Nội dung nghiên cứu của đề tài là phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, loại bỏ N và tích lũy poly-P trong nước thải hủ tiếu. Nhận diện và tìm hiểu quan hệ phát sinh của các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, loại bỏ N và tích lũy poly-P trong nước thải hủ tiếu có các đặc tính tốt bằng phương pháp sinh học phân tử và công cụ Tin Sinh học kết hợp với một số mô tả hình thái tế bào và khuẩn lạc đã có.
Giới thiệu
Đặt vấn đề
Gạo là nguồn lương thực chủ yếu ở châu Á, từ đó sản xuất nhiều sản phẩm khác nhau, trong đó có hủ tiếu Quy trình sản xuất hủ tiếu bắt đầu bằng việc ngâm gạo trong 24 giờ, sau đó rửa sạch và xay thành bột Bột được ủ trong 48 giờ, sau đó luộc và tráng trên các vĩ mỏng, phơi khô và cắt thành sợi Hủ tiếu thành phẩm thường được kết hợp với rau củ, thịt và nước súp nấu từ xương heo, đặc biệt nổi tiếng ở Mỹ Tho, Tiền Giang.
Hầu hết các cơ sở sản xuất hủ tiếu hiện nay chưa có hệ thống xử lý nước thải đạt tiêu chuẩn, dẫn đến việc xả thải trực tiếp ra môi trường Nhu cầu nước lớn trong quá trình sản xuất nông sản thực phẩm khiến nước thải không được xử lý, gây ô nhiễm nghiêm trọng cho nguồn nước sông, rạch Tại Mỹ Tho - Tiền Giang, các cơ sở sản xuất thường mang tính tự phát và nhỏ lẻ, không chú trọng đến việc bảo vệ môi trường Hậu quả là nhiều sông ngòi, kênh rạch bị ô nhiễm nặng nề, ảnh hưởng đến sinh vật và sức khỏe của người dân sống xung quanh.
Nhận thấy tiềm năng của các nhóm vi khuẩn kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa đạm và vi khuẩn tích lũy poly-P trong xử lý nước thải, việc tìm kiếm biện pháp xử lý nước thải hủ tiếu là cấp bách nhằm bảo vệ môi trường và danh tiếng ẩm thực Việt Nam, đặc biệt là danh hiệu 50 năm của hủ tiếu Mỹ Tho Do đó, nghiên cứu “Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn kết tụ sinh học, chuyển hóa nitơ và tích lũy Poly-P trong nước thải sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho và ứng dụng xử lý nước thải” là cần thiết và có tính ứng dụng cao để giải quyết những thách thức này.
Mục tiêu của nghiên cứu
Phân lập, tuyển chọn và ứng dụng các vi khuẩn khả năng xử lý nước thải từ các cơ sở sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho.
Đối tượng nghiên cứu
Các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, loại bỏ N (nitơ) và tích lũy poly-P trong nước thải hủ tiếu.
Thời gian và địa điểm thu mẫu
Thời gian: Từ tháng 2 năm 2016 đến tháng 8 năm 2018 Địa điểm thu mẫu: tại 08 cơ sở sản xuất hủ tiếu tại xã Mỹ Phong, Thành phố
Mỹ Tho, tỉnh Tiền Giang.
Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu bao gồm các nội dung:
- Phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, loại bỏ N và tích lũy poly-P trong nước thải hủ tiếu
Nhận diện và nghiên cứu quan hệ phát sinh của các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học có khả năng loại bỏ nitrogen (N) và tích lũy poly-phosphate (poly-P) trong nước thải hủ tiếu Sử dụng phương pháp sinh học phân tử và công cụ tin sinh học, kết hợp với mô tả hình thái tế bào và khuẩn lạc đã được xác định trước đó.
Tuyển chọn các dòng vi sinh vật có khả năng kết tụ sinh học, loại bỏ nitơ (N) và tích lũy poly-phosphate (poly-P) trong nước thải hủ tiếu nhằm đánh giá hiệu quả xử lý nước thải này trong các thùng hoặc bể chứa với dung tích 100 mL, 1-L, 10-L và 100-L.
Đóng góp mới và ý nghĩa của luận án
Nghiên cứu đã thu thập được 109 dòng vi khuẩn với các khả năng khác nhau, bao gồm 42 dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, trong đó có 23 dòng vi khuẩn kết tụ protein và 19 dòng vi khuẩn kết tụ polysaccharide Ngoài ra, nghiên cứu cũng xác định 59 dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ, gồm 15 dòng chuyển hóa ammonium, 18 dòng chuyển hóa nitrate, 15 dòng chuyển hóa nitrite, và 11 dòng có khả năng chuyển hóa cả ammonium, nitrite và nitrate Cuối cùng, có 8 dòng vi khuẩn có khả năng tích lũy poly-P.
Kết quả nghiên cứu cho thấy các dòng vi khuẩn thuộc hai nhóm kết tụ sinh học và tích lũy poly-P đều thuộc họ Bacillaceae Trong khi đó, nhóm vi khuẩn chuyển hóa nitơ có sự đa dạng loài hơn, bao gồm cả vi khuẩn Gram âm và Bacillus, với Bacillus chỉ chiếm 12% tổng số dòng vi khuẩn.
Sự phân lập vi khuẩn trong khu vực nhỏ dẫn đến số lượng cá thể không cao và đa dạng hạn chế Tuy nhiên, nhóm vi khuẩn chuyển hóa Nitơ (N) cho thấy sự đa dạng phong phú hơn so với các nhóm vi khuẩn khác.
Phương tiện và phương pháp nghiên cứu
Vật liệu thí nghiệm
3.1.1.1 Môi trường phân lập vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học protein (Nguồn: Hazana et al., 2008)
Bảng 3.1 Môi trường phân lập vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học protein
Agar 20 g (bổ sung khi đổ môi trường thạch)
3.1.1.2 Môi trường phân lập vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học polysaccharide (Nguồn: Deng et al., 2002)
Bảng 3.2 Môi trường phân lập vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học polysaccharide
Agar 20 g (bổ sung khi đổ môi trường thạch)
3.1.1.3 Môi trường phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitơ (Zhao et al., 2010)
Bảng 3.3 Môi trường phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Hóa chất Đơn vị tính
Môi trường bổ sung Nitrite
Môi trường bổ sung Nitrate
Môi trường bổ sung Ammonium
Môi trường bổ sung T (Nitrite, Nitrate,
3.1.1.4 Môi trường phân lập vi khuẩn tích lũy poly-P (Wang et al., 2008)
Bảng 3.4 Môi trường phân lập vi khuẩn tích luỹ poly-P
Dung dịch khoáng vi lượng 0,5 mL/L
3.1.2 Nguyên liệu và vật liệu thí nghiệm
Nước thải hủ tiếu tại xã Mỹ Phong, thành phố Mỹ Tho, tỉnh Tiền Giang cần được xử lý hiệu quả, cùng với các thiết bị phòng thí nghiệm như máy li tâm, nồi hấp tuyệt trùng, tủ lạnh, tủ ấm, tủ sấy và máy cất nước Việc sử dụng loại hóa chất phù hợp và các dụng cụ thí nghiệm khác, cũng như môi trường nuôi cấy vi sinh vật, là cần thiết để đảm bảo an toàn và hiệu quả trong quy trình xử lý nước thải.
Nước thải được thu thập từ 08 cơ sở sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho, với mỗi cơ sở lấy 03 mẫu (mỗi mẫu 10 lít) và chuyển về phòng thí nghiệm để phân tích Sau khi trộn các mẫu lại, thành phần ô nhiễm của nước thải được khảo sát Các mẫu nước thải sau khi đo các chỉ tiêu TSS được bảo quản ở nhiệt độ 4 °C trong tủ lạnh.
Bảng 3.5 Địa điểm 08 cơ sở sản xuất hủ tiếu ở thành phố Mỹ Tho, Tiền Giang được lấy mẫu
Mẫu Chủ cơ sở Địa điểm
1 Đỗ Thị Năm ấp Mỹ Hòa, xã Mỹ Phong
2 Phan Thị Ngọc Thu ấp Mỹ Hòa, xã Mỹ Phong
3 Phạm Hữu Tấn ấp Mỹ Hòa, xã Mỹ Phong
4 Nguyễn Bá Khánh ấp Mỹ Hòa, xã Mỹ Phong
5 Nguyễn Thị Kim Liên ấp Mỹ Hòa, xã Mỹ Phong
6 Nguyễn Văn Thuận ấp Hội Gia, xã Mỹ Phong
7 Nguyễn Văn Tân ấp Hội Gia, xã Mỹ Phong
8 Lê Hữu Khương ấp Hội Gia, xã Mỹ Phong
3.2.2 Đếm mật số vi khuẩn
Mật số vi khuẩn được đếm theo phương pháp đếm sống của Hoben and Somasegaran (1982) dựa vào sự hình thành khuẩn lạc trên môi trường agar như sau (Hình 3.1):
Tiến hành pha loãng mẫu nước thải theo bậc 10 liên tiếp trong ống nghiệm bằng cách trộn đều để vi khuẩn phân bổ đồng nhất Bắt đầu bằng cách hút 1 mL mẫu vào ống nghiệm thứ nhất có 9 mL nước cất vô trùng, tạo ra độ pha loãng 1/10 Tiếp theo, chuyển 1 mL từ ống nghiệm thứ nhất sang ống nghiệm thứ hai cũng chứa 9 mL nước cất vô trùng, đạt độ pha loãng 1/100 Quá trình này tiếp tục để đạt được các nồng độ pha loãng 1/10³, 1/10⁴, và các nồng độ thấp hơn.
Trộn đều mẫu trên máy vortex và sử dụng micropipet để hút 03 lần 20 μL mẫu, sau đó nhỏ giọt lên đĩa petri chia làm 3 ô, mỗi ô nhỏ 03 giọt (20 μL/giọt) tương ứng với nồng độ pha loãng Đảm bảo mỗi giọt nằm trong ô mà không dính nhau Đĩa mẫu đã được nhỏ giọt cần được ủ ở 30 oC trong tủ ủ vi sinh vật trong khoảng thời gian 12 - 24 giờ cho vi khuẩn kết tụ sinh học, 24 - 48 giờ cho vi khuẩn chuyển hóa nitơ, và 48 - 72 giờ cho vi khuẩn tích lũy poly-P, nhằm phát triển vi khuẩn và đếm mật số vi khuẩn.
Dựng micropipet hỳt 50 µL mẫu nước với độ pha loãng thích hợp, sau đó trải lên đĩa môi trường phân lập Sử dụng que trải mẫu để phân phối dịch mẫu đều khắp mặt thạch và ủ trong tủ ủ vi sinh ở nhiệt độ 30°C trong các khoảng thời gian 24 giờ (đối với vi khuẩn kết tụ sinh học), 48 giờ (đối với vi khuẩn chuyển hóa nitơ) và 72 giờ (đối với vi khuẩn tích lũy poly-P).
Để xác định mật số vi khuẩn, tiến hành pha loãng mẫu và đếm sống nhỏ giọt Chọn độ pha loãng có các khuẩn lạc rời và số lượng đủ lớn trong mỗi giọt để thực hiện việc đếm Sau đó, tính số vi khuẩn trung bình theo công thức được đề xuất bởi Nguyễn Đức Lượng và cộng sự (2003).
Mật số vi khuẩn/mL mẫu (CFU/mL) = * D *1000
10 -3 n - Số khuẩn lạc trung bình trong đĩa petri ở một độ pha loãng nhất định v - Thể tích dịch mẫu nuôi cấy (L)
1000 - Hệ số quy đổi từ mL sang L
Khi vi khuẩn hình thành khuẩn lạc, cần chọn các khuẩn lạc rời rạc với hình thái khác nhau trên môi trường phân lập, bao gồm hình dạng, màu sắc, kích thước, bìa và độ nổi Mỗi dạng khuẩn lạc sẽ được cấy chuyển nhiều lần sang môi trường cùng loại cho đến khi thu được các khuẩn lạc ròng.
Trong quá trình phân lập và tách ròng vi khuẩn, cần tách rời từng tế bào và phát triển thành khuẩn lạc độc lập Vi khuẩn được phân lập bằng phương pháp cấy ria, sau đó chọn khuẩn lạc rời và chuyển vào ống chứa môi trường tương tự Ống cấy được ủ ở nhiệt độ 30 độ C trong tủ ủ vi sinh vật để vi khuẩn phát triển, rồi được trữ lạnh chờ kiểm tra độ ròng dưới kính hiển vi Cuối cùng, kiểm tra độ ròng của vi khuẩn phân lập được thực hiện dưới kính hiển vi.
3.2.3.2 Trữ mẫu và mô tả đặc điểm khuẩn lạc của vi khuẩn
Các dòng vi khuẩn đã được cấy vào hai ống môi trường tương tự và ủ ở nhiệt độ 30°C trong tủ ủ vi sinh vật trong khoảng thời gian từ 24 đến 48 giờ để cho vi khuẩn phát triển Sau đó, các ống này được lưu trữ lạnh Đồng thời, các mẫu vi khuẩn cũng được cấy trở lại đĩa môi trường phân lập và tiếp tục ủ.
24 - 48 giờ ở 30ºC để mô tả đặc điểm khuẩn lạc (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002)
Hình 3.2 Mẫu đã kiểm ròng được trữ trong ống nghiệm
3.2.4 Tuyển chọn và nhận diện các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa Nitơ N và vi khuẩn poly-P
Sau khi phân lập các dòng vi khuẩn từ nước thải của các cơ sở sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho, chúng tôi tiến hành tuyển chọn những dòng vi khuẩn có hiệu quả cao Tiếp theo, việc nhận diện các dòng vi khuẩn này được thực hiện để làm cơ sở cho quy trình xử lý nước thải trong tương lai.
* Tuyển chọn các dòng Vi khuẩn kết tụ sinh học trên môi trường protein và polysaccharide
Kiểm tra khả năng kết tụ của chất kết tụ sinh học với dung dịch Kaolin nhằm tuyển chọn dòng vi khuẩn sản xuất kết tụ hiệu quả Mỗi dòng vi khuẩn được nuôi trong 10 mL môi trường lỏng trong ống falcon 50 mL, lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng, trong 01 ngày để phát triển và tạo ra chất kết tụ sinh học.
Để kiểm tra khả năng kết tụ của vi khuẩn, tiến hành lấy 90 mL dung dịch Kaolin (5g/L) và thêm vào 10 mL dung dịch CaCl2 (1%) trong bình tam giác 250 mL Tiếp theo, thêm 0,1 mL dung dịch vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, trong khi mẫu đối chứng thực hiện tương tự nhưng không sử dụng vi khuẩn này Khuấy đều hỗn hợp để đảm bảo sự hòa trộn.
30 giây ở 60 vòng/phút bằng máy lắc, giữ yên hỗn hợp trong 1 giờ, lấy phần trong đo
OD ở độ bước sóng 550 nm
Tỷ lệ kết tụ % = (OD đối chứng – OD mẫu)/OD đối chứng x 100
Kết quả chọn dòng Vi khuẩn kết tụ sinh học tốt nhất được chọn để tiến hành thí nghiệm tiếp theo
Trữ lạnh ở -20 o C để bảo quản DNA
Xác định tỷ lệ kết tụ sinh học
Dòng vi khuẩn kết tụ sinh học protein và polysaccharide tốt nhất được nuôi cấy trong 50 mL môi trường tổng hợp chứa glucose, theo nghiên cứu của Hazana et al (2008).
20 g, L- acid glutamic 50 g, MgSO4.7H2O 0,5 g, Yeast ex 0,5 g và điều chỉnh giá trị pH = 7 trong bình tam giác 100 mL Lắc trên máy lắc xoay vòng ở tốc độ 150 vòng/phút ở nhiệt độ 30 o C
Dung dịch vi khuẩn sau một ngày nuôi cấy được kiểm tra khả năng kết tụ bằng cách sử dụng hỗn hợp gồm 90 mL dung dịch kaolin (5 g/L), 10 mL dung dịch CaCl2 1%, và 100 µL dung dịch vi khuẩn với mật số >10^9 tế bào/mL (tỷ lệ 0,1%) Hỗn hợp này được khuấy đều với tốc độ 60 vòng/phút trong 30 giây, sau đó để yên trong 5 phút Phần dung dịch trong ở trên cách mặt nước 2 cm được lấy để xác định độ đục quang phổ tại bước sóng 550 nm (Deng et al., 2003) Mẫu đối chứng được thực hiện tương tự nhưng không có vi khuẩn, và tỷ lệ kết tụ được tính theo công thức.
Phương pháp này được áp dụng để xác định tỷ lệ kết tụ sinh học tối ưu của dòng vi khuẩn, bao gồm protein và polysaccharide, trong tất cả các thí nghiệm Đồng thời, việc tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả kết tụ sinh học cũng được thực hiện.
Phương pháp nghiên cứu
4.1 Mật số vi khuẩn kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ và vi khuẩn tích lũy poly-P
Từ 08 mẫu nước thải hủ tiếu của 08 cơ sở sản xuất tại Hợp tác xã Hủ tiếu Mỹ Tho (xã Mỹ Phong, thành phố Mỹ Tho, tỉnh Tiền Giang), pH của nước thải và mật số vi khuẩn của 03 loại đếm được trình bày trong Bảng 4.1
Bảng 4.1 pH và mật số 3 nhóm vi khuẩn trong 08 mẫu nước thải hủ tiếu của 08 cơ sở sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho, tỉnh Tiền Giang
Cơ sở sản xuất hủ tiếu
Mật số vi khuẩn trên môi trường tương ứng (log10 CFU/mL) pH
VK chuyển hóa 3 loại Nitơ*
* Tổng hợp 3 loại nitrit, nitrat và ammonium n.s = not significant (không có ý nghĩa thống kê)
Kết quả từ Bảng 4.1 chỉ ra rằng pH của nước thải rất thấp, dao động từ 3.51 đến 4.6, tạo điều kiện không thuận lợi cho vi khuẩn có ích hoạt động, đồng thời làm gia tăng sự phát triển của vi khuẩn kỵ khí, gây ra mùi hôi khó chịu.