Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là nghiên cứu nhằm tìm kiếm và khai thác tiềm năng của các giống vi khuẩn bản địa có khả năng thúc đẩy tăng trưởng cây mía trong lĩnh vực sản xuất phân bón vi sinh, hướng tới một nền nông nghiệp phát triển bền vững.
GIỚI THIỆU
Đặt vấn đề
Mía là cây công nghiệp có giá trị kinh tế cao, được trồng ở hơn 110 quốc gia nhiệt đới và cận nhiệt đới Ngoài sản xuất đường, mía còn cung cấp nhiều sản phẩm quý giá như ethanol, nhựa, và xơ sợi, đặc biệt là nhiên liệu sinh học (Viện Nghiên cứu mía đường, 2020) Do đó, việc duy trì và nâng cao năng suất mía là ưu tiên nghiên cứu của nhiều quốc gia (Mehnaz, 2011) Tổng diện tích trồng mía toàn cầu đã tăng từ 44.000 ha năm 1961 lên 269.434 ha năm 2018.
2003, diện tích trồng mía tăng hơn 300 nghìn ha Tuy nhiên, trong những năm gần đây diện tích trồng mía đường có phần giảm nhẹ (FAOSTAT, 2020)
Trong ngành công nghiệp sản xuất đường, đường mía chiếm hơn 60% tổng sản lượng đường thô toàn cầu Tại Việt Nam, nghề trồng mía để sản xuất đường bắt đầu phát triển từ những năm 1990 Nhờ khả năng thích nghi với điều kiện tự nhiên, cây mía có thể được trồng ở nhiều vùng miền trên toàn quốc Năm 2018, năng suất mía bình quân cả nước đạt khoảng 66,6 tấn/ha, với tổng sản lượng lên tới 17.945.204 tấn.
Năm 2018, tổng diện tích trồng mía ở Đông Nam Bộ đạt khoảng 24.494 ha, với Tây Ninh là tỉnh dẫn đầu về diện tích trồng mía, chiếm 14.669 ha (Cục thống kê tỉnh Tây Ninh, 2019; Tổng cục thống kê, 2018) Điều này tạo điều kiện cho Tây Ninh trở thành một vùng mía đường quan trọng cả nước và khu vực.
Hiện nay, nhiều quốc gia, bao gồm Việt Nam, đã áp dụng các phương thức tổ chức sản xuất và cải tiến kỹ thuật như sản xuất tập trung chuyên canh, cải thiện giống mía, hóa học hóa, thủy lợi hóa và cơ giới hóa để tăng năng suất mía Đặc biệt, nghiên cứu khoa học được coi là yếu tố quan trọng Tuy nhiên, theo Thaweenut và cộng sự (2011), ở các nước đang phát triển, việc bón nhiều phân hóa học cho cây mía ở giai đoạn sớm vẫn phổ biến nhằm nâng cao sản lượng và hàm lượng đường Tại Việt Nam, nghiên cứu cho thấy năng suất mía tơ tăng tỷ lệ thuận với lượng phân bón, với lượng phân NPK cần thiết cho 1 ha mía tơ đạt năng suất từ 70 đến 80 tấn là khoảng 180 kg.
Để đạt năng suất 90 – 100 tấn/ha, cần sử dụng lượng phân bón gồm 200 – 250 kg N, 80 – 100 kg P2O5 và 180 – 220 kg K2O Lượng phân bón hoá học có thể thay đổi tùy thuộc vào loại đất và mức độ thâm canh Đối với đất xám cát và đất xám bạc màu có mức độ thâm canh cao, khuyến cáo sử dụng khoảng 200 – 250 kg N, 90 – 100 kg P2O5 và 180 – 220 kg K2O mỗi hecta.
P2O5 và 180 – 200 kg K2O (Viện Nghiên cứu mía đường, 2020)
Việc lạm dụng phân hóa học và thuốc bảo vệ thực vật không chỉ làm tăng chi phí sản xuất mà còn gây hại cho cây trồng, hệ sinh thái, môi trường và sức khỏe con người Do đó, nghiên cứu và ứng dụng vi khuẩn có lợi là một phần quan trọng trong chiến lược nông nghiệp sinh thái hiện nay Theo Singh và Singh (2012), vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật có thể thay thế hoặc bổ sung cho phân bón hóa học, thuốc trừ sâu và thuốc diệt cỏ, đồng thời duy trì tính bền vững của năng suất cây trồng và bảo vệ môi trường Nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả của việc sử dụng phân bón hợp lý và tăng cường ứng dụng vi khuẩn có lợi, đặc biệt là vi khuẩn cố định đạm ở cây không họ Đậu như lúa, khoai lang và mía Brazil là một ví dụ tiêu biểu cho các quốc gia sản xuất mía hàng đầu thế giới với mức sử dụng phân đạm hóa học thấp nhất (Ridge, 2013; Yoneyama et al., 2017).
Mặc dù phân bón vi sinh có tiềm năng lớn trong nông nghiệp bền vững, nghiên cứu về vi khuẩn liên kết thực vật trên cây mía, đặc biệt là trên đất xám, vẫn còn hạn chế Đề tài nghiên cứu thuộc luận án tiến sĩ “Phân lập, tuyển chọn, nhận diện vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ cây mía (Saccharum spp L.) trồng trên đất xám tỉnh Tây Ninh” nhằm tìm kiếm các dòng vi khuẩn bản địa với khả năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp IAA Những dòng vi khuẩn này sẽ cung cấp giống cho nghiên cứu sản xuất phân bón sinh học, bổ sung dinh dưỡng đa lượng như N và P, đồng thời thúc đẩy sự tăng trưởng cây trồng thông qua việc sản xuất hormone thực vật Hướng nghiên cứu này góp phần vào việc sử dụng bền vững và hiệu quả tài nguyên thiên nhiên trong chiến lược phát triển nông nghiệp bền vững.
Mục tiêu và phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu này tập trung vào việc khai thác tiềm năng của các giống vi khuẩn bản địa để thúc đẩy sự tăng trưởng của cây mía Mục tiêu là phát triển phân bón vi sinh, góp phần vào nền nông nghiệp bền vững.
1.2.1.2 Mục tiêu cụ thể của nghiên cứu
Phân lập và nhận diện các dòng vi khuẩn nội sinh từ vùng rễ cây mía có khả năng cố định đạm, hòa tan lân và sản xuất hormone tăng trưởng thực vật IAA là một bước quan trọng trong nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật trong nông nghiệp Việc tuyển chọn những vi khuẩn này sẽ góp phần nâng cao hiệu quả sinh trưởng của cây mía, đồng thời cải thiện chất lượng đất và năng suất cây trồng.
Thử nghiệm hiệu quả của các dòng vi khuẩn tuyển chọn trên cây mía trồng trong chậu và ngoài đồng
Vi khuẩn đã được phân lập từ các mẫu đất vùng rễ và mô thân, rễ của cây mía tại 7 huyện ở tỉnh Tây Ninh, ngoại trừ huyện Hoà Thành và thành phố Tây Ninh.
Thử nghiệm hiệu quả của các dòng vi khuẩn tuyển chọn trên cây mía nuôi cấy mô, giống VN-85-1859, trồng trong điều kiện nhà lưới ở giai đoạn 3 tháng tuổi
Nghiên cứu được thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu ứng dụng Mía đường Thành Thành Công, ấp Bình Hòa, xã Thái Bình, huyện Châu Thành, tỉnh Tây Ninh, nhằm thử nghiệm hiệu quả của các dòng vi khuẩn tuyển chọn đối với năng suất và chữ đường của cây mía giống K95-156 Thí nghiệm được tiến hành cả trong chậu và ngoài đồng để đánh giá sự ảnh hưởng của các yếu tố cấu thành năng suất.
Nội dung nghiên cứu
Phân lập các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và hòa tan lân trong đất vùng rễ và nội sinh cây mía được thực hiện trên môi trường LGI, Burk’s không đạm và NBRIP.
(2) Định lượng khả năng cố định đạm và hòa tan lân in vitro của các dòng vi khuẩn đã phân lập
(3) Đánh giá hoạt tính sản xuất IAA và siderophore in vitro của một số dòng vi khuẩn có cả hai khả năng cố định đạm và hòa tan lân
Nhận diện và nghiên cứu mối quan hệ phát sinh của các dòng có đặc tính tốt thông qua việc kết hợp hình thái tế bào, khuẩn lạc, sinh học phân tử và công cụ tin sinh học.
Nhân giống in vitro giống mía VN-85-1859 nhằm tạo ra nguồn cây mía con sạch khuẩn Nghiên cứu đánh giá hiệu quả của các vi khuẩn có đặc tính tốt trên cây mía con được trồng trong bình Leonard dưới điều kiện nhà lưới.
Đánh giá hiệu quả của các dòng vi khuẩn sau thí nghiệm ở nội dung thứ 5 dựa trên các yếu tố như năng suất, năng suất và hàm lượng đường của mía trồng trong chậu và ngoài đồng.
Ý nghĩa nghiên cứu
Nghiên cứu này tập trung vào việc xác định vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh có khả năng thúc đẩy sự tăng trưởng của cây mía trồng trên đất xám tại tỉnh Tây Ninh Sử dụng trình tự gene 16S rRNA, nghiên cứu xây dựng cây phả hệ để phân tích mối quan hệ giữa các dòng vi khuẩn được phân lập từ cây mía ở các khu vực khác nhau trong tỉnh Kết quả của nghiên cứu sẽ làm phong phú thêm cơ sở dữ liệu nông học của Tây Ninh và khu vực Đông Nam Bộ, đồng thời làm rõ mối quan hệ tương tác giữa đất, cây trồng và vi sinh vật đất.
Đất xám, mặc dù có hàm lượng dinh dưỡng thấp, chiếm hơn 81% diện tích tự nhiên của tỉnh Tây Ninh và được sử dụng để trồng hoa màu, đặc biệt là cây mía Chi phí phân bón cho sản xuất mía trên loại đất này thường cao hơn so với các loại đất khác Do đó, việc thu thập nguồn vi khuẩn bản địa cùng với các thông tin nghiên cứu cơ bản sẽ là cơ sở quan trọng cho việc phát triển phân bón sinh học thân thiện với cây trồng và môi trường địa phương.
Thời gian thực hiện và địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu về vi khuẩn đất và vi khuẩn nội sinh trên cây mía, bao gồm việc thu mẫu, phân lập, tuyển chọn và nhận diện các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và hòa tan lân, được thực hiện từ tháng 10/2015 đến tháng 4/2017 Đánh giá hiệu quả của các dòng vi khuẩn này trên cây mía nhân giống in vitro trong điều kiện nhà lưới diễn ra từ tháng 4/2017 đến tháng 5/2018 Tiếp theo, việc đánh giá hiệu quả của vi khuẩn tuyển chọn trên cây mía trồng trong chậu và ngoài đồng được thực hiện từ tháng 5/2019 đến tháng 1/2020.
Nghiên cứu về việc phân lập, tuyển chọn và nhận diện vi khuẩn thúc đẩy sự tăng trưởng thực vật được thực hiện tại các phòng thí nghiệm Vi sinh vật học, Sinh hóa, và Nuôi cấy mô của trường Đại học Sài Gòn, cũng như tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ, nơi có các phòng thí nghiệm Vi sinh vật đất, Vi sinh vật môi trường và Sinh học phân tử.
Thử nghiệm hiệu quả của các dòng vi khuẩn tuyển chọn trên cây mía được thực hiện tại Đại học Sài Gòn, với cây mía 3 tháng tuổi trồng trong nhà lưới Ngoài ra, các thử nghiệm cũng được tiến hành trên cây mía 6 tháng và 12 tháng tuổi, trồng cả trong chậu và ngoài đồng, tại Trung tâm Nghiên cứu ứng dụng Mía đường Thành Thành Công, tỉnh Tây Ninh, với diện tích thí nghiệm khoảng 3.000m².
Các điểm mới của nghiên cứu
Phương pháp thu thập mẫu vi khuẩn đất vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây mía được thực hiện trên hầu hết các huyện của tỉnh Tây Ninh, trừ Hòa Thành và TP Tây Ninh Do mía không gieo trồng bằng hạt, việc nuôi cấy mô cây mía đã được tiến hành để cung cấp nguyên liệu cho nghiên cứu khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật in vivo trong điều kiện nhà lưới Sau đó, cây được thử nghiệm ở quy mô bán thực địa và thực địa Việc nuôi cấy mô cũng giúp kiểm soát vi sinh vật, loại trừ ảnh hưởng của các vi khuẩn ngoại nhiễm đến sự tăng trưởng của cây.
Kết quả nghiên cứu cho thấy đã phân lập được 422 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và hòa tan lân, trong đó có 101 dòng có khả năng tổng hợp IAA và 81 dòng tổng hợp siderophore Đặc biệt, 36 dòng vi khuẩn với đặc tính tốt đã được định danh dựa trên trình tự gene 16S rRNA, trong đó dòng vi khuẩn CT4bd từ cây mía trồng tại Hảo Đước, huyện Châu Thành, tỉnh Tây Ninh đã được nhận diện.
Serratia oryzae sp nov., một loài mới được phát hiện nội sinh cây lúa trồng ở
Năm 2017, Zhang và cộng sự đã công bố nghiên cứu về dòng CT4bd (Serratia oryzae) và TPD3b (Bacillus subtilis), cho thấy chúng có khả năng thay thế 25% phân hóa học N và P Kết quả thử nghiệm trên cây mía trồng ngoài đồng cho thấy sự gia tăng 14% chữ đường, góp phần nâng cao năng suất mía.
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
Hiện trạng sản xuất mía đường của tỉnh Tây Ninh
Viện Nghiên cứu mía đường đã phân tích các đặc điểm tự nhiên và xã hội của 7 vùng sinh thái nông nghiệp tại Việt Nam để đánh giá tiềm năng ngành mía đường hiện đại Kết quả cho thấy vùng Duyên hải miền Trung và Đông Nam Bộ được xếp loại tốt, trong đó Đông Nam Bộ bao gồm 6 tỉnh: Bà Rịa - Vũng Tàu, Đồng Nai, Bình Dương, Bình Phước, Tây Ninh, và TP Hồ Chí Minh Vùng này có đặc điểm đất đai dày (trên 70 cm chiếm 80%), bằng phẳng (độ dốc dưới 15° chiếm 92%) và ít chia cắt, tạo điều kiện thuận lợi cho cơ giới hóa và phát triển giao thông Trong 12 nhóm đất chính của Đông Nam Bộ, có 3 nhóm đất quan trọng cho canh tác mía: đất xám bạc màu, đất đỏ Bazal và đất phù sa, với tỉnh Tây Ninh chiếm ưu thế với hơn 81% diện tích tự nhiên là đất xám.
2.1.1 Đặc điểm khí hậu, đất đai của tỉnh Tây Ninh
Tây Ninh, nằm ở miền Đông Nam Bộ, có tọa độ từ 10°57’08” đến 11°46’36” vĩ độ Bắc và từ 105°48’43” đến 106°22’48” kinh độ Đông, có khí hậu ôn hòa với hai mùa rõ rệt: mùa nắng từ tháng 12 đến tháng 4 và mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 11 Nhiệt độ trung bình hàng năm ở Tây Ninh đạt 27,4°C, với lượng bức xạ và ánh sáng dồi dào, trung bình có 6 giờ nắng mỗi ngày Lượng mưa hàng năm dao động từ 1.800 đến 2.200 mm, cùng với độ ẩm trung bình khoảng 70-80%.
Ninh chịu tác động của hai loại gió chính: gió Tây – Tây Nam trong mùa mưa và gió Bắc – Đông Bắc trong mùa khô, với tốc độ trung bình khoảng 1,7 m/s, giúp điều hòa khí hậu trong suốt cả năm (Viện Quy hoạch và thiết kế Nông nghiệp, 2004).
Tỉnh Tây Ninh có tổng diện tích tự nhiên là 402.960 ha, trong đó diện tích các thuỷ vực như ao hồ và sông suối là 29.770 ha, còn lại là 373.190 ha đất đai Tài liệu của Viện Quy hoạch và Thiết kế Nông nghiệp (2004) phân loại đất thành 4 nhóm và 12 loại, với tên gọi tương ứng theo hệ thống phân loại đất của Việt Nam và WRB/FAO Nhóm đất xám bạc màu chiếm diện tích lớn nhất, lên tới 330.033 ha, tương đương 88,4% tổng diện tích đất và 81,9% tổng diện tích tự nhiên của tỉnh.
Đất xám là loại đất phổ biến tại tỉnh Tây Ninh, được sử dụng chủ yếu cho nông nghiệp, đặc biệt là trồng cây mía Bài viết này sẽ tập trung vào việc cung cấp thông tin chi tiết về đất xám trong tỉnh, nhằm phục vụ cho nghiên cứu luận án.
Bảng 2.1: Diện tích đất xám bạc màu theo địa giới hành chính tỉnh Tây Ninh
Huyện/thành phố Diện tích (ha) Huyện/thành phố Diện tích (ha)
Dương Minh Châu 42,294 Hòa Thành 7,114
(Viện Quy hoạch và thiết kế Nông nghiệp, 2004)
Các loại đất hình thành trên đá mẹ lớn tuổi thường có thành phần cơ giới nhẹ, đặc biệt là đất xám ở Tây Ninh, nơi có khí hậu nhiệt đới ẩm Quá trình phá hủy khoáng sét và rửa trôi-tích tụ sét đã giữ lại các hạt cát, tạo ra màu xám chủ đạo cho đất Đất xám tại đây hình thành trên nền phù sa cổ từ thời Pliocene đến Pleistocene thượng, với thành phần chủ yếu là cát-thịt-sét gắn kết yếu, có thể kèm theo cuội-sỏi hoặc kết von laterite Đặc điểm địa hình, chế độ thoát nước và các quá trình ngoại sinh đã dẫn đến những biến đổi thứ cấp, phân chia đất xám ở Tây Ninh thành nhiều loại khác nhau.
3 đơn vị phân loại, gồm đất xám trên phù sa cổ, đất xám có tầng loang lổ
Đất gley và đất xám gley là hai loại đất quan trọng được nghiên cứu bởi Viện Quy hoạch và thiết kế Nông nghiệp (2004) Phân loại và quy mô của các loại đất xám tại tỉnh Tây Ninh được trình bày chi tiết trong Bảng 2.2.
Bảng 2.2: Phân loại và quy mô của các loại đất xám ở Tây Ninh
Loại đất Tên tương đương
Tỷ lệ (%) Đất xám trên phù sa cổ Haplic Acrisols X 230,323 69,79 Đất xám có tầng loang lổ gley
Xf 50,526 15,31 Đất xám gley Gleyic Acrisols Xg 49,184 14,90
(Viện Quy hoạch và thiết kế Nông nghiệp, 2004) (có hiệu chỉnh) Đất xám trên phù sa cổ có sự phân bố trên toàn tỉnh Tây Ninh Trong đó,
Hai huyện có diện tích lớn nhất là Tân Châu (70.770 ha, chiếm 31%) và Tân Biên (63.505 ha, chiếm 28%) Đất tại đây có thành phần cơ giới nhẹ, chua, và hàm lượng dinh dưỡng thấp, với tỷ lệ cát chiếm khoảng 58-64% và sét chỉ khoảng 30-33% pH nước dao động từ 4,4-4,7, tỷ lệ mùn rất thấp, chỉ đạt 1,4-2,2% OM Đạm, lân và kali tổng số đều thấp, với đạm tổng số chỉ đạt 0,06-0,10% và lân tổng số từ 0,018-0,046% Đất xám phù sa cổ, dễ cải tạo và thích hợp cho cây trồng cạn nhiệt đới, cần bổ sung phân hữu cơ và phân hóa học theo nhu cầu Đất xám có tầng loang lổ gley, phân bố chủ yếu ở phía Nam tỉnh, có độ phì khá với pH nước từ 4,6-5,0 Châu Thành và Dương Minh Châu là hai tỉnh có diện tích đất xám loang lổ gley lớn nhất, chiếm lần lượt 23% và 19,8%.
Đất xám gley có đặc điểm mùn và đạm ở mức khá đến giàu (4,3 – 8,5% OM và 0,21 – 0,22%), lân ở mức trung bình thấp (0,05 – 0,13% P2O5) và kali thấp (0,022 – 0,041% K2O) Đây là loại đất có nhiều ưu điểm về tính chất lý-hóa học, phân bố chủ yếu ở địa hình bằng phẳng, thuận lợi cho tưới tiêu và canh tác nông nghiệp Hiện tại, phần lớn diện tích đất xám gley được sử dụng để trồng lúa 2-3 vụ có tưới, bên cạnh một số diện tích trồng mía và hoa màu, với rất ít đất trồng cây ăn quả Tại Tây Ninh, đất xám gley chủ yếu phân bố ở các thung lũng ven suối và trũng thấp, tập trung nhiều nhất ở ba huyện Tân Biên, Châu Thành và Trảng Bàng, chiếm tỷ lệ lần lượt là 21%, 18,6% và 12% Đặc biệt, đất xám gley thường có mực nước ngầm nông, dễ bị ngập nước trong vài tháng mỗi năm và có gley xuất hiện ở độ sâu trung bình đến mạnh.
Đất xám gley có chiều sâu từ 0 – 50 cm, thường chứa mùn và đạm cao, với các đặc tính tương tự như đất xám có tầng loang lổ gley Thành phần cơ giới của đất này trung bình đến nhẹ, có độ chua vừa phải và độ phì khá Cấp hạt sét ở tầng đất mặt dao động từ 30 – 36%, trong khi cấp hạt cát từ 50 – 52% pH nước của đất khoảng 4,5 – 4,6 Tuy nhiên, thành phần dinh dưỡng trong đất thường không cân đối, với mùn và đạm đạt mức khá đến giàu (2,1 – 17,5% OM; 0,14 – 0,50% N) và lân ở mức trung bình thấp (0,15 – 0,16%).
Đất xám gley tại Tây Ninh có hàm lượng dinh dưỡng đa dạng, với kali nghèo (0,025 – 0,036% K2O) và sự khác biệt rõ rệt về mùn và đạm giữa các khoanh đất Loại đất này có nhiều ưu điểm cho nông nghiệp nhờ độ chua vừa và dinh dưỡng cao, phù hợp với địa hình thấp và bằng phẳng, tạo điều kiện thuận lợi cho tưới nước Hiện nay, phần lớn diện tích đất xám gley được sử dụng cho canh tác lúa hoặc luân canh lúa-màu, trong khi một phần nhỏ dành cho đất chuyên màu Để nâng cao hiệu quả sản xuất, cần chú ý đầu tư thủy lợi cho trồng lúa và lúa-màu, đặc biệt ở khu vực phía Bắc tỉnh.
Tại Tây Ninh, đất xám trên phù sa cổ chiếm diện tích lớn nhất nhưng nghèo dinh dưỡng Hai loại đất xám còn lại, bao gồm đất xám có tầng loang lổ gley và đất xám gley, có hàm lượng mùn và đạm khá do phân bố ở địa hình trũng, đọng nước Cả ba loại đất xám đều có thành phần cơ giới nhẹ, tính chua và nghèo lân, kali Đất xám gley phù hợp cho trồng lúa và màu, trong khi đất xám có tầng loang lổ gley và đất xám trên phù sa cổ thích hợp cho canh tác mía và các cây trồng cạn khác.
2.1.2 Đặc điểm vùng mía đường Tây Ninh Ở Tây Ninh có hai vụ mía chính: vụ đông-xuân và vụ hè-thu Trong vụ đông-xuân, mía thường được trồng vào cuối mùa mưa, khoảng từ tháng 11 đến tháng 2 Thời điểm cụ thể tùy thuộc vào điều kiện độ cao của đất, ẩm độ đất, khả năng tiêu thoát nước, điều kiện tưới Mía trồng ở vụ này tuy có thời gian sinh trưởng dài nhưng thường cho năng suất cao Ở vụ hè-thu, mía thường được trồng vào đầu mùa mưa, khoảng từ tháng 4 đến tháng 6 và chỉ trồng được trên các vùng đất triền gò không ngập nước Đây là nguồn hom giống cho vụ đông-xuân tiếp theo Những nơi đất trũng thấp thường không trồng vụ hè-thu (Viện Quy hoạch và thiết kế Nông nghiệp, 2004)
Theo Cục Thống kê Tây Ninh (2019), diện tích trồng mía trên toàn tỉnh đạt 14.668 ha, đứng thứ ba sau lúa và khoai mì, chiếm 5,4% diện tích mía cả nước và 60% diện tích mía khu vực Đông Nam Bộ Điều này khẳng định vị trí quan trọng của mía đường trong phát triển kinh tế tỉnh Mặc dù diện tích mía năm 2018 giảm so với năm 2017, nhưng tăng khoảng 2.000 ha so với năm 2016 Trong 9 đơn vị hành chính của tỉnh, Châu Thành và Tân Châu có diện tích trồng mía lớn nhất với 6.044 ha và 4.053 ha, trong khi Tân Biên và Bến Cầu có diện tích trên 1.000 ha với khoảng 2.341 ha và 1.254 ha.
Bảng 2.3: Diện tích trồng mía của tỉnh Tây Ninh qua các năm (2015 – 2018), phân theo đơn vị hành chính
Huyện/thành phố Diện tích (ha)
(Cục thống kê tỉnh Tây Ninh, 2019)
Năm 2018, tỉnh Tây Ninh đạt năng suất mía bình quân khoảng 77,18 tấn/ha, vượt trội so với mức bình quân toàn quốc là 66,6 tấn/ha và khu vực Đông Nam Bộ với 72,6 tấn/ha, theo số liệu từ Cục Thống kê tỉnh Tây Ninh.
Các vấn đề về môi trường và sức khoẻ phát sinh từ việc trồng mía13 1 Đối với thuốc trừ sâu và thuốc diệt cỏ
Nghề trồng mía ở Việt Nam hiện chưa ổn định do giá đường mía nhập khẩu thấp hơn nhiều so với sản xuất trong nước Trong khi đó, các nước sản xuất mía hàng đầu như Brazil không chỉ tập trung vào sản xuất đường mà còn phát triển các sản phẩm giá trị cao như ethanol và nhiên liệu sinh học Điều này cho thấy họ đã thực hiện nghiên cứu toàn diện về ngành công nghiệp mía đường, bao gồm cả tác động tiêu cực của canh tác mía đến môi trường sinh thái.
2.2.1 Đối với thuốc trừ sâu và thuốc diệt cỏ
Canh tác mía đường công nghiệp đã dẫn đến nhiều vấn đề môi trường nghiêm trọng, bao gồm tiêu thụ năng lượng cao trong sản xuất, phát thải khí nhà kính như methane và nitrogen oxide, và thay đổi tính chất vật lý, hóa học, sinh học của đất Ngoài ra, việc sử dụng phân bón vô cơ gia tăng cũng gây ô nhiễm đất, trong khi chất lượng nước mặt và không khí ngày càng bị suy giảm (Hartemink, 2008).
Cây mía có thời gian mùa vụ dài và thường phải đối mặt với sự cạnh tranh từ cỏ dại, có thể làm giảm năng suất từ 20-25% (Hussain et al., 2017) Hiện nay, khoảng 50% thuốc diệt cỏ trên thế giới được sử dụng cho mía đường thương mại, trong đó atrazine, diuron, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) và alachlor là những loại phổ biến nhất Các loại thuốc diệt cỏ này có khả năng hòa tan trong nước, dẫn đến nguy cơ ô nhiễm đất, đới nông và nguồn nước bề mặt cũng như nước ngầm (Hartemink).
Atrazine và ametryne chủ yếu bị phân hủy bởi ánh sáng mặt trời, trong khi alachlor bị phân hủy nhanh hơn atrazine Nghiên cứu của Southwick và cộng sự (1992) cho thấy nồng độ atrazine trong đất trồng mía ở Louisiana đạt mức tối đa từ 82 đến 403 mg/L chỉ trong vòng 11 ngày sau khi phun.
Nghiên cứu của Southwick và cộng sự (1992) cho thấy sau 30 ngày, nồng độ atrazine chỉ còn 3 mg/L, đạt giới hạn cho phép trong nước uống tại Hoa Kỳ Các nghiên cứu tiếp theo (Southwick et al., 1995, 2002) chỉ ra rằng mặc dù nồng độ metribuzin trong vùng trồng mía chưa vượt ngưỡng cho phép, nhưng nồng độ atrazine đã vượt mức ô nhiễm cho nước uống Tại Brazil, Lanchote và cộng sự (2000) đã phát hiện dư lượng atrazine, simazin và ametryne trong nước mặt và nước ngầm gần Sao Paulo, với atrazine có mặt trong 17/250 mẫu nhưng nồng độ vẫn thấp hơn khuyến cáo Bengtson và cộng sự (1998) nhấn mạnh rằng phương pháp sử dụng là yếu tố quyết định đến tỷ lệ thất thoát của thuốc diệt cỏ.
Trong canh tác mía, việc sử dụng thuốc trừ sâu ít phổ biến hơn so với thuốc diệt cỏ, với thành phần hoạt chất của thuốc trừ sâu ở Úc thấp hơn khoảng 11 lần so với thuốc diệt cỏ (Arthington et al., 1997) Mặc dù thuốc trừ sâu chứa chlorine hữu cơ đã từng được sử dụng rộng rãi ở Úc từ những năm 1950 đến 1980, nhưng đã bị cấm sau đó Dù các mẫu bề mặt và lõi trầm tích không phát hiện chlorine hữu cơ ở mức nguy hiểm, vẫn có lo ngại về khả năng di chuyển của chúng từ đất trồng mía ra môi trường biển gần bờ do hiện tượng tràn nước và xói mòn đất (Cavanagh et al.).
Tại Brazil, cho đến năm 1985, các hoạt chất chlorine hữu cơ như aldrin và heptachlor vẫn được sử dụng phổ biến trong việc trừ sâu cho cây mía Các dấu vết của những chất này đã được phát hiện trong đất, lở tích, trầm tích lắng, cũng như trong các sinh vật như giun và ấu trùng ở các lưu vực mía Sau năm 1999, các hợp chất chlorine hữu cơ và các hoạt chất trừ sâu khác vẫn tiếp tục được lưu hành trên thị trường.
Năm 1985, sự hiện diện đáng kể của các hóa chất trong môi trường đã chỉ ra sự cần thiết phải có lệnh cấm lưu hành để ngăn chặn sự phát tán của chúng (Sparovek et al., 2001) Nghiên cứu của Lerro và cộng sự (2017) cho thấy việc tiếp xúc với thuốc diệt cỏ như atrazine và 2,4-D trong canh tác có thể dẫn đến các bệnh mãn tính liên quan đến stress oxy hóa, bao gồm tổn thương DNA do 2,4-D gây ra Đối với động vật và con người, tác động độc hại của 2,4-D phụ thuộc vào liều lượng, tần suất tiếp xúc và độ nhạy cảm (Islam et al., 2018) Tương tự, Singh và cộng sự (2016) đã chỉ ra rằng thuốc trừ sâu, đặc biệt là nhóm chứa chlorine hữu cơ, có khả năng gây đột biến, u bướu và chết tế bào ở chuột thí nghiệm, cũng như gây ngộ độc cấp tính ở gan, thận và tinh hoàn.
Nghiên cứu của Islam và cộng sự (2018) chỉ ra rằng việc tiếp xúc với 2,4-D có thể dẫn đến nguy cơ tiềm ẩn từ các chất độc hại trong thuốc diệt cỏ và trừ sâu, ngay cả khi nồng độ thấp hơn ngưỡng an toàn Do đó, cần tiến hành các nghiên cứu bổ sung để hiểu rõ hơn về sự chuyển hóa, tích lũy và tác động của các chất này Việc này sẽ giúp xây dựng cơ sở dữ liệu đáng tin cậy, là nền tảng cho việc phát triển quy định và chính sách mới nhằm bảo vệ sức khỏe con người và môi trường khỏi nguy cơ phơi nhiễm.
2.2.2 Đối với phân bón hoá học
Việc bón phân NPK không hợp lý, cùng với các yếu tố như nguồn giống kém chất lượng, hệ thống tưới không phù hợp và kiểm soát sâu bệnh kém, đã dẫn đến năng suất và chất lượng cây trồng kém, đặc biệt là cây mía (Hussain et al., 2017; Li et al., 2019; Soomro et al., 2014) Tại Pakistan, chỉ 4% người trồng mía sử dụng phân NPK, và 73% chỉ dùng phân N và P (Hussain et al., 2017) Nghiên cứu cho thấy phân kali đóng vai trò quan trọng trong cải thiện chất lượng cây trồng và giảm ô nhiễm môi trường do thất thoát N và P Việc cung cấp đủ ion K giúp tăng cường hấp thụ N và P, thúc đẩy chuyển hóa carbohydrate và cải thiện chất lượng nông sản (Li et al., 2019) Tuy nhiên, việc tăng cường phân bón có thể dẫn đến chất lượng cây trồng thấp hơn và thất thoát dinh dưỡng lớn hơn, làm tăng chi phí sản xuất và ảnh hưởng xấu đến môi trường và sức khỏe con người (Glick, 2012; Li et al., 2019) Bón thiếu N có thể giảm năng suất mía, trong khi bón thừa N gây dư lượng N trong mía chín, làm giảm chất lượng nước ép (Hussain et al., 2017) Ở Úc, việc bón N với mức 150 – 300 kg/ha đã gây ô nhiễm nguồn nước và phát thải khí nhà kính (Hartemink, 2008) Khi tỷ lệ bón phân N vượt quá 150 – 180 kg/ha, quá trình thấm lọc nitrate gia tăng, và khí nhà kính N2O cũng tăng khi tỷ lệ này vượt quá 180 kg/ha (Li et al., 2019).
Trong vùng trồng mía ở Mauritius, phương pháp tưới nhỏ giọt đã giúp giảm 30% lượng phân bón N, nhưng đầu tư cho biện pháp này rất lớn và có thể không khả thi cho tất cả các vùng sản xuất mía đường Nước uống hoặc nông sản có hàm lượng nitrate vượt ngưỡng có thể làm tăng nguy cơ mắc bệnh tăng methemoglobin huyết và dị tật ống thần kinh ở trẻ sơ sinh Nghiên cứu tại Hoa Kỳ cho thấy sự gia tăng các bệnh ung thư đại trực tràng, bàng quang, ung thư vú, bệnh tuyến giáp và giảm chức năng sinh sản ở người trưởng thành liên quan đến việc phơi nhiễm nitrate từ nước uống.
Theo Hartemink (2008), tỷ lệ áp dụng phân lân thường không tính đến tính chất của đất, điều này ảnh hưởng đến khả năng phát tán và hấp thụ phốt pho (P) Tại Úc, mức bón phân lân thường vượt quá khuyến cáo, với tỷ lệ lên đến 15.
Việc bón phân lân với liều lượng 50 kg P/ha được áp dụng để giảm nguy cơ hạn chế sản lượng (Hartemink, 2008) Một nghiên cứu tại 105 khu vực trồng mía ở Úc cho thấy 84% mẫu đất có dư lượng P cao khi bón 20 kg P/ha, và việc giảm lượng P này sẽ mất nhiều thời gian (Bloesch and Rayment, 2006) Phân lân vô cơ thường bị cố định thành dạng khó tan như nhôm phosphate, sắt phosphate trong đất chua, hoặc calcium phosphate trong đất kiềm (Cao Ngọc Điệp, 2011) Tại Brazil, việc bón phân P liên tục đã làm tăng hàm lượng lân vô cơ và hữu cơ ở lớp đất mặt (Ball-Coelho et al., 1993) Ở Hoa Kỳ, mức độ P cao trong đất có thể làm tăng mức độ nghiêm trọng của bệnh gỉ sắt (Johnson et al., 2007) Thất thoát phân bón P do xói mòn đất và thấm lọc vào nước ngầm có thể dẫn đến sự phát triển quá mức của vi khuẩn lam và tảo trong các thuỷ vực (Arthington et al., 1997).
Sự nở hoa của nước ở vùng mía Everglades (Hoa Kỳ) gia tăng do hiện tượng giảm dòng chảy và tích tụ P từ phân bón (Anderson và Rosendahl, 1997) Nghiên cứu cho thấy nồng độ cadmium (Cd) trong đất trồng mía cao gấp 7 lần so với đất không canh tác (Arthington et al., 1997), với nguồn ô nhiễm Cd chủ yếu từ phân bón P vô cơ (Kirkham, 2006) Một tấn super lân chứa từ 50 – 170 g Cd (Phạm Thị Thùy, 2010), và thời gian bán hủy của Cd trong cơ thể kéo dài từ 7 – 30 năm Cadmium có thể gây ra các bệnh về hô hấp và tiêu hóa, với tiếp xúc lâu dài có thể dẫn đến bệnh phổi, xương, và ung thư (Nguyễn Đức Khiển, 2002).
Hạn chế lớn nhất trong sản xuất mía đường hiện nay là vấn đề phân bón, đặc biệt là phân N hóa học Cần xem xét các phương pháp tăng năng suất nông nghiệp mà vẫn bảo vệ môi trường, bao gồm việc tăng cường sử dụng cây biến đổi gene và vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật, như Glick (2012) đã nêu Đối với Việt Nam, đặc biệt là Tây Ninh, việc nghiên cứu và ứng dụng vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật liên kết với cây mía là cần thiết để đạt được mục tiêu sản xuất đường mía bền vững.
Đa dạng các vi khuẩn có khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật liên kết với cây mía
2.3.1 Các khái niệm vi khuẩn vùng rễ, vi khuẩn nội sinh, vi khuẩn liên kết thực vật và vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật
Vi khuẩn là nhóm vi sinh vật phong phú nhất ở vùng rễ, có ảnh hưởng lớn đến sinh lý thực vật và khả năng cạnh tranh cao trong tương tác với cây chủ Chúng bị thu hút bởi các hợp chất do rễ tiết ra, di chuyển đến vùng rễ, định cư trên bề mặt hoặc xâm nhập vào bên trong rễ, sau đó di chuyển lên các bộ phận khác của cây (Compant et al., 2010) Quan hệ tương tác giữa vi khuẩn và thực vật được phân loại thành các dạng như cộng sinh, nội sinh hoặc liên kết, tùy thuộc vào mức độ cận kề của vi khuẩn với đất hoặc rễ cây (Souza et al., 2015).
Hình 2.1: Các kiểu liên kết giữa vi khuẩn đất có lợi và rễ cây (Souza et al., 2015)
Vi khuẩn liên kết thực vật (PAB) được phân loại thành ba nhóm dựa trên vị trí cư trú: vi khuẩn đất vùng rễ, vi khuẩn biểu sinh rễ và vi khuẩn nội sinh, hoặc hai nhóm chính theo tác động của chúng lên vật chủ: PAB gây bệnh và PAB có lợi Nhóm PAB có lợi chủ yếu mang lại lợi ích bằng cách thúc đẩy sự tăng trưởng của cây chủ (Fuente and Burdman, 2011; Hardoim et al., 2012; Jha et al., 2013).
PGPB (tăng trưởng thực vật) được chia thành nhóm nhỏ hơn gọi là “PGPB-kiểm soát sinh học”, bao gồm các lợi khuẩn giúp tăng cường sức khỏe cho cây Các PGPB sống trong vùng rễ cây được gọi là “vi khuẩn vùng rễ thúc đẩy tăng trưởng thực vật” (PGPR).
Kloepper và Schroth (1978, 1981) đã giới thiệu khái niệm "vi khuẩn vùng rễ" (rhizopheric bacteria) và "vi khuẩn vùng rễ thúc đẩy tăng trưởng thực vật" (PGPR), những vi khuẩn này sống trong đất và có khả năng cạnh tranh để xâm chiếm rễ cây, từ đó thúc đẩy sự tăng trưởng thực vật và giảm tỷ lệ nhiễm bệnh (Bhattacharyya and Jha, 2012) Ban đầu, PGPR chỉ giới hạn trong các vi khuẩn sống tự do, nhưng sau này đã được mở rộng để bao gồm vi khuẩn cộng sinh và vi khuẩn nội sinh (Agrawal et al., 2014) PGPR được chia thành hai loại: PGPR ngoại bào (ePGPR) và PGPR nội bào (iPGPR) ePGPR thường là các vi khuẩn sống tự do trong vùng rễ, như Azospirillum, Bacillus, Pseudomonas, trong khi iPGPR nằm trong các cấu trúc chuyên biệt của rễ, như nốt rễ, bao gồm các vi khuẩn cộng sinh trong nốt sần của cây họ Đậu.
Rhizobium, Mesorhizobium, Bradyrhizobium, và các vi khuẩn Frankia spp cộng sinh với cây Tống quá sủ (Alnus spp.) (Agrawal et al., 2014; Gupta et al., 2015; Martínez-Viveros et al., 2010)
Vi khuẩn nội sinh (endophytic bacteria) là những vi khuẩn có khả năng xâm nhập vào mô thực vật từ vùng rễ mà không gây triệu chứng nhiễm trùng, được định nghĩa là vi khuẩn sống trong mô thực vật và có thể được phân lập sau khi khử trùng bề mặt (Agrawal et al., 2014; Hallmann et al., 1997; Schulz và Boyle, 2006) Chúng không chỉ không gây hại mà còn thúc đẩy sự tăng trưởng của cây, được gọi là "Plant-growth-promoting bacterial endophytes - PGPBEs" (Gaiero et al., 2013) Ngoài nguồn gốc từ vùng rễ, vi khuẩn nội sinh còn có thể đến từ không khí và các vật liệu nhân giống như hạt hay cành giâm Thêm vào đó, các vi khuẩn liên kết thực vật cũng có thể cư trú tại vùng đất xung quanh hạt đang nảy mầm (spermosphere) hoặc bề mặt lá cây (phyllosphere) (Compant et al., 2010; Hardoim et al., 2012).
Có sự đa dạng trong định nghĩa và phân loại các lợi khuẩn tương tác với thực vật Nghiên cứu này sẽ tập trung vào vi vùng rễ và vi khuẩn nội sinh thực vật, đặc biệt ảnh hưởng tích cực đến sự phát triển của cây mía Phương pháp phân lập được áp dụng không bao gồm các vi khuẩn biểu sinh rễ.
Vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ đều có nguồn gốc từ đất, nhưng chúng khác nhau về thành phần loài, khả năng chống chịu với các yếu tố sinh thái và tác động lên thực vật Mỗi loài và chủng vi khuẩn có thể áp dụng nhiều cơ chế khác nhau trong tương tác với các vi sinh vật khác và cây chủ Do đó, việc phân lập, dò tìm, tuyển chọn và phối hợp các chủng vi khuẩn cho ứng dụng cần trải qua nhiều nghiên cứu cơ bản.
2.3.2 Các vi khuẩn có khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật liên kết với cây mía
Theo nghiên cứu của Gupta và cộng sự (2015), cơ chế thúc đẩy sự tăng trưởng thực vật được tóm tắt trong sơ đồ dưới đây, nêu rõ các đặc tính của vi khuẩn có khả năng ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến sự sinh trưởng và phát triển của cây chủ.
Hình 2.2: Sơ đồ về các cơ chế thúc đẩy tăng trưởng thực vật của vi khuẩn
Cơ chế trực tiếp trong việc thúc đẩy sự phát triển của cây trồng bao gồm việc cung cấp dinh dưỡng như N, P, K và các khoáng chất, cũng như điều chỉnh hormone thực vật Trong khi đó, cơ chế gián tiếp liên quan đến việc kiểm soát sinh học, giảm thiểu tác hại từ mầm bệnh và hình thành hệ vi sinh vật có lợi tại rễ, giúp ngăn chặn sự cạnh tranh từ sinh vật gây hại Nhiều vi khuẩn vùng rễ còn hỗ trợ cây chống chịu với stress, góp phần tăng trưởng trong điều kiện bất lợi như nhiễm mặn hay kim loại nặng Những đặc tính này được ứng dụng trong khử độc môi trường, trong lĩnh vực phục hồi sinh học (bioremediation).
Mehnaz (2011) đã tổng hợp một danh sách chi tiết về sự đa dạng của các vi khuẩn liên kết với cây mía, bao gồm 81 loài với tên Latin, nguồn phân lập, xuất xứ và tài liệu tham khảo (Phụ lục 2.3) Những vi khuẩn này được phân lập từ vùng rễ, kẽ gian bào và nội mô của cây mía trồng ở nhiều quốc gia như Tây Ban Nha, Philippines, Brazil, Ấn Độ và Ai Cập Các chi vi khuẩn đáng chú ý bao gồm Azospirillum, Azotobacter, Herbaspirillum, Bacillus, Burkholderia, Pseudomonas và Rhizobium.
Gluconacetobacter là một trong những vi khuẩn quan trọng được phân lập trong nghiên cứu này, và bài viết sẽ tập trung vào các loài vi khuẩn thường gặp ở cây mía.
Các vi khuẩn hiếu khí hình thành nội bào tử (AEFB) như Bacillus, Brevibacillus, và Paenibacillus được công nhận là những vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật nhờ vào khả năng tồn tại trong điều kiện khắc nghiệt và phát tán rộng rãi Bacillus megaterium, một loài vi khuẩn đất phổ biến, nổi bật với khả năng hòa tan lân và đã được ứng dụng trong sản xuất phân lân vi sinh Các loài Bacillus và Paenibacillus cũng cho thấy khả năng ức chế tác nhân gây bệnh cây, mở ra cơ hội ứng dụng trong kiểm soát sinh học Ngoài ra, Bacillus amyloliquefasciens và B methylotrophicus đã được chứng minh có khả năng đối kháng sinh học cùng với việc thúc đẩy tăng trưởng thực vật.
Hình 2.3: Ảnh SEM của chủng B amyloliquefaciens TF28 có khả năng kháng nấm
Nhiều loài vi khuẩn thuộc nhóm AEFB, như Bacillus cereus, B pumilus, B subtilis, Paenibacillus azotofixans và P polymyxa, đã được phân lập từ rễ, thân và apoplast của cây mía đường (Mehnaz, 2011) Ngoài ra, Brevibacillus sp cũng đã được tìm thấy từ thân và lá của các giống mía trồng ở Brazil (Magnani et al., 2010) Đặc biệt, vào năm 2008, Rivas và cộng sự đã phát hiện một loài vi khuẩn mới từ dịch apoplast của cây mía, được đặt tên là Saccharibacillus sacchari, cho thấy mối quan hệ họ hàng gần gũi với các loài khác trong chi Saccharibacillus.
Nghiên cứu của Dini-Andreote và cộng sự (2010) cho thấy 10,2% tổng trình tự 16S rDNA từ mẫu đất trồng mía tại Brazil thuộc về Firmicutes, với Bacillus chiếm ưu thế 19,7% Tại Việt Nam, Ngô Hồng Thanh và cộng sự (2014) đã nhận diện 10 dòng vi khuẩn trong số 28 dòng vi khuẩn nội sinh cây mía ở Bến Tre và Long An bằng kỹ thuật PCR 16S rDNA, cho thấy chúng có tỷ lệ tương đồng 98-100% với các loài Bacillus trong cơ sở dữ liệu NCBI như B subtilis, B tequilensis, B cereus và B amyloliquefaciens Đồng thời, nghiên cứu của Hoang và Cao cũng tập trung vào vi khuẩn trong đất vùng rễ cây mía trồng tại tỉnh Đồng Nai.
(2015) cũng thu được kết quả là 7 trong số 12 dòng (chiếm 58,3%) là các
Dòng B6 của Bacillus megaterium đã thể hiện khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật in vitro, bao gồm các hoạt động như cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp IAA (Hoang và Cao, 2015).
Các phương pháp thường được sử dụng trong nghiên cứu phân lập, đặc tính hoá và nhận diện vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ cây mía
Trong nghiên cứu về vi khuẩn liên kết thực vật, quy trình từ phân lập, xác định đặc tính thúc đẩy tăng trưởng thực vật đến tuyển chọn dòng vi khuẩn có đặc tính tốt thường trải qua nhiều giai đoạn Mặc dù có thể thay đổi tùy theo đối tượng nghiên cứu, một quy trình cơ bản đã được nhiều tác giả đề xuất Bài viết này tổng hợp tài liệu làm cơ sở cho các phương pháp thí nghiệm đã chọn Nội dung được lược khảo bao gồm phương pháp phân lập và dò tìm vi khuẩn có khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật thông qua khả năng cố định đạm, hòa tan phosphate vô cơ và sản xuất IAA Sản xuất siderophore không chỉ giúp cây tăng cường dinh dưỡng Fe trong điều kiện thiếu hụt mà còn đóng vai trò quan trọng trong đối kháng sinh học, khi vi khuẩn cạnh tranh sắt với nấm và các tác nhân gây bệnh, từ đó ức chế sự phát triển của chúng.
2.5.1 Xử lý mẫu để phân lập vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh thực vật
Xử lý mẫu là bước quan trọng quyết định loại vi khuẩn mà nhà nghiên cứu muốn thu thập, với ba loại vi khuẩn liên kết vùng rễ thực vật: vi khuẩn sống trong đất vùng rễ, vi khuẩn sống trên bề mặt rễ (biểu sinh), và vi khuẩn sống bên trong rễ (nội sinh) Các phương pháp xử lý bộ rễ cây, bao gồm cả đất khối, đất vùng rễ và rễ cây, đã được nhiều tài liệu đề cập, như của Luster và Finlay (2006) cùng Viện thổ nhưỡng nông hóa (1998) Hirsch và Mauchline (2012) cũng đã cung cấp định nghĩa và hướng dẫn tóm tắt về phương pháp lấy mẫu từ bộ rễ cây.
Hình 2.10: Hệ vi sinh vật liên kết rễ (a) và phương pháp lấy mẫu tương ứng (b)
Năm 2014, Baldani và cộng sự đã công bố một bài điểm báo về các phương pháp phân lập vi khuẩn cố định đạm sinh học (BNF) trên cây mía và các cây không họ Đậu khác, nhấn mạnh vai trò của môi trường bán đặc không N Bài viết đã trình bày chi tiết quy trình phân lập, xác định mật số và nhận diện các vi khuẩn trong đất vùng rễ, bao gồm mô tả hình thái khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn BNF thường gặp trên cây mía, lúa miến và các loại ngũ cốc ở Brazil Các tác giả cũng tóm tắt quy trình nghiên cứu vi khuẩn BNF sống nội sinh, liên kết với cây hoặc sống tự do qua sơ đồ Baldani và cộng sự đã chỉ ra các yếu tố ảnh hưởng đến cấu trúc quần xã vi khuẩn liên kết với thực vật như loài cây chủ, kiểu gene, tuổi cây và vị trí lấy mẫu Mật số vi khuẩn cao nhất thường xuất hiện trên bề mặt rễ, tiếp theo là các mô bên trong rễ, và thấp nhất là các mô khí sinh, với nồng độ pha loãng từ 10^-7 đến 10^-9 là phù hợp để đếm và phân lập vi khuẩn từ rễ.
10 -5 đến 10 -6 phù hợp cho vi khuẩn sống bên trong các mô khí sinh
(*) môi trường chuyên biệt cho chi vi khuẩn cần dò tìm
Nghiên cứu vi khuẩn cố định đạm liên kết thực vật ở cây không họ Đậu (Baldani et al., 2014) có thể thực hiện bằng cách lấy mẫu đất từ vùng rễ, sử dụng khoảng 1 – 10 g đất để cấy trực tiếp vào môi trường bán đặc không chứa N Ngoài ra, có thể pha loãng đất với dung dịch đệm chứa muối khoáng và FeEDTA, và đôi khi sử dụng dung dịch đường sucrose 40% cho các cây có hàm lượng đường cao như mía.
Để tạo điều kiện cho sự khuếch tán của vi khuẩn vào dịch đất, 80 có thể được thêm vào với lượng 1 g/L (Baldani et al., 2014 a) Sau khi thu thập, mẫu thực vật sẽ được tách thành các phần thân, lá và rễ, sau đó rửa sạch dưới vòi nước chảy để loại bỏ bụi bẩn Mẫu vật được cắt nhỏ, thấm khô trên giấy và tiến hành khử trùng bằng Chloramine-T với nồng độ 10 g/L, thời gian ngâm tùy thuộc vào độ tuổi và loại cây.
Để khử trùng rễ cây, cần ngâm từ 30 đến 60 phút đối với rễ cây bắp và lúa miến, và từ 5 đến 15 phút đối với rễ lúa gạo và lúa mì trong dung dịch Chloramine T, sau đó ngâm trong nước cất vô trùng và dung dịch đệm phosphate Mẫu đối chứng được xử lý tương tự nhưng chỉ ngâm trong nước cất Đối với cây có sáp như mía, thân cây cần được rửa sạch, xịt cồn 70% và đốt, sau đó tước lớp mô bên ngoài để đảm bảo khử trùng Hiệu quả khử trùng được kiểm tra bằng cách bịt đầu mẫu và ngâm trong môi trường bán đặc; mẫu không phát triển vi sinh vật sau 3 ngày được xem là khử trùng thành công Mẫu nặng 10 g được nghiền trong dung dịch NaCl 0,8% có chứa FeEDTA hoặc sucrose 40%, sau đó để yên và khuấy để tạo dịch chiết Để công nhận vi khuẩn nội sinh “thật”, cần phân lập từ mô đã khử trùng và có bằng chứng vi mô về sự hiện diện của vi khuẩn trong mô Vi khuẩn cũng có thể được công nhận nếu có khả năng tái nhiễm vào cây chủ vô trùng Nghiên cứu đã phát triển các phương pháp kiểm tra sự xâm chiếm của PGPB, như FISH kết hợp với phương pháp MPN, để đánh giá sự cạnh tranh giữa các vi khuẩn BNF trong cây mía, từ đó tối ưu hóa tổ hợp vi khuẩn cho hiệu quả cao nhất trên cây trồng.
(A): Tổ hợp H seropedicae và H rubrisubalbicans nhuộm với EUB-338-I, II, III-
Fluos, Hsero-445-Cy3 và Hrubri-445-Cy5
(B): Tổ hợp G diazotrophicus, H seropedicae và H rubrisubalbicans nhuộm với
ALF-1B-Fluos, Hrubri-445-Cy5 và Herso-445-Cy3
Hình 2.12: Ảnh hiển vi laser quét kết quả lai tại chỗ phát huỳnh quang của một số vi khuẩn liên kết cây mía (Oliveira et al., 2002)
2.5.2 Xác định khả năng cố định đạm của vi khuẩn Đạm (N) là một trong những nguyên tố chính của protein, và chịu trách nhiệm cho sự phát triển và mở rộng của lá Đạm cần thiết cho sự quang hợp và sự tích tụ đường ở mía Khi thiếu N, sự tăng trưởng của toàn bộ cây trồng từ thân, lá, rễ cho đến sự mọc tược đều bị ảnh hưởng (Calcino et al., 2018) Trong canh tác nông nghiệp, phân đạm hóa học chiếm khoảng 30% tổng số phân bón (Mohanta et al., 2010) Trong hầu hết các tình huống, tăng cường bón đạm cho mía có thể cho sản lượng và đường cao hơn so với các loại phân khác Đáp ứng này thường thấy rõ ở mía gốc và thường ít rõ ràng đối với mía trồng xen vụ với đậu (Ridge, 2013) Điều này cho thấy vai trò quan trọng của việc khai thác cố định đạm sinh học nhằm thay thế một phần phân bón urea trong trồng trọt (Canellas et al., 2013) Đây là cơ sở của sự khai thác các vi khuẩn BNF liên kết thực vật từ cây mía và các cây trồng khác
2.5.2.1 Sử dụng môi trường bán đặc và đặc không chứa nitrogen để phân lập và chứng minh khả năng cố định đạm của vi khuẩn
Đến đầu những năm 1970, các nghiên cứu chỉ ra rằng vi khuẩn BNF có khả năng phát triển trong môi trường có nồng độ oxygen khí quyển (pO2 = 0,21 kPa) Tuy nhiên, phức hợp nitrogenase, chịu trách nhiệm khử N2 trong khí quyển, rất nhạy cảm với oxygen và có thể mất hoạt tính không thể phục hồi khi tiếp xúc với phân áp oxygen cao.
Môi trường 41 trường thạch mannitol-nấm men (Yeast Mannitol Agar - YHA) được sử dụng để phân lập các rhizobium cộng sinh, trong khi chỉ có một số ít vi khuẩn sống tự do được biết đến như vi khuẩn cố định đạm, chẳng hạn như Beijerinckia fluminensis, Derxia indica và Azotobacter paspali (Baldani et al., 2014 a).
Phương pháp phân lập vi khuẩn cố định đạm do Dửbereiner và Day (1976) đề xuất là kết quả của nhiều nghiên cứu từ những năm 1920 đến thập niên 1960 Cải tiến quan trọng nhất của họ là giảm nồng độ agar từ 2-3 g/L xuống còn 1,4-1,8 g/L theo gợi ý của Whittenbury (1963), tạo ra môi trường thạch mềm với gradient nồng độ oxygen từ hiếu khí đến kỵ khí Điều này cho phép vi khuẩn tìm thấy vị trí phát triển tối ưu và hình thành một màng mỏng Môi trường NFb mà Dửbereiner và Day (1976) phát triển đã đóng vai trò quan trọng trong việc phân lập các vi khuẩn này.
Azospirillum đã có một cải tiến quan trọng khi môi trường nuôi cấy không chứa Nitơ, cho phép phân lập và nhận diện nhiều vi khuẩn cố định đạm liên kết với các cây không họ Đậu, như cây Hòa thảo (Baldani et al., 2014) Từ môi trường này, nhiều loại môi trường biến đổi đã được phát triển bằng cách điều chỉnh pH, nồng độ thẩm thấu, và bổ sung các thành phần như vitamin, muối, acid amin, và chiết xuất thực vật để phù hợp với nhu cầu của vi khuẩn Dựa trên các môi trường không đạm như NFb, JNFb, LGI, LGI-P, JMV, Baz và Bac, nhiều loài BNF thuộc các chi Azospirillum, Herbaspirillum, Sphingomonas, Gluconacetobacter, và Burkholderia đã được phân lập và nhận diện (Baldani et al., 2014a).
Hình 2.13:Màng mỏng (pellicle) do vi khuẩn cố định đạm tạo thành trong môi trường JNFb không N bán đặc sau 7 ngày nuôi cấy (Ribeiro and Cardoso, 2012)
Môi trường bán đặc đóng vai trò quan trọng trong việc phân lập vi khuẩn nội sinh với nhu cầu oxy thấp để thể hiện hoạt tính cố định đạm Nhiều loại môi trường đặc không N, như Burk’s không N, Burk’s biến đổi, Winogradsky, Bridges và WAT4C, đã được sử dụng để phân lập vi khuẩn cố định đạm sống tự do Một số nghiên cứu đã bổ sung bromothymol blue (BTB) làm chất chỉ thị pH, với sự đổi màu từ xanh lục sang xanh dương khi có ammonia sinh ra, cho thấy sự cố định đạm Hiện tượng này cũng được ghi nhận trong sự phát triển của vi khuẩn cố định đạm trong môi trường bán đặc.
Hình 2.14: Sự chuyển màu môi trường trong nuôi cấy trên môi trường đặc (A) và bán đặc (B và C) với chất chỉ thị BTB (Miladiarsi et al., 2017; Baldani et al., 2014 a)
2.5.2.2 Các phương pháp chứng minh khác
Các phương pháp chứng minh khả năng cố định đạm của vi khuẩn bao gồm kỹ thuật biến loãng với N15, được sử dụng để đánh giá hiệu quả trên cây mía (Asis et al., 2002; Umrit et al., 2009) Ngoài ra, xét nghiệm khử acetylene (Acetylene Reduction Assay - ARA) là một phương pháp nhạy cảm để kiểm tra hoạt động cố định đạm sinh học, thường áp dụng trong các thí nghiệm in vitro và ngoài đồng Tuy nhiên, ARA được xem là phương pháp gián tiếp vì không thể chuyển đổi định lượng sự khử acetylene thành lượng N2 cố định (Muangthong et al., 2015; Mirza et al., 2001).
Một phương pháp phổ biến để đo hàm lượng ammonia trong nuôi cấy lỏng là sử dụng thuốc thử đặc hiệu như Nessler’s hay sodium nitroprusside, được nhiều tác giả áp dụng trong nghiên cứu cố định đạm của các PGPR (Abdelwahab và Nabti, 2017; Cao Ngọc Điệp, 2011; Chrouqi et al., 2017) Ngoài ra, các phương pháp dựa trên gene và sinh học phân tử, đặc biệt là kỹ thuật PCR để dò tìm và khuếch đại trình tự gene nif mã hóa cho các tiểu phần của nitrogenase như nifH, nifD và nifK, cũng đã được sử dụng trong nghiên cứu vi khuẩn cố định đạm liên kết với cây mía (Li et al., 2017; Rodrigues et al., 2018; Yoneyama et al., 2017).
2.5.3 Xác định khả năng hoà tan lân của vi khuẩn
Lân (P) là một nguyên tố dinh dưỡng đa lượng thiết yếu, đóng vai trò quan trọng trong việc hạn chế sự tăng trưởng của thực vật, chỉ sau nguyên tố nitơ (N) Mặc dù đất chứa một lượng lớn hợp chất hữu cơ và vô cơ chứa P, nhưng tới 95-99% phosphate lại tồn tại dưới dạng không hòa tan, vô định và kết tủa Kết quả là, nhiều cây trồng vẫn thiếu hụt P, vì thực vật chỉ có khả năng hấp thụ phosphate ở hai dạng ion hòa tan, là H2PO4 2- và HPO4 3-.
Nuôi cấy mô thực vật và một số kết quả trong vi nhân giống mía 51 1 Một số nguyên lý và vai trò của nuôi cấy mô thực vật
Thử nghiệm hiệu quả in vivo của các PGPB trên cây mía trồng trong ống nghiệm gặp khó khăn do việc tạo nguồn nguyên liệu gnotobiotic, vì cây mía không gieo trồng bằng hạt Cây mía trong ống nghiệm có thể được tạo ra qua quy trình tạo cây sạch đã được công bố, như quy trình của Lee và Bressan (2005) Sau khi xác định các dòng vi khuẩn, chúng sẽ được tái chủng vào cây mía, có thể là từng dòng đơn lẻ hoặc phối hợp Cây mía sau khi chủng có thể được nuôi cấy in vitro hoặc chuyển sang trồng trong bình Leonard trong nhà lưới để nghiên cứu tác động của vi khuẩn ở giai đoạn sớm Đối với thí nghiệm đánh giá năng suất mía, cây mía được tạo ra từ hom cho kết quả phù hợp hơn.
2.6.1 Một số nguyên lý và vai trò của nuôi cấy mô thực vật
Nuôi cấy mô thực vật, hay vi nhân giống cây, là quá trình nuôi cấy in vitro trong điều kiện vô trùng đối với tế bào, mô, cơ quan hoặc toàn bộ thực vật Bắt nguồn từ vật liệu vô tính, quá trình này diễn ra trong môi trường dinh dưỡng và điều kiện được kiểm soát, cho ra đời các dòng thực vật đồng nhất về kiểu gene và sự phát triển Điều kiện kiểm soát bao gồm dinh dưỡng đầy đủ, độ pH hợp lý, nhiệt độ và môi trường khí, lỏng thích hợp, tạo điều kiện thuận lợi cho sự sinh trưởng và nhân bản của mô thực vật (Hussain et al., 2012).
Nuôi cấy mô thực vật tận dụng tính toàn năng của tế bào thực vật, cho phép tạo ra cây hoàn chỉnh trong môi trường thích hợp Các tế bào đơn lẻ hoặc các bộ phận như lá, thân rễ, và chồi ngọn có thể được sử dụng làm nguyên liệu để tái tạo cây mới, miễn là điều kiện dinh dưỡng khoáng và liều lượng phytohormone được đảm bảo.
Môi trường dinh dưỡng chủ yếu bao gồm khoáng đa lượng và vi lượng, đường, vitamin cùng một số hợp chất hữu cơ khác Agar có thể được bổ sung để tạo môi trường đặc hoặc bán đặc tùy theo nhu cầu nuôi cấy Môi trường khoáng phổ biến hiện nay là môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) Các phytohormone thường sử dụng trong nuôi cấy mô bao gồm auxin, cytokinin và gibberellin với nồng độ phù hợp Độ pH của môi trường thường được điều chỉnh trong khoảng 5,4 – 5,8 (Hussain et al., 2012).
Nuôi cấy mô thực vật để nhân giống mang lại nhiều lợi ích so với phương pháp truyền thống, bao gồm khả năng sản xuất số lượng lớn cây con trong thời gian ngắn và đảm bảo cây con sạch bệnh nhờ quy trình khử trùng Phương pháp này cũng hữu ích cho các loại cây khó nảy mầm hoặc không có hạt, cho phép tạo ra cây con từ các bộ phận khác nhau Vi nhân giống được ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp để cung cấp giống cây, cũng như trong nghiên cứu về đặc điểm sinh lý, sinh hóa thực vật và tương tác của thực vật với môi trường.
2.6.2 Quy trình và một số kết quả trong vi nhân giống mía
Quy trình nhân giống cây mía bằng nuôi cấy mô bao gồm bốn giai đoạn chính: thiết lập điều kiện nuôi cấy vô trùng, nhân giống vô tính in vitro, chuyển cây ra vườn ươm và trồng cây ngoài đồng ruộng Trong giai đoạn nhân giống in vitro, cây mía trải qua các bước như kích hoạt sự nhân giống từ vật liệu ban đầu, khởi xướng tạo chồi trực tiếp, nhân nhanh chồi và cảm ứng tạo rễ, sau đó làm cứng cây và tách rời các cây con trước khi đưa ra vườn ươm.
Hình 2.18: Các giai đoạn cơ bản của một quy trình nhân nhanh giống mía
Mục tiêu chính của vi nhân giống mía là cung cấp số lượng lớn cây con sạch bệnh cho sản xuất và nghiên cứu Các nghiên cứu thường chú trọng vào việc phát triển môi trường nuôi cấy, đặc biệt là thành phần và nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng nhằm đạt hệ số nhân chồi cao và đảm bảo sự phát triển tốt của cây con Bài viết này sẽ trình bày một số kết quả đạt được trong nhân giống in vitro cây mía trên thế giới và tại Việt Nam sau năm 2000, nhằm làm cơ sở cho việc lựa chọn nguồn vật liệu ban đầu và chương trình hormone phù hợp cho việc tạo chồi, tạo rễ và phát triển cây hoàn chỉnh.
Vật liệu cho nhân giống mía rất đa dạng, bao gồm mô phân sinh như đỉnh sinh trưởng và đầu rễ, cũng như tế bào trục lá và lá non thông qua mô sẹo Các nghiên cứu chỉ ra rằng trong chương trình tạo chồi, cytokinin như BAP và kinetin thường được sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp với gibberellin như GA3, trong khi auxin như NAA và IBA chủ yếu được dùng cho việc tạo rễ Đối với việc tạo chồi từ mô sẹo, tổ hợp auxin như 2,4-D, IBA và NAA thường được áp dụng trước, sau đó tái sinh chồi với sự kết hợp của cytokinin và auxin.
Nồng độ sucrose và thành phần dinh dưỡng khoáng MS ảnh hưởng đến sự biệt hóa tạo chồi và tạo rễ của mía Đối với sự tạo chồi từ đỉnh sinh trưởng, tổ hợp cytokinin hiệu quả nhất là 2 mg/L BAP kết hợp với 0,25 – 0,5 mg/L kinetin, tùy thuộc vào giống mía Nếu sự tạo chồi xuất phát từ rễ, tổ hợp giữa cytokinin và gibberellin cho kết quả tốt nhất với nồng độ 0,5 – 1,0 mg/L BAP và 0,1 – 0,5 mg/L GA3, cũng tùy thuộc vào giống mía.
Nghiên cứu về cảm ứng tạo rễ từ cụm chồi để phát triển cây hoàn chỉnh cho thấy hormone NAA là phù hợp nhất với nồng độ từ 0,5 – 7,0 mg/L, trong khi IBA cũng có hiệu quả với nồng độ từ 0,5 – 1,5 mg/L Loại hormone và liều lượng cần thiết phụ thuộc vào nguồn vật liệu và giống mía khảo sát Tại Việt Nam, nghiên cứu trên giống mía VN84-4137 chỉ ra rằng môi trường MS bổ sung 1 mg/L NAA là tối ưu cho việc tạo rễ từ chồi, trong khi hai giống mía ROC26 và HB1 có nồng độ NAA thích hợp là 0,5 mg/L.
Các nghiên cứu về vi nhân giống mía cho thấy chương trình biệt hóa tạo chồi từ mô phân sinh đỉnh cần sự kết hợp giữa BAP và kinetin, trong khi việc tạo rễ từ cụm chồi thường sử dụng NAA Mặc dù Saccharum officinarum L là loài mía đường phổ biến toàn cầu, các giống khác nhau lại có phản ứng hormone khác nhau Do đó, cần tiến hành các nghiên cứu để phát triển chương trình vi nhân giống phù hợp với từng giống mía cụ thể tại địa phương.