BÁO CÁO THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ ENZYME NLU (NEW)

BÁO CÁO THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ ENZYME NLU (NEW)BÁO CÁO THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ ENZYME NLU (NEW)BÁO CÁO THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ ENZYME NLU (NEW)BÁO CÁO THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ ENZYME NLU (NEW)BÁO CÁO THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ ENZYME NLU (NEW)BÁO CÁO THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ ENZYME NLU (NEW)BÁO CÁO THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ ENZYME NLU (NEW)BÁO CÁO THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ ENZYME NLU (NEW)BÁO CÁO THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ ENZYME NLU (NEW)BÁO CÁO THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ ENZYME NLU (NEW)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM

BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH MÔN CÔNG NGHỆ ENZYME

GVHD: TS Nguyễn Minh Xuân Hồng

Nhóm thực hànn: Nhóm 40

Thời gian thực hành:

- Thứ 5, ca 1, 10/03/2022

- Thứ 5, ca 3, 10/03/2022

Danh sách thành viên của nhóm:

1 Lê Minh Tiến – 19125385 – DH19VT

7 Nguyễn Thị Thanh Hiền – 19125099 – DH19BQ

8 Ngô Thanh Hoài – 19125110 – DH19BQ

MỤC LỤC

PHẦN I: GIỚI THIỆU CHUNG……… ……… 3

PHẦN II: CÁC BÀI THỰC HÀNH……….……… 4

Bài 1 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA YẾU TỐ NGOẠI CẢNH ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME……… 4

Tính đặc hiệu của enzyme……… ……… …………4

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của Enzyme 6

Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme… 9

Ảnh hưởng của chất hoạt hóa và chất ức chế đến hoạt tính của enzyme 11

Bài 2: ENZYME BROMELINE 14

Bài 3: ENZYME PECTINASE 16

Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp so màu… 16

Ứng dụng pestinase trong nước ép trái cây 18

PHẦN III: TÀI LIỆU THAM KHẢO………21

PHẦN I: GIỚI THIỆU CHUNG

Thực phẩm là nguồn cung cấp dinh dưỡng duy trì sự sống cho con người Ngoài ra, chúng còn là đời sống văn hóa tinh thần của con người Đối với đời sống xã hội ngày một phát triển, kéo theo đó nhu cầu về thực phẩm cũng dần được nâng cao Công nghệ Enzyme là một trong những công nghệ hiện đại được sử dụng rất rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm góp phần tạo nên sự đa dạng, phong phú, nâng cao chất lượng sản phẩm và mang lại nhiều hiệu quả trong lĩnh vực chế biến thực phẩm Chúng em, với vai trò học tập, tiếp thu kiến thức và tìm hiểu về công nghệ Enzyme Qua buổi thực hành, chúng em được tìm hiểu về các bài: ảnh hưởng của các yếu tố ngoại cảnh đến hoạt tính của Enzyme, Enzyme bromelin, Enzyme pectinase và có thể biết được các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của Enzyme cũng như các tác động, biến đổi, tương tác, của chúng đến thực phẩm Từ đó, chúng em có thể ứng dụng vào thực tế trong các quá trình chế biến, bảo quản, sử dụng thực phẩm

PHẦN 2: CÁC BÀI THỰC HÀNH

BÀI 1 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA YẾU TỐ NGOẠI CẢNH

ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME

I Tính đặc hiệu của enzyme:

1 Nguyên tắc:

- Tính đặc hiệu của mỗi enzyme thể hiện ở điểm: Mỗi enzyme chỉ tác dụng lên một cơ chất nhất định Chẳng hạn amylase chỉ thủy phân polysaccharide mà không tác dụng lên disaccharide

- Saccharide không cho phản ứng với Fehling vò trong phân tử không có nhóm cetose hoặc aldehyde tự do Phản ứng này chỉ dương tính khi saccharose đã được thủy phân thành fructose và glucose

4 Giải thích:

- Khi cho enzyme vào dung dịch chứa tinh bột, tinh bột sẽ bị thủy phân tạo ra 1 lượng nhỏ đường khử và sau đó bị enzyme phân cắt thành 1 lượng dextrin, khi nhỏ Fehling vào và ngâm trong nước nóng quá trình phân cắt ngày càng mạnh tạo ra nhiều dextrin hơn do đó mà màu đỏ gạch xuất hiện và ngày 1 đậm hơn Do Dextrin là hỗn hợp của các polyme của các đơn vị D- glucose liên kết bởi các liên kết glycosidic α- (1 → 4) hoặc α- (1 → 6) nên sẽ phản ứng với thuốc thử Fehling cho ra kết tủa đỏ gạch

- Ống nghiệm chứa dung dịch Saccharose khi cho enzyme vào ở nhiệt độ phòng sẽ không thể phân cắt được vì không có tính khử ( không chứa liên kết 1- 4 glucoside) vì thế enzyme không thể phân cắt ở nhiệt độ thường và không hiện tượng với thuốc thử Fehling Tuy nhiên khi để ống nghiệm trong nhiệt độ sôi, enzyme đã phân cắt 1 lượng nhr saccharose thành đường khử Vì thế thời gian chuyển sang màu đỏ gạch nhỏ lâu và nhạt hơn ống chứa tinh bột

II Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của Enzyme:

1 Nguyên tắc:

- Ở nhiệt độ 0°C: vận tốc xúc tác của enzyme rất thấp, hầu như không đáng kể tuy nhiên enzyme được bảo quản tốt ở nhiệt độ này

- Ở nhiệt độ từ 30 - 50°C: enzyme hoạt động mạnh nhất

- Ở nhiệt độ từ 60 - 80°C: enzyme mất khả năng hoạt động

- Ở nhiệt độ 100°C: enzyme bắt đầu mất tác dụng

* Ống 1: dùng pipet 5ml hút hút 1ml dung dịch tinh bột 1% cho vào ống nghiệm

* Ống 2: dùng pipet 1ml hút 0,1 ml dung dịch amylase đã pha loãng cho vào ống nghiệm, sau đó hút 0,5 ml dung dịch pH 7 cho vào ống nghiệm, lắc đều

+ Để hai ống nghiệm ngoài nhiệt độ phòng khoảng 5 phút

+ Trộn hai ống nghiệm lại với nhau, lắc đều

+ Cứ sau 1 phút: nhỏ 1 giọt lugol lên mặt kiếng, sau đó nhỏ vào đó 1 giọt hỗn hợp trên

Khi nào thấy màu xanh không xuất hiện nữa thì dừng lại

- Ở nhiệt độ 60°C:

+ Lấy 2 ống nghiệm

* Ống 1: dùng pipet 5ml hút hút 1ml dung dịch tinh bột 1% cho vào ống nghiệm

* Ống 2: dùng pipet 1ml hút 0,1 ml dung dịch amylase đã pha loãng cho vào ống nghiệm, sau đó hút 0,5 ml dung dịch pH 7 cho vào ống nghiệm, lắc đều

+ Đem 2 ống nghiệm đun cách thủy ở nhiệt độ 60°C trong khoảng 5 phút

+ Trộn hai ống nghiệm lại với nhau, lắc đều

+ Cứ sau 1 phút: nhỏ 1 giọt lugol lên mặt kiếng, sau đó nhỏ vào đó 1 giọt hỗn hợp trên Khi nào thấy màu xanh không xuất hiện nữa thì dừng lại

- Ở nhiệt độ 90°C:

+ Lấy 2 ống nghiệm

* Ống 1: dùng pipet 5ml hút hút 1ml dung dịch tinh bột 1% cho vào ống nghiệm

* Ống 2: dùng pipet 1ml hút 0,1 ml dung dịch amylase đã pha loãng cho vào ống nghiệm, sau đó hút 0,5 ml dung dịch pH 7 cho vào ống nghiệm, lắc đều

+ Đem 2 ống nghiệm đun cách thủy ở nhiệt độ 900C trong khoảng 5 phút

+ Trộn hai ống nghiệm lại với nhau, lắc đều

+ Cứ sau 1 phút: nhỏ 1 giọt lugol lên mặt kiếng, sau đó nhỏ vào đó 1 giọt hỗn hợp trên Khi nào thấy màu xanh không xuất hiện nữa thì dừng lại

+ Vẽ đường biểu diễn sự biến thiên của thời gian thủy giải (phút) với nhiệt độ Nhận xét, giải thích?

4 Kết quả:

- Ở nhiệt độ phòng (30°C) nhóm có được thời gian thủy giải của enzyme amylase là 11 phút

- Ở nhiệt độ 60°C nhóm có được thời gian thủy giải của enzyme amylase là 32 phút

- Ở nhiệt độ 900C nhóm có được thời gian thủy giải của enzyme amylase là 8 phút

- Vẽ đường biểu diễn sự biến thiên của thời gian thủy giải (phút) đối với nhiệt độ

4 Nhận xét và giải thích:

- Ở nhiệt độ 60°C thì thời gian thủy giải của amylase là lâu nhất vì khi ở nhiệt độ cao enzyme đã bị biến tính dẫn đến mất khả năng hoạt động nên thời gian thủy phân kéo dài đến 32 phút

- Ở nhiệt độ 900C thì thời gian thủy giải của amylase là nhanh nhất Theo lý thuyết thì thời gian thủy giải của amylase sẽ lâu nhất vì ở 90°C enzyme bắt đầu mất tác dụng, nhưng kết quả của nhóm có được với thời gian nhanh nhất có thể là do thao tác trong quá trình làm thí nghiệm như: nhiệt độ không đảm bảo trong quá trình đun, thao tác thí nghiệm của nhóm chậm nên nhiệt độ của dung dịch giảm dần ( trong quá trình trộn 2 dung dịch lại với nhau) sau khi lấy ra khỏi bếp đun

- Ở nhiệt độ 30°C thì thời gian thủy giải của amylase tương đối nhanh vì đây là khoảng nhiệt độ thích hợp để enzyme hoạt động mạnh nhất

III Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme:

- Lấy 3 ống nghiệm cho vào:

● Ống nghiệm 1: 1 ml dung dịch hồ tinh bột 1% và 1 ml dung dịch đệm pH 4

● Ống nghiệm 2: 1 ml dung dịch hồ tinh bột 1% và 1 ml dung dịch đệm pH 6

● Ống nghiệm 3: 1ml dung dịch hồ tinh bột 1% và 1 ml dung dịch đệm pH 8

- Sau đó cho vào mỗi ống nghiệm 1 ml dung dịch enzyme amylase đã pha loãng

Tiến hành khảo sát hoạt tính của enzyme dưới ảnh hưởng của pH bằng cách xác định thời gian thủy giải của amylase (tương tự thí nghiệm 2)

- Vẽ đường biểu diễn sự biến thiên của thời gian thủy giải (phút) đối với pH Nhận xét, giải thích

- Vẽ đường biểu diễn sự biến thiên của thời gian thủy giải (phút) đối với pH

5) Nhận xét và giải thích:

- Tại pH=6, thời gian thủy giải của amylase là ngắn nhất, đồng nghĩa với việc amylase hoạt động mạnh ở pH=6; tại pH=4 và pH=8, thời gian thủy giải cao suy ra amylase hoạt động kém ở các pH này

- Mỗi enzyme sẽ có một pH tối ưu riêng, tại các giá trị pH tối ưu này thì enzyme sẽ phản ứng mạnh nhất Enzyme amylase có pH tối ưu là 5.6-6.9 Vì vậy nó có hoạt tính mạnh nhất ở pH=6

IV Ảnh hưởng của chất hoạt hóa và chất ức chế đến hoạt tính của enzyme:

Chất hoạt hóa là chất có khả năng làm tăng cường tác dụng của enzyme Chúng có bản chất hóa học khác nhau Thí nghiệm ion Cl- đối với α-amylase, glutathione đối với nhiều protease thực vật, cystein đối với nhiều loại enzyme, làm giảm ái lực của

enzyme đối với cơ chất hoặc làm enzym mất khả năng kết hợp với cơ chất Thí dụ các ion Ag2+, Hg2+, Pb2+,… là chất ức chế của hầu hết các enzyme

CuSO4 vào ống thứ hai, và nước vào ống thứ 3 thì sau cùng một thời gian tác dụng ta sẽ thấy

● Ống 1: tinh bột được thủy giải hoàn toàn

● Ổng 2: không có sự thủy phân tinh bột

● Ống 3: tinh bột chỉ được thủy giải đến dextrin

* Ống 1: 0,5ml dung dịch amylase đã pha loãng và 0,5ml NaCl 1%

* Ống 2: 0,5ml dung dịch amylase đã pha loãng và 0,5ml CuSO4 1%

* Ống 3: 0,5ml dung dịch amylase đã pha loãng và 0,5ml nước cất

- Tiếp tục cho vào mỗi ống 1ml dung dịch hồ tinh bột 1%, lắc đều Để cả 3 ống ở nhiệt

độ phòng khoảng 3-5 phút Sau đó cho 1-2 giọt thuốc thử lugol hoặc iod Nhận xét và giải thích

4) Kết quả:

Ba ống nghiệm trước và sau khi cho thuốc thử lugol

5) Nhận xét và giải thích:

- Ống 1: Chỉ xuất hiện màu thuốc thử, không xuất hiện màu xanh tím đặc trưng chứng

tỏ tinh bột đã bị enzyme amylase thủy phân hoàn toàn nên khi cho lugol vào thì môi trường có màu của lugol Như vậy, sự xuất hiện của NaCl trong thí nghiệm như là 1 chất xúc tác đẩy nhanh quá trình thủy phân tinh bột của enzyme amylase, nên tinh bột đã bị thủy phân hoàn toàn trong thời gian ngắn Vì vậy, NaCl là chất hoạt hóa

- Ống 2: Có màu xanh tím chứng tỏ tinh bột không bị thủy phân nên khi cho thuốc thử lugol vào thì môi trường có màu xanh tím đặc trưng (Vì ở nhiệt độ phòng tinh bột có phân tử amylose dạng xoắn theo kiểu lò xo có lỗ rỗng nên tinh bột hấp thụ iod trong lugol cho màu xanh tím đặc trưng) Như vậy, sự xuất hiện của CuSO4 trong thí nghiệm

đã ức chế quá trình thủy phân tinh bột của enzyme amylase Vì vậy, CuSO4 là chất ức chế

- Ống 3: Có màu của thuốc thử Tinh bột bị thủy phân 1 phần thành dextrin nhưng do enzyme amylase cần thời gian để thủy phân tinh bột nên màu xanh tím bị mất màu dần sau khi xuất hiện Thời gian diễn ra phản ứng lâu hơn ống 1 nhưng vẫn có xảy ra Vì vậy nước không phải là chất xúc tác cũng không phải là chất ức chế

Bài 2: ENZYME BROMELINE

Ứng dụng enzyme bromeline trong làm mềm thịt

Bromeline là protease có nguồn gốc thực vật Bromeline có nhiều trong các phần khác nhau của cây dứa: quả, chồi, thân, vỏ,…

1) Nguyên tắc:

Bromeline là một enzyme giúp thủy phân protein (có trong thịt cá) thành các axit amin

có tác dụng tốt trong việc tiêu hóa và phân giải lượng calo thừa trong cơ thể

● Dĩa 1: Bổ sung 20ml nước dứa, ngâm trong ít nhất 2 giờ

● Dĩa 2: Bổ sung 20 ml enzyme protease đã pha loãng 10 lần, ngâm trong ít nhất 2 giờ

● Dĩa 3: Không xử lý (đối chứng), bổ sung 20ml nước, ngâm trong ít nhất 2 giờ Sau 2 giờ, đun nóng thịt trong các đĩa trên trong 5 phút ở 1000C Quan sát, đánh giá và

so sánh mùi vị, cấu trúc của thịt giữa các mẫu

4) Thảo luận:

a Kết quả:

Hình ảnh thịt trước và sau khi hoàn thành thí nghiệm

- Dĩa 1 (nước dứa): Thịt có vị chua nhất, ít dai nhất, mềm, dễ rã

- Dĩa 2 (enzyme protease): Thịt có vị chua, thơm, có độ dai

- Dĩa 3 (đối chứng): Thịt có vị ngọt, thịt dai nhất

b) Nhận xét và giải thích:

- Dĩa 1: Thịt mềm nhất do trong dứa có enzyme bromelain có khả năng phân cắt các liên kết peptide nội phân tử protein để chuyển phân tử protein thành các đoạn nhỏ gọi là các peptide

- Dĩa 2: Thịt mềm do enzyme protease có tác dụng thủy phân protein có trong thịt làm mềm cấu trúc thịt

- Dĩa 3: Thịt còn dai, thơm mùi thịt do không có tác dụng của enzyme

5 Kết luận:

- Enzyme bromeline trong dứa có tác dụng làm mềm thịt và tăng hương vị thơm ngon,

vì thế được ứng dụng rộng rãi trong chế biến thực phẩm: nhà nấu, trong công nghiệp,… Bên cạnh đó, enzyme protease có tác dụng làm mềm thịt và tăng hương vị, nhưng có tác dụng thấp hơn enzyme bromeline Vì thế, tùy vào mục đích sử dụng, nhu cầu của mỗi người, mỗi công ty mà sử dụng loại enzyme phù hợp để được kết quả tốt nhất

BÀI 3: ENZYME PECTINASE

⮚ Enzyme Pectinase là một loại enzyme được tìm thấy trong thành tế bào thực vật Enzyme này chuyển hóa pectin thành pectic acid bằng cách xúc tác quá trình khử este của nhóm methoxyl trong pectin

⮚ Pectinase hiện là một phần không thể thiếu trong các ngành công nghiệp nước ép trái cây và các ứng dụng công nghệ sinh học khác, bởi vì chúng giúp chất lượng nước ép được trong, đồng nhất và ổn định khi sản xuất với quy mô lớn Chúng còn được sử dụng trong dinh dưỡng trẻ em, chiết xuất dầu, nước cam đóng hộp, chiết xuất đường từ quả chà là

I Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp so màu:

1) Nguyên tắc:

Là phương pháp dựa trên việc so sánh cường độ màu của dung dịch nghiên cứu với dung dịch tiêu chuẩn có nồng độ xác định Phương pháp này mất ít thời gian hơn các phương pháp hóa học khác Nguyên tắc của phương pháp này là xác định lượng acid galacturonic được tạo ra nhờ sự thủy phân của enzyme pectinase Cơ chất pectin không tạo kết tủa bởi ZnSO4

- Sau 60 phút, thêm 2ml ZnSO4 15% vào ống nghiệm, sau đó đem lọc qua giấy lọc

● Dung dịch lọc được đem pha loãng 5 lần để làm phản ứng với Anthrone

● Lấy 5ml dung dịch Anthrone cho vào ống nghiệm, sau đó cho 2,5ml dung dịch lọc đã pha loãng, lắc mạnh trong 10 phút Tiếp tục cho vào nồi cách thủy ở 70°C/12 phút rồi lấy ra làm nguội đến nhiệt độ phòng Pha loãng 10 lần và tiến hành đo giá trị OD ở bước sóng X = 584 nm

● Làm một ống nghiệm đối chứng bằng cách thay dung dịch enzyme bằng nước cất rồi tiến hành đo giá trị OD

4) Kết quả:

Trước và sau khi cho Anthrone vào dung dịch (Pha loãng 20 lần)

+ OD đối chứng = 0,64

+ OD thí nghiệm = 0,92

=> ΔOD = OD thí nghiệm – OD đối chứng = 0,92 – 0,64 = 0,28

Vậy, ta tính được hoạt tính pectinase bằng 0,0848 (UI/ml).Với:

- OD: mật độ quang của dung dịch sau phản ứng ở bước sóng X = 584nm

- M: thể tích của dung dịch phản ứng (ml)

5) Giải thích và kết luận:

- Một đơn vị hoạt tính pectinase khi thủy phân pectin ở điều kiện chuẩn (pH = 3.9 – 4.1,

thời gian 60 phút, nhiệt độ 30°C, thủy phân pectin ở nồng độ 0,66%, mức độ thủy phân

là 30%) làm biến đổi 1ml pectin thành acid galacturonic

- Với kết quả thu được 0,0848 (UI/ml) hoạt tính của pectinase sau 60 phút biến đổi được

0,0848 ml pectin thành acid galacturonic

II Ứng dụng pectinase trong nước ép trái cây:

1 Nguyên tắc:

Enzyme pectinase là một nhóm enzyme thủy phân các chất pectin, sản phẩm tạo thành

là acid galacturonic, galactose, methanol Enzyme pectinase được sử dụng rộng rãi trong sản xuất nước quả để làm tăng tốc độ lọc và hiệu suất ép, đồng thời trong quá trình tồn trữ nước quả sẽ không bị đục do pectin bị lắng trở lại

- Cân 50g táo, rửa sạch, xay nhuyễn với 100ml nước cất sau đó lọc lấy dịch

- Dùng pipet hút 18ml dịch trên cho vào ống nghiệm của 5 ống khác nhau

- Thêm dung dịch pectinase 1% vào từng ống nghiệm với thể tích tuần tự trong các ống

là 0; 0,5; 1; 1,5 và 2ml

- Sau đó thêm nước cất vào cho mỗi ống đủ 20ml

- Để tất cả các ống nghiệm ở 50-550C trong 60 phút

- Sau đó lọc qua giấy lọc, đem các ống nghiệm chứa dịch sau lọc ngâm trong nước lạnh

trong 10 phút, so sánh độ đục trong các mẫu và giải thích

có sự khác nhau về thời gian chảy qua giấy lọc tốc độ chảy giảm dần từ ống 1 đến ống

3, dung dịch trong ống 3; 4; 5 có tốc độ chảy qua giấy lọc gần như nhau

5 Giải thích:

- Quá trình lọc giúp cải thiện chỉ tiêu độ trong của nước ép, sau quá trình xử lý dịch ép với enzyme pectinase, mạch pectin bị cắt nhỏ từ đó làm giảm độ nhớt của dịch ép (giải thích cho sự khác nhau về thời gian chảy của các dung dịch qua giấy lọc) Tốc độ chảy