên bào
Carotenoid
1.2.1 Giới thiệu chung về Carotenoid
Carotenoid là sắc tố hữu cơ tự nhiên có mặt trong thực vật, tảo, một số loài nấm và vi khuẩn quang hợp, với hơn 600 loại đã được phát hiện Trong số đó, hơn 50 loại tồn tại trong trái cây, nhưng chỉ có 14 loại được tìm thấy trong máu người và đang được chứng minh có vai trò quan trọng đối với sức khỏe Vì cơ thể con người không thể tự tổng hợp carotenoid, nên việc bổ sung chúng thông qua thực phẩm tự nhiên như trái cây và rau xanh là cần thiết để duy trì chức năng sinh lý và tăng cường sức đề kháng.
Carotenoid giúp chống lại các tác nhân oxy hóa từ bên ngoài
Carotenoid là nhóm sắc tố tự nhiên có màu vàng, da cam và đỏ, phân bố rộng rãi trong thực vật và động vật Chúng còn được gọi là chất màu lipocromic do khả năng tan trong lipid, giúp chúng dễ dàng hấp thụ và tích lũy trong các mô giàu chất béo Trong cơ thể sinh vật, carotenoid tồn tại ở nhiều dạng khác nhau, đóng vai trò quan trọng trong quá trình quang hợp, bảo vệ tế bào khỏi tổn thương oxy hóa và hỗ trợ sức khỏe con người thông qua việc chuyển hóa thành vitamin A.
- : Dung dịch nhũ tương với chất béo
- : Phân tán trong môi trường dầu béo
- : Ester hóa với acid béo
Các carotenoid phổ biến nhất bao gồm lycopene và các β-carotene là tiền chất của vitamin A
1.2.2 Cấu tạo và phân loại
Hầu hết các carotenoid trong tự nhiên đều là tetraterpenoid gồm có 8 phân tử isoprenoid
Công thức chung của carotenoid biểu diễn nhƣ sau:
Carotenoid là hợp chất có cấu trúc phân tử đa dạng, có thể tồn tại dưới dạng vòng hoặc không vòng, với các vòng 5 cạnh hoặc 6 cạnh xuất hiện ở một hoặc hai đầu phân tử Trong tự nhiên, phần lớn carotenoid tồn tại ở dạng đồng phân trans, tuy nhiên một lượng nhỏ đồng phân cis cũng được hình thành do quá trình chuyển đổi từ dạng trans sang cis.
1.2.2.2 Phân loại :[7] a Carotenoid hydrocacbon (carotene) tan trong dung môi kém phân cực nhƣ hexan, ete dầu hỏa, toluen,… b Nhóm xanthophy là các dẫn xuất oxy của carotenoid Những hợp chất đó là hydroxy, keton, epoxy, methoxy hoặc carboxylic acid, nhóm này tan trong etanol, aceton,…
Hầu hết các hợp chất của carotenoid đều không tan trong nước, chúng chỉ hòa tan đƣợc trong các dung môi hữu cơ nhƣ aceton, alcohol, ethyether, chloroform, và ethyl acetate Ngoại trừ một số carotenoid có chứa nhóm phân cực mạnh tan được trong nước như norbixin, các sulphat carotenoid và các dẫn xuất glycosyl của crocetin là crocin
Carotenoid tinh khiết có độ ổn định cao khi được bảo quản dưới dạng huyền phù hoặc dung dịch trong dầu thực vật, đặc biệt hiệu quả hơn khi kết hợp với chất chống oxy hóa như α-tocopherol Tuy nhiên, khi đun sôi, protein bị biến tính làm phá vỡ phức hợp carotenoid, khiến màu sắc chuyển sang đỏ cam rồi trở lại màu carotenoid ban đầu.
1.2.3.2 Khả năng hấp thụ ánh sáng
Liên kết đôi liên hợp trong cấu trúc phân tử của carotenoid tạo nên nhóm mang màu có khả năng hấp thụ ánh sáng, giúp carotenoid sở hữu màu sắc đặc trưng và hấp dẫn Chính đặc tính này cho phép xác định phổ hấp thu ánh sáng, đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu carotenoid Việc thay đổi hoặc mất màu trong quá trình phân tích là dấu hiệu cho thấy sự biến tính hoặc thay đổi cấu trúc của hợp chất, ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả nghiên cứu.
Carotenoid, đặc biệt là bixin, có cấu trúc nối đôi liên hợp nên rất dễ bị oxy hóa dẫn đến mất màu hoặc biến đổi màu sắc thông qua quá trình đồng nhũ hóa và hydro hóa Độ bền màu của các hợp chất này bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như nhiệt độ, ánh sáng, sự hiện diện của ion kim loại, phản ứng oxy hóa trực tiếp hoặc gián tiếp, cũng như tác động của các enzyme như peroxidase, lipxidase và lippeoxidase.
Carotenoid là hợp chất chống oxy hóa mạnh, đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ sức khỏe Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng tiêu thụ thực phẩm giàu carotenoid giúp giảm nguy cơ mắc các loại ung thư phổ biến – nguyên nhân hàng đầu gây tử vong hiện nay Ngoài ra, carotenoid còn hỗ trợ giảm nguy cơ bệnh tim mạch, điều hòa nồng độ cholesterol trong máu và hạn chế tác hại của tia UV từ ánh nắng mặt trời lên da, góp phần duy trì làn da khỏe mạnh.
1.2.4 Carotenoid có trong hạt điều nhuộm
1.2.4.1 Giới thiệu tổng quan về cây điều nhuộm[6,12,13,14] a Tên gọi
Tên khoa học: Bixa Orellana L
Tên khoa học cũ: Bixa Acuminata, B Americana, O Orellana, B Tinctoria,…
Tên khác: điều màu, điều dầu, cây cà ri, cây son môi, cây chầm phù…
Tên nước ngoài: Annatto, Roucou (Anh), Urucum(Đức), Achiote (Tây Ban Nha)
Họ: Điều nhuộm (tên khoa học là: Bixaceae)
Cây điều nhuộm là loài thực vật phổ biến tại các vùng nhiệt đới của Châu Mỹ, đặc biệt tập trung nhiều ở Nam Mỹ và khu vực Caribê Brazil và Peru được xem là quê hương bản địa của loài cây này, nơi điều kiện sinh thái thuận lợi giúp cây phát triển mạnh mẽ và cho năng suất thu hoạch cao.
Cây thuộc loài cây ưa sáng sinh trưởng nhanh, trồng bằng hạt rất dễ
Thời điểm lý tưởng để thu hoạch hạt điều nhằm chiết tách chất bixin đạt hiệu quả cao nhất là vào đầu tháng 6 kể từ khi cây ra quả, tức khoảng tháng 2 hàng năm Quá trình chiết xuất bixin đạt tỷ lệ tối ưu 19,8% khi sử dụng dung môi etylaxetat ở nhiệt độ 80°C, với tỷ lệ R/L là 1/18 và thời gian chiết tách kéo dài 10 giờ Đây là điều kiện tối ưu giúp nâng cao hiệu suất chiết xuất bixin từ hạt điều, phục vụ tốt cho các ứng dụng công nghiệp và thực phẩm.
Hình 1.5 Trái điều nhuộm khi chín 1.2.4.2 Thành phần carotenoid có trong hạt điều nhuộm[15,16,17]
Bixin là chất màu chủ yếu trong phần cơm của hạt điều nhuộm, chiếm hơn 80% thành phần và có màu đỏ đặc trưng, là một ester monomethyl của acid dicarboxilic norbixin Ngoài ra, hạt điều màu còn chứa norbixin – một acid dicarboxilic tạo ra sắc vàng, góp phần làm phong phú thêm bảng màu tự nhiên của hạt điều.
Có công thức phân tử:C 25 H 30 O 4 Khối lƣợng phân tử: 394,5 g/mol Khối lƣợng riêng: 1,0353g/cm 3 Nhiệt độ nóng chảy: 217 O C ở 1atm
Bixin là một hợp chất màu tự nhiên có nhiều trong lớp vỏ ngoài của hạt điều nhuộm, với thành phần chính là cis-bixin và một lượng nhỏ trans-bixin Chất này có thể được chiết xuất bằng nhiều loại dung môi như acetone, methanol, hexane, ethanol, isopropyl alcohol, ethyl acetate, rượu kiềm hoặc carbon dioxide Do bixin tan tốt trong dầu thực vật, quá trình chiết xuất thường được thực hiện ở nhiệt độ khoảng 100°C để đạt hiệu quả tối ưu.
Norbixin là một hợp chất có công thức phân tử C₄₂H₂₈O₄, với khối lượng phân tử 380,5 g/mol và khối lượng riêng 1,069 g/cm³ Hợp chất này có nhiệt độ nóng chảy là 250°C và nhiệt độ sôi lên đến 622°C Trong hạt điều dầu, norbixin tồn tại dưới hai dạng đồng phân là cis-norbixin và trans-norbixin, đều có khả năng tan trong nước Quá trình chiết xuất norbixin thường được thực hiện bằng cách ngâm hạt điều trong nước ở nhiệt độ khoảng 70°C để thu được thành phần hoạt chất này.
1.2.4.3 Tác dụng và ứng dụng của cây điều nhuộm trong mỹ phẩm[18,19,20,21,22]
Bixin và norbixin là hai hoạt chất chính có trong hạt điều nhuộm, sở hữu màu vàng tươi rực rỡ, bền màu, không độc hại và không gây kích ứng da Nhờ những đặc tính vượt trội này, chúng thường được sử dụng làm chất tạo màu tự nhiên trong các sản phẩm mỹ phẩm và chăm sóc da, góp phần nâng cao tính an toàn và hiệu quả trong ngành làm đẹp.
Liposome
Liposome là tiểu phân hình cầu kích thước nano, được tạo thành từ phospholipid tự nhiên và cholesterol, có khả năng tự tổ chức thành màng kép khi tiếp xúc với nước nhờ cấu trúc phân tử đặc biệt gồm đầu ái nước và đầu kị nước Khái niệm này được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1961 bởi nhà khoa học người Anh Alec D Bangham, đánh dấu bước tiến quan trọng trong lĩnh vực nghiên cứu sinh học và công nghệ nano.
Phospholipid là hợp chất lưỡng tính, este của glycerid có 2 đầu: đầu ái nước và đầu ái dầu
- 1 nhóm OH được este hóa bởi H3PO 4 là đầu ái nước
- 2 nhóm OH còn lại đƣợc este hóa bởi 2 acid béo là đầu ái dầu
Phospholipids consist of a hydrophilic head that can be bonded with compounds such as choline, glycerol, serine, inositol, or ethanolamine, and a hydrophobic tail made up of either saturated fatty acids like lauric acid (C12), myristic acid (C14), palmitic acid (C16), stearic acid (C18), or unsaturated fatty acids such as oleic acid (C18:1), linoleic acid (C18:2), and linolenic acid (C18:3) This structural diversity plays a crucial role in membrane fluidity and biological function.
■ Cấu trúc tổ hợp của phospholipid
Phospholipid là một loại phân tử có cấu trúc tương tự các chất hoạt động bề mặt đơn giản với một đuôi kị nước, cho phép chúng tự tổ hợp trong điều kiện thích hợp để hình thành các micelle khi nồng độ vượt quá ngưỡng CMC Tuy nhiên, do sở hữu hai đuôi kị nước, phospholipid có hình dạng cồng kềnh hơn và cấu trúc hình học khác biệt, dẫn đến khả năng tự tổ hợp của chúng tạo ra cấu trúc kép (bilayer) đặc trưng, thay vì chỉ tạo micelle như các chất hoạt động bề mặt thông thường.
Hình 1.8 Cấu trúc kép của phospholipid Hình 1.9 Trạng thái Lamellar
Cấu trúc kép của phospholipid với đầu ái nước hướng ra môi trường giúp các lớp màng dễ dàng phân bố trong nước Khi môi trường thiếu nước, các lớp màng trở nên sít chặt; ngược lại, khi thêm nước, nước sẽ len vào giữa hai lớp tạo thành kênh nước, làm tăng khoảng cách giữa chúng và phá vỡ trật tự ban đầu Kết quả là lớp bilayer bị phân tán trong nước, tạo nên trạng thái gọi là lamellar phase, có đặc tính giống chất lỏng và còn được gọi là “lamellar liquid crystal” với mức độ trật tự cao.
Hình 1.10 Giản đồ pha theo nhiệt độ và hàm lượng nước
Hình 1.11 Sự hình thành liposome từ trạng thái lamellar
Khi các phân tử trong lớp bilayer mất đi sự sắp xếp chặt chẽ, bề mặt bắt đầu uốn cong và dẫn đến hiện tượng đứt gãy Quá trình này diễn ra mạnh hơn khi lượng nước tăng, nhiệt độ giảm, và đặc biệt là khi có mặt chất hoạt động bề mặt – một loại dung môi kị nước có khả năng làm thay đổi cấu trúc màng.
Liposome là cấu trúc hình cầu với hốc rỗng chứa nước ở giữa, được bao bọc bởi lớp vỏ có cấu trúc bilayer có khả năng chứa các chất kị nước Quá trình hình thành liposome từ thể lamellar phụ thuộc vào nhiệt độ và hàm lượng nước trong môi trường, đóng vai trò quan trọng trong ứng dụng vận chuyển dược chất và nghiên cứu sinh học phân tử.
Hình 1.12 Cấu trúc của Liposome
Các phân tử lưỡng tính có khả năng tự tổ hợp thành các cấu trúc khác nhau tùy thuộc vào kích thước của đầu ái nước và kị nước Sự thay đổi về tỷ lệ giữa hai phần này ảnh hưởng trực tiếp đến hình dạng và tính chất của cấu trúc tự tổ hợp, từ đó quyết định chức năng và ứng dụng của chúng trong các lĩnh vực như sinh học, hóa học và vật liệu nano.
Bảng 1.1 Sự tương tác giữa hình dạng hình học của phân tử có tính chất lưỡng tính với hình dạng cấu trúc tự tổ hợp của chúng
Cấu trúc của phân tử
Dạng hình học của phân tử
Cấu trúc tự tổ hợp
Có một đuôi kị nước (đầu ái nước lớn hơn đầu kị nước)
(đầu ái nước bằng đầu kị nước)
Hình cầu dạng kép (liposome) hoặc dạng phẳng 2 lớp Đầu ái nước nhỏ hơn đầu kị nước
Có cấu trúc đảo, tạo dạng 6 cạnh nếu ở nhiệt độ cao
Hình 1.13 Một số dạng cấu trúc tự tổ hợp
Liposome được phân loại dựa trên số lượng lớp và kích thước của chúng:
+ Unilamellar vesicle (túi Unilamellar): liposome chỉ có 1 lớp màng kép lamellar
Túi Unilamellar nhỏ (Small unilamellar vesicle: SUV) = 0- 100nm
Túi Unilamellar lớn (Large unilamellar vesicle: LUV) = 100-1000nm
Túi Unilamellar khổng lồ (Giant unilamellar vesicle: GUV) >1000nm
+ Multilamellar vesicle (MLV): Liposome gồm nhiều lớp phospholipid kép đồng tõm – cú đường kớnh từ vài trăm nm đến vài àm
+ Multivesicle vesicle (MVV): Liposome gồm những túi nhỏ nằm trong một tỳi lớn cú đường kớnh vài trăm nm đến vài àm
1.3.3.1 Liposme có khả năng encapsule hóa
Một trong những đặc tính quan trọng nhất của liposome là khả năng bao bọc hoạt chất, hay còn gọi là encapsul hóa Nhờ cấu trúc đặc biệt, liposome có thể “nhốt” đồng thời cả hoạt chất ái nước và hoạt chất ái dầu bên trong, giúp tối ưu hóa hiệu quả vận chuyển và bảo vệ hoạt chất trong các ứng dụng dược phẩm và mỹ phẩm.
Hình 1.14 Khả năng encapsul hóa của liposome
Một đặc điểm quan trọng của liposome là khả năng tương thích cao với màng tế bào, giúp tăng hiệu quả hấp thụ và vận chuyển các hoạt chất trong cơ thể Nhờ cấu trúc linh hoạt, liposome có thể di chuyển dễ dàng qua các mô và cơ quan, hỗ trợ tối ưu hóa quá trình phân phối dược chất đến các vị trí cần thiết.
Bên cạnh đó khả năng phân tán tốt trong nước và còn tạo cho liposome khả năng di chuyển và khuếch tán dễ dàng
Một đặc tính nổi bật của liposome đang được nghiên cứu và ứng dụng mạnh mẽ hiện nay là khả năng bao gói nhiều lớp hoạt chất, đặc biệt thông qua các dạng liposome như multilamellar vesicle và multivesicular vesicle Tính năng này mở ra tiềm năng lớn trong việc tối ưu hóa hiệu quả phân phối dược chất, nâng cao độ ổn định và kiểm soát quá trình giải phóng hoạt chất trong các ứng dụng y sinh học.
1.3.3.2 Một số yếu tố ảnh hưởng lên quá trình encapsule hóa
- Thành phần lipid sử dụng
- Tính chất của chất hoạt động bề mặt chính và chất đồng hoạt động bề mặt
Một số yếu tố ảnh hưởng đến độ bền của liposome a/ Ảnh hưởng của lipid sử dụng[29]
Lipid không tinh khiết thường xuất hiện do quá trình thủy phân tạo ra lyso-lipid Sự gia tăng nồng độ lyso-lipid làm tăng khả năng hòa tan của liposome, từ đó dẫn đến sự phân hủy cấu trúc kép của liposome, ảnh hưởng đến độ ổn định và hiệu quả của hệ vận chuyển thuốc sinh học.
Để kiểm soát quá trình oxy hóa lipid, có thể áp dụng phương pháp quang phổ UV-VIS nhằm đo độ hấp thu A của dung dịch ethanol, giúp phát hiện các dấu hiệu oxy hóa hiệu quả Ngoài ra, liposome có khả năng biến đổi thành dạng chất hoạt động bề mặt, mở ra tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực sinh học và dược phẩm.
SDS là chất hoạt động mạnh có khả năng phá hủy cấu trúc liposome, và mức độ phá hủy này tăng theo nồng độ SDS Dựa vào đặc tính này, người ta áp dụng phương pháp nhanh để xác định độ bền của liposome, mở rộng từ các nghiên cứu trước đó Khả năng kiểm soát sự phóng thích hoạt chất bên trong liposome nhờ vào tính chất này đã mở ra hướng ứng dụng tiềm năng trong việc “nhốt” các hoạt chất trong nhiều lớp của multilamellar vesicle, với hoạt chất ái dầu được biểu diễn bằng hình que màu xanh lục và hoạt chất ái nước bằng hạt màu hồng.
Hình 1.15 Multilamellar vesicle và các hoạt chất bên trong
Liposome được tạo thành từ một loại phospholipid duy nhất có cấu trúc đối xứng cao và đồng nhất, khiến các phân tử phospholipid xếp chặt vào nhau và tạo nên một cấu trúc cứng nhắc Tuy nhiên, khi có sự hiện diện của các chất hoạt động bề mặt, liposome lại thể hiện tính đàn hồi đáng chú ý Trong khi phospholipid đóng vai trò hình thành và duy trì sự ổn định của lớp màng kép (bilayer), thì các chất hoạt động bề mặt lại có xu hướng làm giảm độ ổn định của cấu trúc này.
Liposome là hệ vận chuyển tiềm năng trong dược và mỹ phẩm nhờ tính chất không độc hại, không gây kích ứng da, kể cả vùng quanh mắt Tuy nhiên, tính ổn định của liposome cũng cần được chú trọng, vì các liposome nhỏ có thể va chạm và kết hợp thành liposome lớn hơn, làm thay đổi kích thước hạt và giảm hiệu quả vận chuyển hoạt chất Việc gắn polymer lên bề mặt liposome là giải pháp hiệu quả giúp ngăn chặn sự va chạm giữa các liposome, từ đó tăng cường độ ổn định của hệ thống.
1.3.3.3 Chọn nền phù hợp cho các liposome chứa hoạt chất trong tạo sản phẩm
PHÁP NGHIÊN CỨU
Tên đề tài
Nghiên cứu tạo hệ liposome bixin
Ý nghĩa và mục đích của đề tài
Mục đích của đề tài này là “nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng lên quá trình tạo hệ liposome bixin
Trong lĩnh vực nghiên cứu các hệ nano, có nhiều phương pháp được áp dụng để tạo ra các cấu trúc khác nhau Tuy nhiên, đối với những nghiên cứu ban đầu về Submicron bixin và dựa trên điều kiện hiện có trong phòng thí nghiệm, hệ liposome đã được lựa chọn là hệ phù hợp nhất để triển khai.
Nghiên cứu tập trung vào việc ứng dụng hạt nano liposome để bảo vệ và tăng khả năng hấp thụ bixin vào cơ thể, từ đó nâng cao hiệu quả sử dụng hoạt chất này trong nhiều lĩnh vực Bước đầu, bixin được triển khai trong ngành mỹ phẩm, với tiềm năng mở rộng sang dược phẩm và thực phẩm chức năng, góp phần tối ưu hóa giá trị sinh học và khả năng ứng dụng thực tiễn.
Luận văn tập trung nghiên cứu quá trình hình thành hệ liposome, với hai tiêu chí đánh giá quan trọng là kích thước hạt và độ bền của hệ, nhằm cung cấp cơ sở khoa học cho việc ứng dụng liposome trong lĩnh vực dược phẩm và sinh học.
Nội dung nghiên cứu
Đánh giá nguyên liệu và điều chế bixin từ hạt điều nhuộm bằng phương pháp trích ly
Đánh giá nguyên liệu hạt điều nhuộm
Đánh giá bixin (quang phổ UV-VIS)
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình tạo hệ phân tán liposome bixin
Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng chất nhũ hóa chính
Khảo sát ảnh hưởng của nguyên liệu làm tướng dầu
Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng dung dịch Bixin/ dầu Olive
Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng chất đồng nhũ hóa
Khảo sát tăng hàm lƣợng pha dầu trong hệ
Đánh giá tính chất sản phẩm
Ngoại quan: màu sắc, dạng sản phẩm thu đƣợc
Hình ảnh qua kính hiển vi quang (TEM)
Độ bền : thông qua hai thông số cơ bản
- Độ bền vỏ: Xác định bằng phương pháp đo độ đục T của nhũ dưới tác động của SDS
- Độ bền hoạt chất: xác định bằng phương pháp đo độ giảm độ hấp thu theo thời gian
Hóa chất và thiết bị
- Hạt điều nhuộm mua tại chợ Hoà Hƣng, Quận 10, Tp.HCM
- Dầu Olive, Tây Ban Nha
- Sodium dodecyl sulfate ( SDS), Trung Quốc
- Thiết bị quang phổ UV-VIS hiệu thermo Scientific - Helios Epsilon ở phòng thí nghiệm bộ môn hữu cơ
- Thiết bị đo độ phân bố kích thước hạt Microtrac Instrument ở trung tâm nghiên cứu và ứng dụng công nghệ, khoa công nghệ trường ĐH Cần Thơ
- Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission electron microscopy – TEM) ở phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia vật liệu polymer & compozit
- Máy đồng hóa tốc độ cao Philip
- Máy ảnh kỹ thuật số hiệu Cybersoft-Sony
Hình 2.3 Máy đo DLS Microtrac
Hình 2.1 Máy đồng hoá tốc độ cao Philip
Hình 2.2: Máy đo độ hấp thu
Nội dung nghiên cứu
2.5.1 Xác định hàm lƣợng bixin có trong hạt điều nhuộm
2.5.1.1 Sơ đồ khối của quá trình chiết tách
Thực hiện tách chiết hoạt chất bixin trong dung dịch dầu Olive có hỗ trợ khuấy của máy khuấy cơ và bếp gia nhiệt
Hình 2.4: Sơ đồ chiết tách Bixin từ hạt điều nhuộm 2.5.1.2 Thuyết minh quá trình
Cân chính xác 60,00g hạt điều nhuộm sau khi đã sấy khô cho vào becher 500ml Hệ thống chiết tách gồm có bếp gia nhiệt, nhiệt kế và máy khuấy cơ để hỗ
Chiết tách bixin 240ml dầu Olive
Lọc sơ bằng bông gòn Bã hạt
Quá trình chiết xuất hoạt chất từ hạt điều nhuộm được hỗ trợ bởi hệ thống Cdd.Vdd nhằm tăng hiệu quả khuấy trộn Sau đó, 240ml dầu Olive được thêm vào với tỷ lệ khối lượng hạt trên thể tích dung môi là 1/4, rồi lắp vào hệ thống chiết tách Quá trình chiết diễn ra trong 3 lần, mỗi lần kéo dài 6 giờ, đảm bảo chiết kiệt hoạt chất Nhiệt độ dung môi trong bình cầu được duy trì ổn định từ 65°C đến 70°C để tối ưu hiệu suất chiết xuất.
Sau khi chiết xuất, dung dịch sẽ được lọc thô bằng bông gòn nhằm loại bỏ hoàn toàn phần bã hạt Tiếp theo, dung dịch đã lọc sẽ được xử lý bằng phương pháp lọc chân không ba lần để đảm bảo độ tinh khiết tối ưu, từ đó thu được sản phẩm cuối cùng đạt chất lượng cao.
2.5.1.3 Xác định hàm lượng bixin có trong dung dịch sau khi chiết
Tiến hành: dung dịch sau khi chiết đƣợc lọc chân không rồi định mức Lấy
0,1000g hoạt chất định mức thành 50ml với dung môi Light Ether Petroleum Tiến hành đo độ hấp thu A trong máy đo UV-VIS và quét ở bước sóng λ 350:650 nm
Biểu thức tính hàm lượng Bixin có trong dung dịch:
Theo định luật Lambert-Beer: A = ε.b.C
Trong đó: A là độ hấp thu; ε là độ hấp thu mol (l.mol -1 cm -1 ); b là chiều dài của cuvet (cm);
Trong nghiên cứu về Bixin, nồng độ mol (C) được tính theo đơn vị mol/l, với chiều dài quang học b = 1 cm Bixin có độ hấp thu mol ε = 165500 l·mol⁻¹·cm⁻¹ khi hòa tan trong dung môi Light Ether Petroleum, cho thấy khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh mẽ Khối lượng phân tử của Bixin là 394,5 g/mol, và thể tích dung dịch sử dụng trong thí nghiệm là 0,050 lít Những thông số này đóng vai trò quan trọng trong việc xác định nồng độ và đặc tính quang học của Bixin, hỗ trợ tối ưu hóa quy trình phân tích và ứng dụng trong các lĩnh vực hóa học và dược phẩm.
2.5.2 Đánh giá sản phẩm Bixin
Dùng máy quét phổ UV-VIS để xác định các phổ tương ứng với các dung môi trên
Quét phổ UV-VIS được thực hiện tuần tự trong dung môi Light Ether Petroleum, trong khoảng bước sóng từ 350nm đến 650nm nhằm xác định các mũi hấp thụ cực đại của dung dịch Kết quả thu được được so sánh với dữ liệu bước sóng cực đại đã công bố trong các tài liệu trước đó để đánh giá mức độ sai lệch và độ chính xác của phép đo, góp phần khẳng định tính nhất quán và độ tin cậy của phương pháp phân tích phổ UV-VIS.
2.5.3.1 Qui trình tạo hệ liposome
Hình 2 5 Sơ đồ tạo hệ liposome Thuyết minh quy trình:
Tiến hành cân chính xác hỗn hợp Lecithin và dầu Olive chứa hoạt chất, sau đó khuấy nhanh bằng đũa thủy tinh để các thành phần hòa tan hoàn toàn Thêm 25 ml dung môi Diethyl Ether vào hỗn hợp và tiếp tục khuấy đều Dùng kim tiêm 6 ml hút dung dịch đã khuấy, rồi từ từ bơm vào becher chứa nước cất đang khuấy ở tốc độ cao, đảm bảo tổng khối lượng đạt 100g Quá trình khuấy tốc độ cao được duy trì trong các khoảng thời gian nhất định, sau đó để hệ ổn định trong 24 giờ trước khi tiến hành khảo sát.
Bảng 2.1 Bảng phối chế các thành phần khảo sát Lecithin, dầu Olive, Bixin
Mẫu khảo sát Lecithn Mẫu L
Nồng độ bixin Mẫu B 1,25 B= f(Cb)
2.5.3.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình tạo hệ phân tán liposome a Khảo sát ảnh hưởng của sự thay đổi hàm lượng Lecitin
Loạt mẫu L: thay đổi hàm lƣợng Lecithin từ 0,25 ÷ 1,50 g với CLecithin 0,25 g b Khảo sát ảnh hưởng của sự thay đổi hàm lượng dầu Olive
Loạt mẫu D: thay đổi hàm lƣợng dầu Olive 0,50 ÷ 1,75 g với Cd= 0,25 g c Khảo sát ảnh hưởng của sự thay đổi hàm lượng Bixin trong hệ
Loạt mẫu B: thay đổi hàm lƣợng bixin từ 0 ÷ 0,48 mg với Cb= 0,096 mg
Hình 2.6 Sơ đồ tạo hệ liposome có thêm chất đồng nhũ hóa
Thuyết minh quy trình: (tương tự như quy trình 1)
Bảng 2.2 Thành phần hệ khảo sát ảnh hưởng của chất đồng nhũ hóa
Mẫu khảo sát Tween 20 Mẫu T20
Tween 80 Mẫu T80 T 80 =f(C T80 ) ΔC T80 =0,25 d Khảo sát ảnh hưởng của chất đồng nhũ hóa Tween 20
Loạt mẫu T 20 thay đổi hàm lƣợng Tween 20 từ 0÷ 1,50(g) với ΔC T20 =0,25% e Khảo sát ảnh hưởng của chất đồng nhũ hóa Tween 80
Loạt mẫu T 80 thay đổi hàm lƣợng Tween 80 từ 0,25 ÷ 1,50 g với ΔC T80
=0,25% f Khảo sát tăng hàm lƣợng pha dầu
Phương pháp thực hiện: Ta tăng hàm lượng của các chất trong hệ lên lần lượt gấp 2; 4; 6
Bảng 2.3 Công thức của loạt mẫu khi tăng hàm lượng pha dầu
Dung dịch đệm photphat PH=6,5(g)
2.5.4 Đánh giá tính chất sản phẩm
2.5.4.1 Đánh giá ngoại quan của các mẫu L, D, B, T 20 , T 80 , S
2.5.4.2 Đánh giá độ bền hoạt chất và độ bền hạt theo thời gian Đánh giá độ bền hoạt chất theo thời gian
Hệ liposome: Lecithin, dầu Olive, Tween, nước cất
Các mẫu được khuấy đều theo thành phần đã định, sau đó để yên trong 24 giờ trước khi tiến hành đo mật độ phân bố kích thước hạt bằng phương pháp DLS nhằm xác định kích thước hạt chính xác Tiếp theo, lấy 3ml từ mỗi mẫu đem phơi nắng tại các mốc thời gian 1, 2, 3, 4 và 5 giờ Sau quá trình phơi sáng, các mẫu được phá nhũ bằng Ethanol 96% và đo độ hấp thu quang học tại bước sóng 452nm để đánh giá hiệu quả phân tán và ổn định của hệ nhũ tương.
Độ bền hoạt chất, ∆ A% được xác định bằng phương pháp quang phổ UV- VIS
Với: A là độ hấp thu của hoạt chất ở thời điểm T ( max )
A 0 là độ thu của hoạt chất ở thời điểm T = 0 ( max )
Chuẩn bị mẫu đo: lấy 1ml mẫu pha loãng và định mức bằng ethanol 99,5 0 thành 25ml dung dịch và đo độ hấp thu A ở = 446nm với mẫu trắng đo song song là ethanol 99,5 0 Đánh giá độ bền hạt
Theo tài liệu tham khảo [28], [31] độ ổn định của Liposome đƣợc đánh giá bằng phương pháp đo độ đục, phương pháp này đơn giản hơn phương pháp DLS
Yếu tố khảo sát: hàm lƣợng SDS
Phương pháp thực hiện: thay đổi nồng độ của SDS %từ 0; 2,5; 5; 10; 15; 20
Bảng 2.4 Công thức để đo loạt mẫu khảo sát hàm lượng SDS
Ta cân đúng khối lƣợng nhƣ bảng 2.4 rồi sau đó khuấy cho tan hết rồi để ổn định trong 48h Sau đó đem đi đo T % ở bước sóng 550nm
Với phương pháp đo độ đục, tính ổn định hạt chỉ phụ thuộc vào đường kính hạt Và qua nhiều khảo sát độ ổn định hạt cho thấy:
- Những nhũ thông thường có thể bị phân hủy khi có sự hiện diện của SDS ở nồng độ thấp nhỏ hơn 2,5%
- Trong khi Liposome có thể chịu đƣợc SDS đến nồng độ lớn hơn 10%
Chính vì điều đó người ta xác định độ bền hạt của nhũ khi cần so sánh với nhau sẽ dùng phương pháp đo độ đục (khi hạt bị phân hủy, dung dịch huyền phù trong dần) Được biểu thị mức độ phân hủy hạt tương ứng với nồng độ CSDS,%
Thường người ta vẽ đồ thị T Norm ,% = f (C SDS ,%), với C SDS ,% = 0; 2,5; 5; 10; 15; 20
Có 2 trường hợp thường gặp:
Hạt kém bền Hạt bền
Từ T Crit = 50% (A) hạt bị phân hủy gióng lên đường TNorm,% (B) và chiếu xuống trục C SDS , % (C) ta đƣợc nồng độ của SDS ở đó 50% hạt bị phân hủy
Từ nồng độ SDS 10%, tiến hành vẽ đường song song với trục tung để xác định điểm giao với đường biểu diễn T Norm (%) theo hàm số f(C SDS, %) Sau đó, gióng điểm giao lên trục T Norm (%) để tính toán phần trăm hạt bị phân hủy Kết quả này hỗ trợ đánh giá mật độ phân bố hạt bằng phương pháp DLS và phân tích hình dạng hạt qua ảnh TEM, góp phần tối ưu hóa quy trình phân tích đặc tính vật liệu nano.
- Thời gian: để qua 24 giờ
- Hàm lƣợng các chất: chọn hàm lƣợng Lecithin và Tween 80 tối ƣu sau khi khảo sát 2 yếu tố này
- Tốc độ khuấy: chọn tốc độ tối ƣu của máy
Các mẫu đƣợc chuẩn bị khuấy tạo hệ liposome với các điều kiện nhƣ trên Tiến hành đo mật độ phân bố kích thước hạt DLS để xác định kích thước hạt và chụp TEM
Phương pháp phân tích
2.6.1 Đo độ hấp thu và độ truyền suốt dùng máy UV-VISHELIOS ESPION
Các thế hệ máy quang phổ tử ngoại – khả kiến (UV-VIS spectrophometer) hiện nay thường gồm:
Nguồn sáng phổ biến trong các ứng dụng quang phổ bao gồm đèn hồ quang hydro nặng, chuyên dùng cho vùng tử ngoại từ 180–400nm, giúp tạo ra ánh sáng mạnh và ổn định Đối với vùng khả kiến trên 400nm, thường sử dụng đèn vonfram-halogen hoặc đèn thạch anh-iod, mang lại hiệu suất chiếu sáng cao và độ chính xác trong phân tích quang học.
Bộ phận phân tách ánh sáng trong hệ thống quang phổ hoạt động bằng cách tách các bức xạ từ nguồn thành các tia đơn sắc hẹp, sau đó dẫn lần lượt qua cuvet chứa dung môi và cuvet chứa mẫu Detector sẽ đo và so sánh cường độ ánh sáng đi qua mẫu (Iₜ) và dung môi (I₀), chuyển đổi tín hiệu quang thành tín hiệu điện, từ đó tính toán nồng độ chất dựa trên định luật Lambert-Beer.
Sau khi chùm sáng đơn sắc xuyên qua mẫu, nó được thu nhận bởi detector, thiết bị này kết nối với bộ tự ghi và máy tính thông qua phần mềm chuyên dụng Các phần mềm này có khả năng tính toán, lưu trữ phổ, đối chiếu và so sánh dữ liệu, giúp nâng cao độ chính xác và hiệu quả trong phân tích quang phổ.
Các máy quang phổ UV-VIS thường cung cấp các đường cong biểu diễn mối quan hệ giữa độ hấp thụ (A) và bước sóng (λ) hoặc tần số (ν) Trong đó, phổ hấp thụ theo bước sóng f(λ) phản ánh đặc tính riêng của chất hấp thụ và không bị ảnh hưởng bởi nồng độ, khác với các phổ A=f(λ) hoặc A=f(ν) vốn phụ thuộc vào nồng độ chất.
Máy quang phổ UV-VIS thông thường có khả năng ghi nhận phổ trong vùng tử ngoại gần và vùng khả biến từ 200 đến 800nm, một số thiết bị còn mở rộng phạm vi đo đến vùng hồng ngoại gần khoảng 1000nm Tuy nhiên, chỉ những máy quang phổ chuyên dụng mới có thể hoạt động hiệu quả trong vùng tử ngoại xa, hay còn gọi là vùng tử ngoại chân không với bước sóng nhỏ hơn 200nm.
2.6.2 Phương pháp đo kích thước hạt DLS
Kích thước của hạt được xác định bằng thiết bị đo mật độ phân bố hạt
Nguyên lý đo kích thước hạt dựa trên hiện tượng phân tán ánh sáng khi va chạm với các hạt trong mẫu Ánh sáng bị phân tán theo nhiều hướng, trong đó các hạt lớn chủ yếu phân tán về phía trước, còn các hạt nhỏ hơn phân tán sang hai bên và phía sau Đèn vonfram với bước sóng ngắn tỏ ra hiệu quả hơn so với tia laser He-Ne có bước sóng dài trong việc tạo mẫu phân tán từ các hạt nhỏ Bước sóng càng ngắn thì khả năng đo được các hạt càng nhỏ càng cao Việc tính toán đường kính hạt được thực hiện dựa trên lý thuyết Mie thông qua mẫu phân tán thu được.
Thiết bị có thể xác định kích thước hạt và trạng thái phân bố của hạt với nguồn sáng là tia laser He-Ne 1mW và đèn Vonfam 50W Đầu dò dạng vòng có gắn
Thiết bị được trang bị 75 diode ảnh cùng với 12 diode phóng xạ bổ sung, cho khả năng đo chính xác các hạt có kích thước từ 0,02µm đến 2.000µm Với thời gian đo mẫu nhanh và độ chính xác cao, sản phẩm này đáp ứng hiệu quả nhu cầu phân tích hạt trong nhiều ứng dụng công nghiệp và nghiên cứu.
Phân tích DLS bằng máy Microtrac Intrusment
2.6.3 Phương pháp kính hiển vi điện tử truyền qua TEM
Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) là thiết bị tiên tiến dùng để nghiên cứu vi cấu trúc của vật rắn, hoạt động bằng cách sử dụng chùm điện tử năng lượng cao xuyên qua mẫu vật mỏng Nhờ hệ thống thấu kính từ, TEM có khả năng tạo ảnh với độ phóng đại cực lớn, lên đến hàng triệu lần, giúp quan sát chi tiết cấu trúc nội tại của vật liệu Hình ảnh thu được có thể hiển thị trên màn huỳnh quang, lưu trên film quang học hoặc ghi lại bằng máy chụp kỹ thuật số, phục vụ hiệu quả cho các nghiên cứu khoa học và ứng dụng công nghệ nano.
QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Đánh giá tính chất mẫu hoạt chất Bixin
- Mùi: mùi hạt điều thơm nhẹ
Hình 3.1: Hoạt chất bixin trong dầu Olive
3.1.2 Xác định hàm lƣợng Bixin trong mẫu hoạt chất
Tiến hành quét phổ UV- VIS với dung môi Light Ether Petroleum trong dãy bước sóng từ 350-650nm
Hình 3 2: Phổ hấp thu của Bixin trong dung môi Light Ether Petroleum
Bảng 3 1 Độ hấp thu của Bixin trong dung môi Light Ether Petroleum
Thí nghiệm λ max (nm) A max (a.u)
Trung bình 452 0,400 h (bixin/dầu olive) (mg/g) 0,48
Phổ hấp thu của bixin trong dung môi Light Ether Petroleum có 3 mũi hấp thu đặc trưng các họ Carotenoid, trong đó bước sóng hấp thu cực đại là λmax E2 nm
Hàm lượng bixin trong dịch chiết tương đối thấp h = 0,48 mg/g.
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình tạo Liposome Bixin
3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của sự thay đổi hàm lượng Lecithin
Chuẩn bị mẫu khảo sát
Bảng 3.2 Thành phần phối chế trong khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng Lecithin
Dung dịch đệm photphat PH=6.5 L1
Điều kiện khuấy trộn và đồng hóa (thực hiện trên thiết bị đồng hóa tốc độ cao Philips Hr-1361)
- Nhiệt độ đồng hóa t đh ( 0 C) = t 0 C phòng
- Thời gian đồng hóa T đh (ph) = 14
- Vận tốc đồng hóa V đh (rpm) = 15000
Đánh giá độ bền hoạt chất Đánh giá độ bền hoạt chất thông qua tỉ lệ phân hủy hoạt chất ∆A% theo thời gian phơi sáng
Bảng 3.3 Biến đổi độ bền hoạt chất theo thời gian phơi nắng trong khảo sát ảnh hưởng cuả hàm lượng lecithin (phụ lục 1 )
Sai biệt độ hấp thu ∆A% (λD6nm)
Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn sự biến thiên độ bền hoạt chất theo thời gian phơi nắng trong khảo sát ảnh hưởng của lecithin
Đánh giá độ bền hạt Đánh giá độ bền hạt thông qua độ truyền suốt T% khi cho SDS vào mẫu khảo sát
Bảng 3.4 Biến đổi độ bền vỏ theo nồng độ SDS(%) trong khảo sát của hàm lượng lecithin (phụ lục 2) Độ truyền suốt T(%)
Hình 3.4: Đồ thị biến đổi độ truyền suốt của mẫu khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng lecithin
Nhận xét: từ kết quả thực nghiệm trên độ bền hoạt chất và độ bền vỏ liposome :
Theo hình 3.3, khi hàm lượng lecithin tăng từ 0,25% đến 1,25%, độ bền của hoạt chất cũng tăng dần, đạt cực trị tại mẫu L5 với hàm lượng lecithin 1,25% Tuy nhiên, khi hàm lượng lecithin vượt quá 1,25%, độ bền hoạt chất bắt đầu giảm, cho thấy mức lecithin tối ưu là 1,25% để đạt hiệu quả ổn định cao nhất.
Hình 3.5: Sự biến đổi về màu ở hàm lượng lecithin khác nhau trong cùng một thời gian phơi nắng
Theo hình 3.4, khi hàm lượng lecithin tăng từ 0,25% đến 1,25%, độ bền của vỏ tăng dần và đạt cực đại tại mẫu L5 với hàm lượng lecithin 1,25% Tuy nhiên, khi hàm lượng lecithin vượt quá 1,25%, độ bền vỏ bắt đầu giảm, cho thấy ngưỡng tối ưu của lecithin trong quá trình tạo vỏ.
Hình 3.6 Sự biến thiên độ đục ở các hàm lượng lecithin khác nhau trong cùng
Từ hình 3.3, 3.4, 3.5, 3.6 cho thấy tại mẫu L5 hệ bền nhất
Đỏnh giỏ mật độ phõn bố và đường kớnh hạt d(àm) của mẫu cực trị L5 thông qua phương pháp DLS
Mật độ phân bố (%) d (àm)
Mẫu d hw (àm) d 95 (àm) d (