Một số phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa

MỤC LỤC MỤC LỤC 1 LỜI MỞ ĐẦU 2 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VỀ GỐC TỰ DO VÀ CÁC CHẤT CHỐNG OXI HÓA 3 1 1 Gốc tự do và các con đường hình thành gốc tự do trong cơ thể 3 1 2 Các chất chống oxi hóa 5 CHƯƠNG 2 MỘT.

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU

Các chất chống oxi hóa đã và đang là mục tiêu của rất nhiều công trình nghiên cứu trên các lĩnh vực hợp chất tự nhiên, y dược học và thực phẩm…trong nhiều năm trở lại đây Rất nhiều công trình liên quan tới tìm kiếm và đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của các hợp chất đã được công bố Cho tới nay đã có rất

nhiều phương pháp in vitro được sử dụng để đánh giá khả năng chống oxi hóa,

chủ yếu liên quan tới khả năng quét các gốc tự do như 2′-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonate (ABTS·+), 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH·), peroxyl (ROO·), superoxide (O2·-), hydrogen peroxide (H2O2), hydroxyl (OH·), singlet oxygen (1O2), nitric oxide (NO·), hoặc một số phương pháp khác như Fe3+–Fe2+, (Cu2+), Folin–Ciocalteu (FCR)… Hoạt tính chống oxi

hóa cũng được nghiên cứu trên các mô hình in vivo như phương pháp đo khả

năng khử hóa ion sắt trong huyết tương, khử hóa glutathione, hay nghiên cứu trên một số loại enzyme khác như glutathione peroxidase, superoxide dismutase, γ-glutamyl transpeptidase…

Bài tiểu luận này sẽ giới thiệu về các gốc tự do, các chất chống oxi hóa cũng như tóm tắt một số phương pháp thử hoạt tính chống gốc tự do đang được

sử dụng hiện nay

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VỀ GỐC TỰ DO VÀ CÁC CHẤT

CHỐNG OXI HÓA 1.1 Gốc tự do và các con đường hình thành gốc tự do trong cơ thể

Gốc tự do là các phân tử, nguyên tử hay ion chứa các electron chưa liên kết, có tính hoạt động hóa học mạnh Sự tồn tại của các gốc tự do trong cơ thể

có thể gây nên mất cân bằng oxi hóa (oxidative stress) Có thể chia chúng thành

ba loại chính là gốc tự do chứa oxy (ROS), gốc tự do chứa nitơ (RNS) và gốc tự

do chứa lưu huỳnh (RSS), trong đó, ROS là loại phổ biến nhất ROS gồm nhiều loại khác nhau, có thể kể đến như peroxyl (LOO·), superoxide (O2·-), hydrogen peroxide (H2O2), hydroxyl (OH·), singlet oxygen (1O2), hypochlorous acid (HOCl) và peroxynitrite (ONOO-) RNS phổ biến nhất là các nitrogen oxide (NO2·, NO+, NO·), có thể phản ứng với oxy để tạo ra ONOO- Các RSS thường gặp là RS· được tạo ra chủ yếu bởi phản ứng của các ROS với các hợp chất thiol [1]

Các gốc tự do ROS được hình thành và chuyển hóa lẫn nhau thông qua ba loại phản ứng chính là phản ứng Haber-Weiss, phản ứng peroxide hóa và phản ứng fenton [1] Theo đó, các gốc superoxide (•O2‒) được tạo ra từ O2 thông qua gốc •OH Superoxide tham gia vào phản ứng Haber-Weiss với xúc tác enzyme superoxide dismutase sẽ sản sinh H2O2, rồi từ đó tham gia vào các quá trình hình thành một loạt gốc tự do như hydroxyl •OH, OH‒ hoặc Fe2+ Bên cạnh đó, gốc superoxide cũng phản ứng với các lipid để tạo thành các gốc tự do lipid (L•) hoặc peroxide (LOO•) Các quá trình này được tóm tắt trong hình 1

Trong cơ thể, các gốc tự do tham gia vào nhiều phản ứng khác nhau, bao gồm:

- Phản ứng cho nhận điện tử

•OH + RS  OH‒ + RS•

- Phản ứng loại hydro

•CCl3 + RH  CHCl3 + R•

- Phản ưng cộng hợp

•CCl3 + CH2=CH2  CH2(CCl3)-CH2

- Phản ứng tự hủy

•CCl3 + •CCl3  C2Cl6

- Phản ứng không cân xứng

CH3-CH2• + CH3-CH2•  CH2=CH2 + CH3-CH3

Hình 1: Sự hình thành các gốc tự do ROS qua các phản ứng khác nhau

Về tác động sinh học, các gốc •OH có khả năng phản ứng dễ dàng với các phân tử lân cận để trở thành dạng nhóm -OH trung hòa Theo Diplock và các cộng sự [2], các gốc •OH sinh ra chủ yếu bởi hoạt động của hệ miễn dịch, có thời gian bán hủy rất ngắn cỡ 10-9 s Trong khi đó, các gốc peroxyl có thời gian tồn tại lâu hơn, tham gia vào quá trình tạo thành các peroxide của lipid bằng cách thay thế các nguyên tử Hydro trong các chất béo no [3] Một gốc tự do oxi khác là H2O2 được hình thành trong cơ thể sống và dễ dàng chuyển hóa sang các dạng khác trong các phản ứng đã đề cập trong hình 1 Bên cạnh đó, singlet oxygen 1O2 cũng được coi là một ROS mặc dù nó là một phân tử thay vì gốc tự

do Singlet oxygen liên quan mật thiết tới sự phá hủy tế bào da do tia UV [4] Đối với các gốc chứa nitrogen, NO• được sinh ra từ chuyển hóa arginine do enzyme và liên quan tới sự bào mòn thành mạch máu, gây bệnh huyết áp thấp

Sự dư thừa NO• có thể sinh ra độc tố hoặc chuyển hóa thành peroxinitrite ONOO- [5] Các gốc ONOO- gây phá hủy các protein và DNA, đồng thời, tham gia trực tiếp vào phản ứng oxi hóa các gốc giàu điện tử như sulfhydryls, kẽm thiolates, iron-sulphur… [6]

Các phản ứng gây ra bởi các gốc tự do liên quan tới rất nhiều bệnh lý nguy hiểm như ung thư, đột quỵ, cao huyết áp, suy giảm chức năng gan, thận, hô hấp, tuần hoàn, thấp khớp, viêm nhiễm, tiểu đường, Alzheimer, Parkinson, Huntingtons, viêm loét dạ dày…[1]

1.2 Các chất chống oxi hóa

Ban đầu, các chất chống oxi hóa được định nghĩa là những chất có khả năng ngăn ngừa hoặc làm giảm quá trình oxi hóa ở nồng độ thấp [7] Về sau, định nghĩa được mở rộng cho tất cả những có khả năng ức chế quá trình oxi hóa trên những đích phân tử và những chất có khả năng quét gốc tự do ROS Hoạt tính chống oxi hóa có thể được biểu hiện qua các quá trình như ức chế quá trình hình thành các gốc ROS, ức chế chuỗi phản ứng sinh ra bởi ROS, giảm sự tạo thành các lipid peroxide, loại trừ các singlet oxygen, hoặc làm chuyển hóa hydropeoxide thành dạng bền vững, hoặc ức chế các pro-oxidative enzyme (lipooxigenase) [8-12]

Có thể phân chia các chất chống oxi hóa thành hai nhóm chính là các enzyme và các chất không phải enzyme, như tóm tắt trong hình 2 [1] Theo đó, các hợp chất enzyme có thể chia thành hai nhóm lớn là enzyme sơ cấp, gồm có glutathione peroxidase, catalase, và superoxide dismutase, với chức năng chính

là ngăn ngừa sự hình thành hoặc trung hòa các gốc tự do Nhóm thứ cấp bao gồm các enzyme ngăn ngừa quá trình oxi hóa các phân tử gây bởi các gốc tự do, chẳng hạn glutathione reductase khử dạng oxi hóa của glutathione, một chất oxi hóa nội sinh, qua đó hoàn nguyên hợp chất này tham gia vào quá trình trung hòa gốc tự do; hoặc glucose-6-phosphate dehydrogenase tái tạo NADPH trong các quá trình khử hóa của cơ thể Các enzyme này không tham gia trực tiếp vào quá

trình trung hòa gốc tự do nhưng đóng vai trò hỗ trợ cho các hợp chất chống oxi hóa nội sinh

Trong khi đó, các hợp chất chống oxi hóa thuộc nhóm không enzyme rất đa dạng về thành phần, cấu trúc Có thể kể tới một số nhóm điển hình như Vitamin

và dẫn xuất, các coenzyme, chất khoáng, các hợp chất hữu cơ chứa lưu huỳnh, các phenolic và flavonoids Các hợp chất này có thể được nội sinh trong cơ thể hoặc chứa trong các loại thực phẩm hay dược liệu, có tác dụng trung hòa các gốc

tự do cũng như bảo vệ sự tấn công của các gốc tự do đến các cơ quan trong cơ thể Các hợp chất này tác động tới các đích khác nhau trong cơ thể theo các cơ chế riêng biệt Do đó, hoạt tính chống oxi hóa của các hợp chất cũng được đánh giá theo nhiều phương pháp khác nhau

CHƯƠNG 2 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH

CHỐNG OXI HÓA

Do sự đa dạng của các gốc tự do cũng như các cơ chế tác động, hoạt tính chống oxi hóa của một hợp chất không thể được đánh giá bởi duy nhất một phép

thử Đã có rất nhiều phương pháp thử hoạt tính chống oxi hóa in vitro và in vivo

được phát triển với nhiều cách tiếp cận khác nhau trong cách thức thử nghiệm Chương này sẽ giới thiệu về một số phương pháp thử hoạt tính chống oxi hóa phổ biến trong thực nghiệm

2.1 Các phương pháp in vitro

2.1.1. Phương pháp DPPH

Phân tử 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là một gốc tự do bền, có màu tím, hấp thụ UV cực đại ở 517 nm Khi có mặt chất chống oxi hóa AH, DPPH bị khử thành 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine (DPPH-H) có màu vàng

Hình 3 Phản ứng của DPPH với chất khử AH

Hoạt độ quét gốc tự do DPPH được đánh giá bằng cách so sánh mật độ quang của dung dịch DPPH trước và sau khi cho mẫu thử ở 517 nm [13] Công thức tính như sau:

% ức chế DPPH = [(Abr-Aar)/Abr] ×100

Với Abr và Aar lần lượt là mật độ quang trước và sau phản ứng

2.1.2. Phương pháp H2O2

Cơ thể người hấp thu H2O2 do hít phải khói sương hoặc bụi hoặc do tiếp xúc với mắt và da H2O2 sau đó bị phân hủy thành oxy và nước nhưng một lượng nhất định có thể tạo thành gốc tự do •OH, gây ra sự peoxide hóa lipid và phá hủy DNA Khả năng quét dọn gốc tự do H2O2 được đánh giá thông qua phương pháp được đề xuất bởi Ruch và cộng sự [14], theo đó, dung dịch H2O2 ở nồng độ

40 mM được pha trong đệm phosphate (pH 7,4) phản ứng với dung dịch chất

thử có nồng độ xác định Đo mật độ quang ở bước sóng 230 nm trước và sau khi phản ứng xảy ra sau khi trừ đi mật độ quang của dung dịch trống không chứa

H2O2 để tính hoạt lực quét dọn gốc H2O2 của chất thử

% ức chế H2O2 = [(Ai-At)/Ai] ×100

Với Ai và At là mật độ quang của dung dịch chứa H2O2 trước và sau khi thêm chất thử

2.1.3. Phương pháp nitric oxide

Hợp chất natri nitroprusside khi bị phân hủy ở pH 7,2 sẽ sinh ra gốc tự do

•NO Trong điều kiện hiếu khí, gốc nitric oxide phản ứng với oxy tạo thành nitrate hoặc nitrite và có thể định lượng qua phản ứng Griess [15] 2 ml dung dịch natri nitroprusside hòa tan trong 0,5 ml đệm phosphate (pH 7,4) được trộn với 0,5 ml mẫu ở nồng độ 0,2 đến 0,8 mg/ml Hỗn hợp được ủ ở 25oC trong 150 phút, sau đó hút 0,5 ml hỗn hợp trộn với 0,5 ml thuốc thử Griess, ủ thêm 30 phút

ở cùng nhiệt độ rồi đo mật độ quang ở 546 nm

% ức chế H2O2 = [(Ai-At)/Ai] ×100

Với Ai và At là mật độ quang của dung dịch natri nitroprusside trước và sau khi thêm chất thử khi trộn với thuốc thử Griess ở 548 nm

Hình 4 Phản ứng của thuốc thử Griess với các sản phẩm của gốc tự do

•NO

2.1.4. Phương pháp peroxynitrite

Peoxynitrite (ONOO•) là một gốc tự do gây độc tế bào, peoxide hóa lipid, cũng như gây các bệnh về tuần hoàn và lão hóa Phương pháp đánh giá khả năng

ức chế gốc tự do peoxynitrite được Kooy giới thiệu vào năm 1994 [16] dựa trên phản ứng của dihydroxyrhodamine 123 (DHR 123, 5 mM) trong dimethylformamide (DMF) với NaCl 90 mM, KCl 5mM, và diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) 100 mM Hoạt tính quét dọn gốc ONOO• qua phản ứng oxi hóa DHR 123 và được phát hiện ở các bước sóng 485

nm và 530 nm

2.1.5. Phương pháp ABTS

Phương pháp ABTS dựa trên sự mất màu của gốc tự do ABTS•+ (2,2-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)) khi phản ứng với chất chống oxi hóa Khi bị khử, gốc tự do ABTS•+ màu xanh chuyển thành dạng ABTS và mất màu ABTS•+ là gốc tự do bền nhưng không tồn tại trong cơ thể người Quy trình thử nghiệm trên ABTS được giới thiệu bởi Seeram và cộng sự năm 2006 [17] ABTS•+ được tạo ra bằng cách thêm mangan dioxide vào dung dịch ABTS

5 mM trong đệm Na/K pH 7 Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchroman-2-carboxylic acid), một hợp chất tương tự vitamin E, được sử dụng là chất chuẩn Dung dịch mẫu thử đươc pha trong đệm Na/K pH 7 rồi trộn với dung dịch ABTS•+ và đo mật độ quang ở 750 nm Khả năng oxi hóa của chất thử sẽ được tính tương đương với nồng độ trolox tính theo mM

2.1.6. Phương pháp superoxide (SOD)

Hoạt tính ức chế anion superoxide (SOD) được mô tả bởi Robak và Gryglewski năm 1988 [18] Gốc tự do SOD được tạo ra bằng cách cho nitroblue tetrazolium (NBT) phản ứng với NADH trong đệm Tris-HCl (pH 8.0) Chất thử nghiệm được hòa trong đệm Tris-HCl rồi thêm vào dung dịch chứa gốc SOD, sau đó thêm phenazine methosulfate vào để cân bằng phản ứng Ủ hỗn hợp ở

25oC trong 5 phút rồi đo mật độ quang ở 560 nm

2.1.7. Phương pháp OH

Hoạt tính ức chế gốc tự do hydroxyl (OH) được tiến hành theo phương pháp của Kunchandy (1990) [19] Hỗn hợp phản ứng bao gồm 100 μl 2-deoxy dribose (28 mM trong 20 mM KH2PO4-KOH buffer, pH 7.4), 500 μl chất phản ứng, 200 μl hỗn hợp EDTA (1.04 mM) và FeCl3 200 μM, 100 μl H2O2 (1 mM)

và 100 μl ascorbic acid được ủ ở 37oC trong 1 giờ Sau đó, thêm vào hỗn hợp này 1 ml trichloroacetic acid 2,8% và 1 ml thiobarbituric acid 1% rổi ủ hỗn hợp

ở 100oC trong 20 phút trước khi làm nguội và đo mật độ quang ở 532 nm

2.1.8. Phương pháp diene liên hợp

Đây là một phương pháp đánh giá nhanh hoạt độ chống oxi hóa, dựa trên phản ứng của linoleic acid, một acid béo không no, với gốc tự do ROS Sản phẩm tạo thành sẽ phản ứng làm mất màu carotene [20] Cụ thể, 0.5 mg β-carotene trong 1 ml chloroform được thêm vào 25 μl linoleic acid và thêm vào

200 mg tween-80 Cất loại hoàn toàn chloroform sau đó thêm 100 ml nước cất bão hòa oxy tạo thành một hỗn dịch Các hỗn dịch này sẽ được thêm vào các dung dịch chất thử ở các nồng độ khác nhau rồi đo mật độ quang ở các thời điểm

từ 0 đến 2 giờ sau khi ủ ở 50oC Vitamin C có thể được sử dụng làm chất chuẩn Phần trăm ức chế (I%) có thể tính theo công thức

I% = [1-(As – As120)/(Ac-Ac120)]

Trong đó, As là mật độ quang của mẫu thử tại thời điểm ban đầu, As120 là mật độ quang của mẫu thử sau 2h, Ac và Ac120 là mật độ quang của dung dịch vitamin C tại thời điểm 0 và 2 giờ

2.2 Các phương pháp in vivo

2.2.1. Đánh giá khả năng khử ion sắt trong huyết tương

Đây là một trong những phương pháp nhanh chóng và hiệu quả nhất trong thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa, theo đó, hoạt độ chống oxi hóa được đánh giá thông qua sự tăng hàm lượng ion sắt theo phản ứng FRAP giữa TPTZ (2,4,6-tripyridyl-s-triazine) và FeCl2.6H2O Mật độ quang được đo ở 593 nm Nội dung phương pháp được Benzie và Strain giới thiệu và năm 1996 [21], sử dụng máu của chuột được tách lấy huyết tương 3 ml FRAP (gồm 1 ml 2,4,6 tripyridyl-s-triazine (TPTZ) 10 mM trong HCl 40 mM, 1 mL FeCl2 20 mM, 10 mL đệm acetate (pH 3.6)) được trộn với 375 μl nước cất và 25 μl chất thử Phần hữu cơ được tách ra và đo mật độ quang ở 593 nm

2.2.2. Đánh giá hoạt tính khử của glutathione (GSH)

GSH là một chất khử hóa nội sinh trong phân tử, có vai trò xúc tác, chuyển hóa và vận chuyển, giúp bảo vệ tế bào khỏi các gốc tự do, các peroxide hoặc các chất độc hại khác Trong tuyến thận, GSH cũng đóng vai trò là một chất vận chuyển quan trọng, kích thích tái hấp thu các acid amin [22] Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxi hóa thông qua GSH được tiến hành như sau: lấy mô được bảo quản trong đệm phosphate 100 mM, pH 7.4, rồi thêm một lượng trichloroacetic acid (TCA) chứa 1mM EDTA để kết tủa hết protein Hỗn hợp sau

đó được li tâm, thu lại phần dịch, đem phả ứng với tác nhân Ellman (5,5′-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (0.1 mM) trong đệm phosphate 300 mM và dung

dịch natri citrate 1%) Dung dịch được pha loãng tới thể tích xác định rồi đo ở bước sóng 412 nm Mật độ quang được so sánh với mẫu chuẩn chứa GSH

2.2.3. Phương pháp glutathione-S-transferase (GSt)

GSt đóng vai trò quan trọng trong phản ứng khử độc cho các tác nhân alkyl hóa, chẳng hạn các dược chất, xúc tác cho phản ứng với các hợp chất chứa nhóm –SH và tạo ra các sản phẩm tan trong nước Hoạt tính chống oxi hóa thông qua GSt được tiến hành theo phương pháp của Jocelyn [23], theo đó, hỗn hợp phản ứng bao gồm kali phosphate 0.1 N, GSt 1 nM, l-chloro-2, 4-dinitrobenzene 1M được sử dụng làm cơ chất và một lượng thích hợp cytosol 6 mg/ml Phản ứng được ủ ở 37oC trong 5 phút và phản ứng được cân bằng bởi cơ chất Sự tăng mật

độ quang của phản ứng được đo ở 340 nm

2.2.4. Phương pháp superoxide dismutase (SOD)

Phương pháp này được thử nghiệm trên hồng cầu, được thêm vào đệm Tris-HCl (pH 8,2), 30 mM EDTA và 2 mM pyrogallol Sự gia tăng mật độ quang ở

420 nm được ghi lại trong 3 phút Một đơn vị hoạt độ enzyme tương đương 50%

tỷ lệ ức chế quá trình oxi hóa của pyrogallol và được phát hiện do sự thay đổi mật độ quang Hoạt tính SOD được biểu diễn với thứ nguyên là ″đơn vị enzyme/mg protein″ [24]

2.2.5. Phương pháp catalase (CAT)

Phương pháp đánh giá hoạt tính của CAT có thể tiến hành trên hồng cầu theo phương pháp Aebi [25] 50 μl hồng cầu được thêm vào 2 ml đệm phosphate

pH 7,0 và 1ml H2O2 30 mM Hoạt tính catalase được đo ở 240 nm trong 1 phút bằng máy đo quang Một đơn vị hoạt độ được tính tương đương với sự phân hủy

1 mmol H2O2 trong một phút

2.2.6. Phương pháp LDL

LDL được rửa sạch và thẩm tách bằng dung dịch NaCl 150 mM và

Na2EDTA 1 mM (pH 7,4) ở 4oC, rồi được lọc lại và bảo quản trong khí nitrogen

ở 4oC trong bóng tối Dung dịch LDL (100 μg/ml) được ủ trong 10 phút ở nhiệt

độ phòng với mẫu thử, sau đó, thêm vào dung dịch CuSO4 5 μM và ủ trong 2 giờ

ở 37oC Sự oxi hóa Cu2+ được dừng lại bằng cách thêm dung dịch butylated hydroxytoluene (BHT, 10 μM) Sau khi ủ, hoạt độ oxi hóa LDL được đo bằng