Mục lục Câu hỏi 1 Trình bày khái niệm, nguyên lý cơ bản, và phân loại của kỹ thuật sắc ký sử dụng trong phân lập và tinh chế hợp chất thiên nhiên? 2 Câu hỏi 2 Trình bày nguyên lý và các bước thực hiện.
Trang 1Mục lục
Câu hỏi 1: Trình bày khái niệm, nguyên lý cơ bản, và phân loại của kỹ thuật sắc ký sử dụng trong phân lập và tinh chế hợp chất thiên nhiên? 2 Câu hỏi 2: Trình bày nguyên lý và các bước thực hiện sắc ký bản mỏng (SKBM) Lấy
ví dụ kèm hình minh họa 3 Câu hỏi 3: Trình bày nguyên lý, các phương pháp và kỹ thuật chiết xuất dược liệu 5
Trang 2Câu hỏi 1: Trình bày khái niệm, nguyên lý cơ bản, và phân loại của kỹ thuật sắc ký sử dụng trong phân lập và tinh chế hợp chất thiên nhiên?
Khái niệm:
Sắc ký là phương pháp phân lập vật lý mà ở đó các thành phần hóa học của một hỗn hợp được tách ra và được phân bổ trên hai pha, một pha là pha tĩnh (Stationary Phase – SP) còn pha còn lại là pha động (Mobile Phase – MP) di chuyển qua pha tĩnh theo hướng nhất định Sắc ký là một kỹ thuật được sử dụng rộng rãi để phân lập và nhận dạng thành phần hóa học của một hỗn hợp
Nguyên lý cơ bản:
Cho phép các phân tử trong hỗn hợp tự phân phối giữa môi trường tĩnh và môi trường động Quá trình sắc ký xảy ra do sự khác biệt giữa hằng số phân bố của từng thành phần trong mẫu
Phân loại:
- Dựa vào nguyên lý pha động: Sắc ký lỏng (pha động là dạng chất lỏng) và sắc
ký khí (pha động là khí)
- Dựa trên chất liệu pha tĩnh:
+ Sắc ký lớp mỏng (Sắc ký bản mỏng): Pha tĩnh là một lớp mỏng tráng trên bề mặt phẳng của một mô hình bản mỏng có chất liệu bản dạng thủy tinh, nhựa hoặc nhóm
+ Sắc ký giấy: Pha tĩnh là một lớp màng mỏng bằng giấy
+ Sắc ký cột: Nguyên liệu pha tĩnh được hình thành trong một mô hình dạng cột Chất liệu của cột là nhựa, thủy tinh, thép
- Dựa trên lực phân ly
+ Sắc ký hấp phụ
+ Sắc ký phân lớp
+ Sắc ký trao đổi ion
+ Sắc ký lọc gel
Trang 3Câu hỏi 2: Trình bày nguyên lý và các bước thực hiện sắc ký bản mỏng (SKBM) Lấy ví dụ kèm hình minh họa.
Trong sắc ký lớp mỏng, dung dịch chất di chuyển trên một lớp mỏng chất hấp phụ mịn, vô cơ hay hữu cơ, theo một chiều nhất định Trong quá trình di chuyển, mỗi thành phần chuyển dịch với tốc độ khác nhau tùy theo bản chất của chúng và cuối cùng dừng lại ở các vị trí khác nhau Chất hấp phụ thường được
sử dụng trong sắc ký lớp mỏng là silicagel tráng trên đế nhôm hay đế thủy tinh Trong quá trình hấp phụ, sẽ xảy ra sự tranh giành giữa dung môi và chất tan để chiếm chỗ trên bề mặt chất hấp phụ, và khi đạt được cân bằng, mỗi chất tan sẽ ở một vị trí khác nhau trên bản mỏng Để tiến hành sắc ký, chất tan được chấm lên bản thành từng vết chấm nhỏ, sấy cho dung môi bay hơi hết rồi triển khai với hệ dung môi thích hợp trong một bình triển khai kín Để kiểm tra vết chất có thể sử dụng thuốc thử hiện màu hoặc soi bằng đèn UV Thuốc thử hiện màu có thể là dung dịch sulfuric acid 10%, thuốc thử ceri sulphate
Các bước triển khai sắc ký bản mỏng
- Chuẩn bị mẫu: hòa tan hoàn toàn mẫu với dung môi
- Chuẩn bị bản mỏng: cắt các bản có chiều cao 5 cm và chiều dài phù hợp với lượng mẫu Dùng bút chì để kẻ đường xuất phát trên bản mỏng (đường xuất phát nên cách đáy bản mỏng khoảng 2 cm)
- Chuẩn bị hệ dung môi: pha hệ dung môi với lượng đủ để sử dụng cho thí nghiệm và đảm bảo tỷ lệ các dung môi thành phần giống như điều kiện đã khảo sát
- Đưa chất lên bản mỏng: sử dụng ống mao quản để hút và đưa chất lên bản mỏng theo đường xuất phát một cách đồng đều Chú ý để trống khoảng 0,5 – 1
cm ở mỗi bên lề của bản mỏng
Trang 4- Triển khai bản mỏng: đổ dung môi vào bình triển khai, đồng thời dựng một mảnh giấy lọc đã thấm ướt bằng dung môi triển khai để bão hòa hơi dung môi trong bình Cẩn thận đưa bản mỏng vào bình Lưu ý, không đổ dung môi cao hơn điểm thấp nhất của lớp chất trên bản mỏng Để dung môi từ từ thẩm thấu và
đi lên gần tới đỉnh bản mỏng Nhấc bản mỏng khỏi bình và sấy khô
- Soi kết quả dưới ánh sáng UV254 hoặc 365 nm, đánh dấu những vị trí hiện màu dưới UV
- Nhúng bản mỏng vào thuốc thử, sấy nóng để hiện màu các vết chất trên bản mỏng
Trang 5Hình 1 Hình ảnh bản mỏng sau khi triển khai với hệ dung môi dichloromethane : methanol = 10:1, v:v khi (A) soi dưới đèn UV254 nm và khi (B) hiện màu với thuốc thử Vanilin
Trang 6Câu hỏi 3: Trình bày nguyên lý, các phương pháp và kỹ thuật chiết xuất dược liệu.
Khi chiết xuất, quá trình chiết xuất xảy ra chủ yếu ở hai khu vực: bên trong nguyên liệu và giữa các lớp dung môi Trong đó, quá trình xảy ra bên trong nguyên liệu có ảnh hưởng quyết định và phụ thuộc vào bản chất nguyên
liệu (cấu trúc, tính chất lý hoá ) Các phương pháp chiết xuất thường chỉ tác
động đến các yếu tố bên ngoài, nhằm đạt được hiệu quả chiết xuất cao trong thời gian ngắn đối với mỗi loại nguyên liệu Dưới đây là một số phương pháp thường gặp
1 Phương pháp chiết xuất gián đoạn
a Phương pháp ngâm
Phương pháp ngâm là phương pháp đơn giản nhất và đã có từ thời cổ xưa
• Tiến hành:
Sau khi chuẩn bị dược liệu, người ta đổ dung môi cho ngập dược liệu trong bình chiết xuất, sau một thời gian ngâm nhất định (qui định riêng cho từng loại dược liệu), rút lấy dịch chiết (lọc hoặc gạn) và rửa dược liệu bằng một lượng dung môi thích hợp Để tăng cường hiệu quả chiết xuất, có thể tiến hành khuấy trộn bằng cánh khuấy hoặc rút dịch chiết ở dưới rồi lại đổ lên trên (tuần hoàn cưỡng bức dung môi)
Có nhiều cách ngâm: Có thể ngâm tĩnh hoặc ngâm động, ngâm nóng hoặc ngâm lạnh, ngâm một lần hoặc nhiều lần (còn gọi là ngâm phân đoạn hay ngâm nhiều mẻ)
• Ưu điểm:
Trang 7• Nhược điểm:
– Nhược điểm chung của phương pháp chiết xuất gián đoạn: năng suất thấp, thao tác thủ công (giai đoạn tháo bã và nạp liệu)
– Nếu chỉ chiết một lần thì không chiết kiệt được hoạt chất trong dược liệu – Nếu chiết nhiều lần thì dịch chiết loãng, tốn dung môi, tốn thời gian chiết
b Phương pháp ngấm kiệt
• Tiến hành:
Sau khi chuẩn bị dược liệu, ngâm dược liệu vào dung môi trong bình ngấm kiệt Sau một khoảng thời gian xác định (tuỳ từng loại dược liệu), rút nhỏ giọt dịch chiết ở phía dưới, đồng thời bổ sung thêm dung môi ở phía trên bằng cách cho dung môi chảy rất chậm và liên tục qua lớp dược liệu nằm yên (không được khuấy trộn) Lớp dung môi trong bình chiết thường được để ngập bề mặt dược liệu khoảng 3 – 4 cm
– Ngấm kiệt đơn giản: Là phương pháp ngấm kiệt luôn sử dụng dung môi mới
để chiết đến kiệt hoạt chất trong dược liệu
– Ngấm kiệt phân đoạn (tái ngấm kiệt): Là phương pháp ngấm kiệt có sử dụng dịch chiết loãng để chiết mẻ mới (dược liệu mới) hoặc để chiết các mẻ có mức độ chiết kiệt khác nhau
• Ưu điểm:
– Dược liệu được chiết kiệt
– Tiết kiệm được dung môi (tái ngấm kiệt)
• Nhược điểm:
– Có nhược điểm chung của phương pháp chiết xuất gián đoạn: năng suất thấp, lao động thủ công
Trang 8– Cách tiến hành phức tạp hơn so với phương pháp ngâm.
– Tốn dung môi (ngấm kiệt đơn giản)
2 Phương pháp chiết xuất bán liên tục
(Còn gọi là phương pháp chiết xuất nhiều bậc, phương pháp chiết ngược dòng tương đối hay phương pháp chiết ngược dòng gián đoạn).
Phương pháp này có sử dụng một hệ thống thiết bị gồm nhiều bình chiết khác nhau, có thể mắc thành một dãy từ 4-16 bình chiết nối tiếp nhau ở đây, quá trình coi như là ngược chiều tương đối vì thực tế dược liệu không chuyển động
• Tiến hành:
Lúc đầu, dược liệu và dung môi được nạp vào trong tất cả các thiết bị, dược liệu được ngâm vào dung môi trong một khoảng thời gian xác định (tuỳ thuộc vào dược liệu và dung môi) Lúc này dược liệu và dung môi đều không chuyển động Sau đó dịch chiết được chuyển tuần tự từ thiết bị này sang thiết bị khác
Hệ thống tổ hợp kín các bình chiết này cho phép đóng ngắt một cách có chu kỳ một trong những thiết bị ra khỏi hệ thống tuần hoàn, cho phép tháo bã dược liệu
ở bình đã được chiết kiệt rồi nạp dược liệu mới Sau đó, thiết bị này lại được đưa vào hệ thống tuần hoàn và dịch chiết đậm đặc nhất được dẫn qua nó mà dịch chiết này vừa đi qua tất cả các thiết bị còn lại Tiếp theo, lại đóng ngắt một thiết
bị kế tiếp mà trước đó dung môi mới vừa được dẫn qua Số thiết bị càng nhiều thì quá trình xảy ra càng gần với quá trình liên tục ở đây, bã dược liệu trước khi
ra khỏi hệ thống thiết bị sẽ được tiếp xúc với dung môi mới nên dược liệu sẽ được chiết kiệt Dịch chiết trước khi ra khỏi hệ thống sẽ được tiếp xúc với dược liệu mới nên dịch chiết thu được sẽ đậm đặc nhất Như vậy có thể nói quá trình xảy ra theo nguyên tắc: “dung môi mới tiếp xúc với dược liệu cũ và dược liệu mới tiếp xúc với dung môi cũ” Trong phương pháp này, quá trình xảy ra gần với
Trang 9quá trình ngược chiều, do đó phương pháp này còn được gọi là phương pháp chiết ngược chiều tương đối
• Ưu điểm (so với phương pháp chiết gián đoạn)
– Dịch chiết đậm đặc
– Dược liệu được chiết kiệt
• Nhược điểm:
– Hệ thống thiết bị cồng kềnh, chiếm nhiều diện tích lắp đặt
– Vận hành phức tạp
– Thao tác thủ công
– Không tự động hoá quá trình được
3 Phương pháp chiết xuất liên tục
• Tiến hành:
Phương pháp này được thực hiện trong những thiết bị làm việc liên tục ở đây dược liệuvà dung môi liên tục được đưa vào và chuyển động ngược chiều nhau trong thiết bị Dược liệu di chuyển được trong thiết bị là nhờ những cơ cấu vận chuyển chuyên dùng khác nhau Dịch chiết trước khi ra khỏi thiết bị được tiếp xúc với dược liệu mới nên dịch chiết thu được đậm đặc Bã dược liệu trước khi ra khỏi thiết bị được tiếp xúc với dung môi mới nên bã dược liệu được chiết kiệt
So với phương pháp chiết gián đoạn thì phương pháp chiết liên tục có những ưu nhược điểm sau:
• Ưu điểm:
– Năng suất làm việc cao, tiết kiệm thời gian chiết
– Không phải lao động thủ công (tháo bã, nạp liệu)
Trang 10– Dịch chiết thu được đậm đặc.
– Dược liệu được chiết kiệt
– Dung môi ít tốn kém
– Có thể tự động hoá, cơ giới hoá được quá trình
• Nhược điểm:
– Thiết bị có cấu tạo phức tạp, đắt tiền
– Vận hành phức tạp