Báo cáo thực hành CN ENZYME

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ ENZYME GVHD TS Nguyễn Minh Xuân Hồng Nhóm thực hiện 14 Thời gian Thứ 6 ca 1+2, ngày 11 tháng 12 năm 2020 Danh sách thành viên 1 Võ Thị Hồng Ngọc 18125220 DH18BQ 2 Đàng Thị Phi Nhung 18125523 DH18BQ 3 Lý Tài Quang 18125283 DH18BQ 4 Nguyễn Thị Kiều Trang 18125385 DH18BQ 5 Nguyễn Thị Thùy Trang 18125387 DH18BQ 6 Nguyễn Minh Ty 18125464 DH18BQ 7 Hà Lâm Tiểu Uyên 18125405 DH18BQ TP HCM, ngày 12 thán.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ ENZYME

GVHD: TS Nguyễn Minh Xuân Hồng

Nhóm thực hiện: 14

Thời gian: Thứ 6 ca 1+2, ngày 11 tháng 12 năm 2020

Danh sách thành viên:

1 Võ Thị Hồng Ngọc 18125220 DH18BQ

2 Đàng Thị Phi Nhung 18125523 DH18BQ

3 Lý Tài Quang 18125283 DH18BQ

4 Nguyễn Thị Kiều Trang 18125385 DH18BQ

5 Nguyễn Thị Thùy Trang 18125387 DH18BQ

6 Nguyễn Minh Ty 18125464 DH18BQ

7 Hà Lâm Tiểu Uyên 18125405 DH18BQ

TP.HCM, ngày 12 tháng 12 năm 2020

BÀI 1:

KHẢO SÁT TÍNH ẢNH HƯỞNG CỦA YẾU TỐ NGOẠI CẢNH

ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME

1 Tính đặc hiệu của enzyme

1.1 Nguyên tắc

Tính đặc hiệu của enzyme thể hiện ở điểm mỗi enzyme chỉ tác dụng lên một cơ chất nhất định Chẳng hạn amylase chỉ thủy phân polysaccharide mà không tác dụng lên disaccharide

Saccharide không cho phản ứng với Fehling vì trong phân tử không có nhóm cetose hoặc aldehide tự do Phản ứng này chỉ dương tính khi saccharose đã được thủy phân thành glucose và fructose

1.2 Hóa chất

- Dung dịch saccharose 1%

- Dung dịch tinh bột 1%

- Dung dịch Fehling A và B

- Dung dịch amylase

1.3 Tiến hành

- Chuẩn bị 2 ống nghiệm:

+ Ống 1: Cho vào 0.5 ml dung dịch amylase, thêm 1 ml dung dịch tinh bột 1% + Ống 2: Cho vào 0.5 ml dung dịch amylase, thêm 1 ml dung dịch saccharose 1%

- Đặt 2 ống vào bồn ổn định nhiệt ở 37C trong 5-10 phút

- Đem 2 ống ra làm phản ứng Fehling So sánh kết quả giữa 2 ống Nhận xét

1.4 Kết quả

Hình 1.1 Kết quả thí nghiệm tính đặc hiệu của enzyme

Cả 2 ống nghiệm đều xuất hiện kết tủa đỏ gạch, nhưng ống 1 có nhiều kết tủa hơn so với ống 2

1.5 Giải thích và kết luận

 Giải thích:

- Amylase chỉ thủy phân Polysaccharide thành Monosaccharide mà không thủy phân saccharose

- Fehling chỉ phản ứng với phân tử có nhóm cetose hoặc aldehide tự do, vì vậy ống chứa saccharose không đổi màu Còn ống chứa tinh bột bị đổi màu nhiều do tinh bột đã thủy phân thành glucose

 Kết luận:

Enzyme có tính đặc hiệu, thể hiện ở điểm chỉ tác dụng lên một cơ chất nhất định

2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme

2.1 Nguyên tắc

Vận tốc của phản ứng enzyme thường tăng khoảng 2 lần khi nhiệt độ tăng khoảng

100C Ở nhiệt độ thấp, ví dụ khoảng 00C, vận tốc xúc tác của men rất thấp, coi như không đáng kể Nhưng ở nhiệt độ này, enzyme được bảo quản tốt Ở 40 – 500C, enzyme hoạt động mạnh nhất, cao hơn 500C enzyme bắt đầu biến tính, vận tốc xúc tác giảm dần Đến 60 – 800C, enzyme mất khả năng hoạt động Ở 1000C, enzyme bắt đầu mất tác dụng

2.2 Hóa chất

- Dung dịch hồ tinh bột 1%

- Dung dịch amylase

- Dung dịch đệm pH 7

2.3 Tiến hành

Lấy 2 ống nghiệm, cho vào:

+ Ống 1: 1 ml dung dịch hồ tinh bột 1%

+ Ống 2: 0.5 ml dung dịch amylase đã pha loãng và 0.5 ml dung dịch đệm pH 7 Đặt cả 2 ống vào bình ổn nhiệt ở 300C trong 5 phút Sau đó trộn 2 ống vào nhau

và tiến hành khảo sát hoạt tính của enzyme dưới ảnh hưởng của nhiệt độ bằng cách xác định thời gian thủy giải của amylase

2.4 Kết quả

Hình 1.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme

Bảng 1 Thời gian thủy giải tinh bột của enzyme α-amylase ở nhiệt độ khác nhau

300C >10 phút

600C 6 phút

900C 2 phút

Hình 1.3 Biểu đồ biểu diễn sự biến thiên của thời gian thủy giải đối với nhiệt độ 2.5 Giải thích và kết luận

 Giải thích

- Ở nhiệt độ 30°C, sau 10 phút màu xanh vẫn chưa biến mất → luôn có tinh bột phản ứng với Iod tạo ra màu xanh → tinh bột không bị thủy giải

- Ở nhiệt độ 60°C, màu xanh biến mất sau 6 phút → tinh bột bị thủy giải nhưng chậm

- Ở nhiệt độ 90°C, màu xanh biến mất nhanh chóng sau 2 phút → enzyme phân giải gần như hoàn toàn tinh bột

 Kết luận:

- Enzyme α-amylase là enzyme thủy phân các liên kết α-1,4 trong tinh bột dẫn đến hình thành các maltodextrin hòa tan, maltose và glucose

- Nhiệt độ tối ưu cho enzyme α-amylase là 90°C

3 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme

3.1 Nguyên tắc

Hoạt tính của enzyme thể hiện trong vùng pH tương đối hẹp là pH tối ưu pH tối

ưu của một số enzyme như pepsin là 1,2 - 2,5; catalase 7,0; trypsin 8,0 - 9,0

Mức độ ion hóa của các enzyme phụ thuộc vào môi trường Enzyme có thể có hoạt tính pH cao khi ở dạng điện tích dương hay âm hoặc ở trạng thái đẳng điện

3.2 Hóa chất

- Dung dịch tinh bột 1%

- Dung dịch amylase

- Dung dịch lugol (KI 2.65g; I2 0,05g; nước cất vừa đủ 100ml )

3.3 Tiến hành

Lấy 3 ống nghiệm, cho vào:

+ Ống 1: 1ml dung dịch tinh bột 1% và 1ml dung dịch đệm pH 4

+ Ống 2: 1ml dung dịch tinh bột 1% và 1ml dung dịch đệm pH 6

+ Ống 3: 1ml dung dịch tinh bột 1% và 1ml dung dịch đệm pH 8

Sau đó cho vào mỗi ống 1ml dung dịch enzyme amylase đã pha loãng

Tiến hành khảo sát hoạt tính của enzyme dưới ảnh hưởng của pH bằng cách xác định thời gian thủy giải của enzyme amylase ( tương tự thí nghiệm 2)

Vẽ đường biểu diễn sự biến thiên của thời gian thủy giải ( phút) đối với pH Nhận xét và giải thích

3.4 Kết quả

Hình 1.4 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme

Bảng 2 Thời gian thủy giải tinh bột của enzyme α-amylase ở độ pH khác nhau

6 4.5 phút

8 >10 phút

Hình 1.4 Biểu đồ biểu diễn sự biến thiên của thời gian thủy giải đối với pH 3.5 Giải thích và kết luận

 Giải thích:

- Ở pH=4, lugol dần mất màu trong 8 phút vì ở pH này enzyme amylase bắt đầu phân giải tinh bột

- Ở pH=6, lugol mất màu trong 4,5 phút, tinh bột bị phân giải dần bởi enzyme amylase

- Ở pH=8, màu của lugol không thay đổi, vì ở môi trường pH này tinh bột không

bị phân giải nên lugol vẫn tạo màu xanh với tinh bột

 Kết luận:

Enzyme amylase hoạt động tối ưu tại pH=8

4 Ảnh hưởng của chất hoạt hóa và chất ức chế đến hoạt tính của enzyme

Chất hoạt hóa là chất có khả năng làm tăng cường tác dụng của enzyme Chúng

có bản chất hóa học khác nhau Thí dụ ion Cl- đối với α-amylase, glutathion đối với nhiều protease thực vật, cystein đối với nhiều loại enzyme có nhóm -SH hoạt động… Chất ức chế là chất kìm hãm phản ứng xúc tác của enzyme, làm giảm ái lực của enzyme đối với cơ chất hoặc làm enzyme mất khả năng kết hợp với cơ chất Thí dụ các ion Ag2+, Hg2+, Pb2+… là chất ức chế của hầu hết các enzyme

4.1 Nguyên tắc

Amylase của nước bọt (α-amylase) sẽ tăng hoạt động trong môi trường có NaCl, ngược lại CuSO4 sẽ ức chế tác dụng của enzyme này

Trong 3 ống nghiệm có chứa α- amylase và tinh bột Nếu ta cho NaCl vào ống thứ nhất, CuSO4 vào ống thứ hai, và nước vào ống thứ ba thì sau cùng một thời gian tác dụng ta sẽ thấy:

 Ống 1: tinh bột được thủy giải hoàn toàn

 Ống 2: không có sự thủy phân tinh bột

 Ống 3: tinh bột chỉ được thủy giải đến dextrin

4.2 Hóa chất

- Dung dịch tinh bột 1%

- Dung dịch amylase đã pha loãng

- Dung dịch NaCl 10%

- Dung dịch CuSO4 1%

4.3 Tiến hành

Lấy 3 ống nghiệm, cho vào:

+ Ống 1: 0,5 ml dung dịch amylase đã pha loãng và 0,5 ml NaCl 10%

+ Ống 2: 0,5 ml dung dịch amylase đã pha loãng và 0,5 ml CuSO4 10%

+ Ống 3: 0,5 ml dung dịch amylase đã pha loãng và 0,5 ml nước cất

Tiếp tục cho vào mỗi ống 1 ml dung dịch hồ tinh bột 1% Để cả 3 ống ở nhiệt độ phòng khoảng 3-5 phút Sau đó làm phản ứng Iod với tinh bột và dextrin Nhận xét và giải thích

4.4 Kết quả

Hình 1.5 Trước phản ứng Iod

Hình 1.6 Sau phản ứng Iod

Sau khi nhỏ Iod vào 3 ống nghiệm, ta thấy:

- Ống 1 chuyển sang màu vàng nâu

- Ống 2 chuyển sang màu xanh đen

- Ống 3 chuyển sang màu xanh dương đậm

4.5 Giải thích và kết luận

 Giải thích

- Ống 1: có màu vàng nâu do enzyme amylase tăng hoạt động trong môi trường

có NaCl, khi đó tinh bột được thủy phân hoàn toàn, không còn tinh bột để tác dụng với Iod và chỉ còn lại màu nâu của Iod

- Ống 2: Có màu xanh đen do enzyme amylase bị ức chế bởi CuSO4 và không thể thủy phân tinh bột, lượng tinh bột đó đã tác dụng với Iod và tạo ra màu xanh đen

- Ống 3: có màu xanh dương đậm, do enzyme amylase đã thủy giải một phần tinh bột thành dextrin, lượng tinh bột dư đã tác dụng với Iod tạo ra màu xanh dương đậm

 Kết luận:

NaCl làm tăng khả năng hoạt động của enzyme amylase còn CuSO4 làm ức chế khả năng hoạt động của nó

BÀI 3: ENZYME BROMELIN

1 Giới thiệu chung

Bromelin là Protease có nguồn gốc thực vật Bromelin có nhiều trong các bộ phận

khác nhau của cây dứa: thân, vỏ, chồi, quả,

Bromelin có thể ly trích như sau: Dứa xanh đem gọt vỏ bằng dao inox, cân xác định trọng lượng lấy phần thịt, lõi Mắt cho vào máy xay sinh tố xay nát Đổ ra trên vải màng, vắt thật kỹ, đem lọc để loại bỏ chất xơ

2 Ứng dụng enzyme bromelin trong làm mềm thịt

2.1 Nguyên liệu

Thịt bò Úc

2.2 Tiến hành

- Thịt được cắt thành 3 lát mỏng giống nhau theo chiều dọc để có thể quan sát được các sớ thịt

- Chuẩn bị 3 dĩa, bỏ phần thịt đã cắt lần lượt vào 3 dĩa và bổ sung lần lượt

 Dĩa 1: Bổ sung 20 ml nước dứa đã trích ly, ngâm trong ít nhất 2 giờ

 Dĩa 2: Bổ sung 20 ml enzyme protease đã pha loãng 100 lần, ngâm trong ít nhất 2 giờ

 Dĩa 3: Không xử lý (đối chứng)

- Sau 2 giờ, đun nóng thịt trong các dĩa trên trong 5 phút ở 100°C Quan sát, đánh giá và so sánh mùi vị, cấu trúc của thịt giữa các mẫu

2.3 Kết quả

Hình 3.1 Thịt sau khi được ngâm trong 2 giờ

Hình 3.2 Thịt sau khi được đun sôi

- Dĩa 1: không thấy rõ sớ thịt và hơi bở nhẹ, có mùi tanh nhẹ của thịt và mùi thơm của dứa, vị hơi chua

- Dĩa 2: thấy rõ sớ thịt, mùi rất tanh, độ mềm vừa phải

- Dĩa 3: thấy sớ thịt nhưng không rõ bằng dĩa 2, có mùi tanh đặc trưng của thịt, mềm

2.4 Giải thích và kết luận

 Giải thích

- Dĩa 1: trong dứa có enzyme Bromeline làm thủy phân một phần protein trong thịt thành các acid amin phá vỡ thành phần cấu trúc làm thịt mềm hơn, giảm độ tanh của thịt

- Dĩa 2: enzyme protease tạo độ mềm vừa phải cho thịt, góp phần làm tăng hương

vị của thịt

- Dĩa 3: không có tác dụng của enzyme nên thịt vẫn giữ nguyên độ mềm và hương

vị tự nhiên

 Kết luận

Enzyme Bromeline có tác dụng làm mềm thịt nên thường được ứng dụng trong nấu ăn

Bài 4: ENZYME PECTINASE

1 Giới thiệu chung

Pectinase là tên gọi chung một nhóm enzyme có khả năng phân giải pectin, một dạng glucid cao phân tử có nhiều ở thực vật

Pectinase là enzyme có nhiều ứng dụng lớn thứ bas au amylase và protease Trong công nghiệp, đặc biệt là trong công nghiệp thực phẩm, nó được dùng nhiều để tang hiệu suất ép, làm trong nước quả, rượu quả Pectinase cũng đưuọc dùng trong sản xuất bột

cà phê hòa tan, để tách lớp nhớt chứa nhiều pectin ở hạt Pectinase do vi sinh vật tổng hợp có tác dụng trong quá trình ngâm đay, gai để tách các sợi xellose nhưng không phá hủy sợi Enzym pectinase đưuọc sử dụng rộng rãi trong sản xuất nước quả để làm tang tốc độ lọc và hiệu suất ép, đồng thời trong quá trình tồn trữ sẽ không bị đục do pectin lắng trở lại Ngoài ra dùng enzyme pectinase trích li dược liệu với tỉ lệ thích hợp đã khắc phục được các nhược điểm như tốn nhiều nguyên liệu và thời gian, tách không kiệt được các chất trong bã thuốc, dược liệu bị keo nhầy không chiết được, sau một thời gian thuốc đục trở lại

 Pectin

Pecin là cơ chất của enzyme pectinase Trong thực vật, pectin có vai trò quan trọng tạo thành vách tế bào thực vật, gắn kết các tế bào vào nhau và hiện diện trong phức với cellulose, đóng vai trò là thành phần chủ yếu của lớp xơ trong cơ cấu vách tế bào thực vật thượng đẳng

Trong thực vật, pectin tồn tại 2 dạng:

- Dạng protopectin không tan trong nước, tồn tại chủ yếu ở thành tế bào, thường

ở dạng liên kết với polysaccharide khác như arabane, tinh bột, cellulose

- Dạng pectin hòa tan chủ yếu ở dịch tế bào

Cấu tạo pectin chủ ếu là một mạch chính, gồm các gốc acide-galacturonic liên kết với nhau bằng liên kết 1,4-glucoside, còn gọi là pectin Pectin hòa tan trong tự nhiên là ester metilic chủa acid pectic

Pectin hay pectin hòa tan là ester metylic của acid polygalacturonic cao phân tử acid pectinic là acid polygalacturonic trong đó có một phần nhỏ nhóm cacboxy được

ester hóa bởi methanol Acid pectin là acid polygalacturonic cao phân tử đã hoàn toàn giải phóng khỏi nhóm methoxy

2 Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp so màu

2.1 Nguyên tắc

Là phương pháp dựa trên việc so sánh cường độ màu của dung dịch nghiên cứu với cường độ màu của dung dịch tiêu chuẩn có nồng độ xác định Dùng phương pháp

so màu chủ yếu để xác định lượng nhỏ các chất phân tích Phương pháp này mất ít thời gian so với các phương pháp hóa học khác Nguyên tắc của phương pháp này là xác định lượng acid galacturonic được tạo bởi quá trình thủy phâm pectinase Cơ chất pectin không kết tủa bởi ZnSO4

Định nghĩa đơn vị hoạt tính:

Một đơn vị hoạt tính pectinase là lượng enzyme trong điều kiện tiêu chuẩn (ở nhiệt

độ 30℃, pH 3,9 – 4,1), thời gian phản ứng là 60 phút với nồng độ pectin trong môi trường phản ứng là 0,66%, mức độ thủy phân pectin là 30%) có khả năng xúc tác, làm biến đổi 1g pectin sau 60 phút thành acid galacturonic

2.2 Hóa chất

- Dung dịch pectin 1%

- Dung dịch ZnSO4 15%

- Dung dịch enzyme pectinase 1.5%

- Dung dịch Anthrone 0.2% (C6H4COC6H4CH2) trong acid sulfuric đậm đặc

2.3 Tiến hành

- Chuẩn bị 2 ống nghiệm (1 ống thí nghiệm, 1 ống đối chứng)

- Cho 2ml dung dịch pectin 1% vào cả 2 ống nghiệm

- Cho 1ml dung dịch enzyme pectinase vào ống thí nghiệm và 1ml nước vào ống đối chứng

- Lắc đều cả 2 ống rồi cho vào tủ ấm ở nhiệt độ 30℃ (nhiệt độ phòng)

- Sau 60 phút lấy ra và thêm vào mỗi ống 2ml ZnSO4 15%, đem lọc qua giấy lọc, dung dịch lọc được đem pha loãng 50 lần dùng cho phản ứng với Anthrone

- Lấy 2,5ml dung dịch lọc đã pha loãng ở mỗi ống cho vào 2 ống nghiệm, rồi cho 5ml Anthrone vào 2 ống, lắc mạnh trong 10 phút Sau đó đặt 2 ống trong nồi thủy ở nhiệt độ 70℃ trong thời gian 12 phút rồi lấy ra làm nguội đến nhiệt độ phòng

- Pha loãng dung dịch ở mỗi ống 10 lần (vì màu khá đậm, đo không được nên pha loãng dung dịch thêm 2 lần nữa)

- Tiến hành đo giá trị OD ở bước sóng X = 584nm

2.4 Kết quả

Hình 4.1 Trước khi lọc

Hình 4.2 Sau khi pha loãng 60 lần

Tính hoạt độ:

Giá trị đo OD của thí nghiệm: ODTN = 0,31

Giá trị đo OD của đối chứng: ODĐC = 0,17

∆𝑂𝐷 = ODTN - ODĐC = 0.31- 0.17 = 0,14

Hoạt tính enzyme pectinase = 0,34 × ∆𝑂𝐷−0,0104

2 = 0,0186 Trong đó: m là lượng enzyme lấy để tiến hành phản ứng (g hay ml)

2.5 Kết luận

ODTN > ODĐC và hoạt tính enzyme pectinase = 0,0186 → Enzyme pectinase có khả năng xúc tác, làm pectin bị thủy phân cho ra acid galactorunic Acid galactorunic tác dụng với ZnSO4 và dung dịch Anthrone trong acid sulfuric đậm đặc, tạo kết tủa

3 Ứng dụng của enzyme pectinase làm trong nước ép trái cây

3.1 Nguyên liệu - Hóa chất

- Trái cây theo mùa (táo)

- Dung dịch pectinase 1%

3.2 Tiến hành

- Cân 50g táo, ép lấy dịch quả, pha loãng thành 100ml với nước cất

- Hút 18ml dung dịch táo cho vào mỗi ống nghiệm của 5 ống nghiệm khác nhau

- Thêm dung dịch pectinase 1% vào từng ống nghiệm với thể tích lần lượt trong các ống là 0; 0,5; 1; 1,5 và 2 ml Đánh dấu các ống nghiệm

- Sau đó thêm nước cất vào sao cho mỗi ống cho đủ 20 ml (theo thứ tự các ống là 2; 1,5; 1; 0,5; 0 ml nước cất )

- Để tất cả các ống nghiệm ở 50-55 oC trong 60 phút

- Lọc qua giấy lọc, ngâm các ống nghiệm đựng dung dịch lọc trong nước lạnh trong 10 phút và so sánh độ trong của 5 mẫu Giải thích

3.3 Kết quả

Hình 4.3 Nước ép quả có chứa enzyme