Thuc hanh CN enzyme 2020

Baøi 1 0 Tröôøng Ñaïi Hoïc Noâng Laâm TPHCM Khoa Coâng Ngheä Thöïc Phaåm BỘ MÔN HÓA SINH THỰC PHẨM GIAÙO TRÌNH THÖÏC TAÄP COÂNG NGHEÄ ENZYME (Löu haønh noäi boä) 2020 1 Baøi 1 KHAÛO SAÙT AÛNH HÖÔÛNG CUÛA YEÁU TOÁ NGOAÏI CAÛNH ÑEÁN HOAÏT TÍNH CUÛA ENZYME 1 Tính Ñaëc Hieäu Cuûa Enzyme 1 1 Nguyeân taéc Tính ñaëc hieäu cuûa enzyme theå hieän ôû ñieåm moãi enzyme chæ taùc duïng leân moät cô chaát nhaát ñònh Chaúng haïn amylase chæ thuûy phaân polysaccharide maø khoâng taùc duïng leân disaccharide Sac.

Trường Đại Học Nông Lâm TPHCM Khoa Công Nghệ Thực Phẩm

BỘ MƠN HĨA SINH THỰC PHẨM

GIÁO TRÌNH THỰC TẬP

CÔNG NGHỆ ENZYME

(Lưu hành nội bộ)

2020

Bài 1

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA YẾU TỐ NGOẠI CẢNH

ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME

1 Tính Đặc Hiệu Của Enzyme

1.1 Nguyên tắc

Tính đặc hiệu của enzyme thể hiện ở điểm mỗi enzyme chỉ tác dụng lên một cơ chất nhất định Chẳng hạn amylase chỉ thủy phân polysaccharide mà không tác dụng lên disaccharide

Saccharose không cho phản ứng với Fehling vì trong phân tử không có nhóm cetose hoặc aldehide tự do Phản ứng này chỉ dương tính khi saccharose đã được thủy phân thành glucose và fructose

1.2 Hóa chất

- dung dịch saccharose 1%

- dung dịch tinh bột 1%

- dung dịch Fehling A và B

- dung dịch amylase

Cho vào hai ống nghiệm, mỗi ống 0,5 ml dung dịch amylase Thêm 1 ml dung dịch tinh bột 1% vào ống thứ nhất và 1 ml dung dịch saccharose 1% vào ống thứ hai Đặt 2 ống vào bồn ổn nhiệt ở 37oC trong 5-10 phút

Sau đó đem hai ống ra làm phản ứng Fehling So sánh kết quả giữ 2 ống Nhận xét

2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme

2.1 Nguyên tắc

Vận tốc của phản ứng enzyme thường tăng khoảng hai lần khi nhiệt độ tăng khoảng 100C Ở nhiệt độ thấp, ví dụ khoảng 0oC, vận tốc xúc tác của men rất thấp, coi như không đáng kể Nhưng ở nhiệt độ này, enzyme được bảo quản tốt Ở 40-50oC, enzyme hoạt động mạnh nhất, cao hơn 50oC, enzyme bắt đầu biến tính, vận tốc xúc tác giảm dần Đến 60-80oC, enzyme mất khả năng hoạt động Ở 100oC, enzyme bắt đầu mất tác dụng

2.2 Hóa chất

- dung dịch tinh bột 1%

- dung dịch amylase

2.3 Tiến hành

Lấy 2 ống nghiệm, cho vào:

- ống 1: 1 ml dung dịch hồ tinh bột 1%

- ống 2: 0,5 ml dung dịch amylase đã pha lỗng và 0,5 ml dung dịch đệm pH 7

Đặt cả 2 ống vào bình ổn nhiệt ở 30oC trong 5 phút Sau đĩ trộn 2 ống vào nhau và tiến hành khảo sát hoạt tính của enzyme dưới ảnh hưởng của nhiệt độ bằng cách xác định thời gian thủy giải của amylase

Phương pháp xác định thời gian thủy giải của amylase: Cứ sau mỗi 1 phút, nhỏ 1

giọt dung dịch lugol (hoặc iod) lên mặt kiếng, sau đĩ nhỏ vào đĩ 1 giọt hỗn hợp dung dịch Khi nào khơng thấy màu xanh xuất hiện nữa là lúc tinh bột đã bị thủy phân hồn tồn bởi amylase

Tương tự như vậy, khảo sát ở các mức nhiệt độ khác như: 60oC, 90oC

Vẽ đường biểu diễn sự biến thiên của thời gian thủy giải (phút) đối với nhiệt độ Nhận xét Giải thích

3 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme

3.1 Nguyên tắc

Hoạt tính của enzyme thể hiện trong vùng pH tương đối hẹp là pH tối ưu pH tối ưu của một số enzyme như pepsin là 1,2-2,5; catalase 7,0; trypsin 8,0-9,0…

Mức độ ion hĩa của các enzyme phụ thuộc vào mơi trường Enzyme cĩ thể cĩ hoạt tính cao khi ở dạng tích điện dương hay tích điện âm hoặc ở trạng thái đẳng điện

3.2 Hóa chất

- dung dịch tinh bột 1%

- dung dịch amylase

- dung dịch lugol (KI 2,65g; I2 0,05g; nước cất vừa đủ 100ml)

3.3 Tiến hành

Lấy 3 ống nghiệm, cho vào:

- ống 1: 1 ml dung dịch hồ tinh bột 1% và 1 ml dung dịch đệm pH 4

- ống 2: 1 ml dung dịch hồ tinh bột 1% và 1 ml dung dịch đệm pH 6

- ống 3: 1 ml dung dịch hồ tinh bột 1% và 1 ml dung dịch đệm pH 8

Sau đĩ cho vào mỗi ống 1 ml dung dịch enzyme amylase đã pha lỗng

Tiến hành khảo sát hoạt tính của enzyme dưới ảnh hưởng của pH bằng cách xác định thời gian thủy giải của amylase (tương tự thí nghiệm 2)

Vẽ đường biểu diễn sự biến thiên của thời gian thủy giải (phút) đối với pH Nhận xét Giải thích

4 Ảnh hưởng của chất hoạt hóa và chất ức chế đến hoạt tính của enzyme

Chất hoạt hĩa là chất cĩ khả năng làm tăng cường tác dụng của enzyme Chúng cĩ bản chất hĩa học khác nhau Thí dụ ion Cl- đối với - amylase, glutathion đối với nhiều protease thực vật, cystein đối với nhiều loại enzyme cĩ nhĩm –SH hoạt động…

Chất ức chế là chất kìm hãm phản ứng xúc tác của enzyme, làm giảm ái lực của enzyme đối với cơ chất hoặc làm enzyme mất khả năng kết hợp với cơ chất Thí dụ các ion

Ag2+, Hg2+, Pb2+… là chất ức chế của hầu hết các enzyme

4.1 Nguyên tắc

Amylase của nước bọt (- amylase) sẽ tăng hoạt động trong mơi trường cĩ NaCl, ngược lại CuSO4 sẽ ức chế tác dụng của enzyme này

Trong 3 ống nghiệm cĩ chứa - amylase và tinh bột Nếu ta cho NaCl vào ống thứ nhất, CuSO4 vào ống thứ hai, và nước vào ống thứ 3 thì sau cùng một thời gian tác dụng ta sẽ thấy:

o ống 1: tinh bột được thủy giải hồn tồn

o ống 2: khơng cĩ sự thủy phân tinh bột

o ống 3: tinh bột chỉ được thủy giải đến dextrin

4.2 Hóa chất

- dung dịch tinh bột 1%

- dung dịch amylase đã pha loãng

- dung dịch NaCl 1%

- dung dịch CuSO4 1%

4.3 Tiến hành

Lấy 3 ống nghiệm, cho vào:

- ống 1: 0,5 ml dung dịch amylase đã pha loãng và 0,5 ml NaCl 1%

- ống 2: 0,5 ml dung dịch amylase đã pha loãng và 0,5 ml CuSO4 1%

- ống 3: 0,5 ml dung dịch amylase đã pha loãng và 0,5 ml nước cất

Tiếp tục cho vào mỗi ống 1 ml dung dịch hồ tinh bột 1% Để cả 3 ống ở nhiệt độ phịng khoảng 3-5 phút Sau đĩ làm phản ứng Iod với tinh bột và dextrin Nhận xét Giải thích

5 Bài tường trình:

- Tường trình quá trình thực hiện

- Kết quả ghi nhận được

- Nhận xét kết quả

- Giải thích kết quả

Bài 2

ỨNG DỤNG ENZYME AMYLASE TRONG

SẢN XUẤT MẠCH NHA

1 ENZYME AMYLASE

1.1 Giới thiệu enzyme amylase

Amylase là hệ enzyme rất phổ biến thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác sự phân giải các liên kết nội phân tử polysacharide với sự tham gia của nước

Các enzyme amylase từ các nguồn khác nhau thường khác nhau về tính chất, cơ chế tác dụng cũng như sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân

1.1.1 Enzyme -amylase

Enzyme -amylase thủy phân liên kết  1-4 bên trong dây amylose và amylopectin ở bất kỳ vị trí nào để tạo ra hỗn hợp oligosaccharide ngắn hơn, phản ứng dừng lại khi gặp liên kết -1-6 tại điểm phân nhánh

Enzyme -amylase được phân lập từ Bacillus subtilis là loại enzyme rất chịu nhiệt

Đặc tính này rất thuận lợi vì trong quá trình hồ hoá tinh bột để nấu bia tinh bột phải được gia nhiệt đến 90oC nhằm mục đích gelatin hoá tinh bột, nhiệt độ này vẫn thấp hơn nhiệt độ tới hạn của enzyme là 1100 C

Tinh bột thường được pha loãng đến nồng độ thích hợp từ 30% đến 40% và nấu ở

1000 C trong 3 đến 7 phút sau đó làm lạnh xuống còn 900C và giữ yên từ 1 đến 3 giờ để phản ứng đường hóa xảy ra hoàn toàn

Sản phẩm được tạo thành sau phản ứng chủ yếu là đường maltose và các olimer khác, vì vậy chúng không được dùng phổ biến trong kỹ nghệ đường hóa tinh bột nhưng có thể sử dụng để thay thế enzyme -amylase trong quá trình sản xuất sirô maltose

1.1.2 Enzyme -amylase

-amylase là enzyme thuộc nhóm exo-acting phân cắt liên kết glycosid 1-4 của tinh bột từ đầu không khử, sản phẩm tạo thành là maltose -amylase không cắt được liên kết glycosid 1-6 tại mạch nhánh, thông thường người ta hay sử dụng enzyme -amylase kết hợp với enzyme phân cắt mạch nhánh để thủy phân triệt để tinh bột thành dung dịch đường maltose hay còn gọi là sirô maltose Sirô maltose có tính hút ẩm cao và ổn định màu hơn sirô glucose, sản phẩm của chúng có dạng kết tinh và ít dính Maltose là nguyên liệu dùng chế biến các món tráng miệng, trang trí trên bánh hay chế biến bánh kẹo

-amylase cũng có nhiều trong mầm thóc, đại mạch nẩy mầm, chúng thường được ứng dụng trong chế biến mạch nha, chế biến bia, tuy nhiên sản xuất ở quy mô công nghiệp người ta thường sử dụng các enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật

1.2 Trích Enzyme Amilase từ mầm lúa

Amylase là một enzyme tan trong nước

Để trích Amylase từ mầm lúa, ta nghiền nát 10g lúa nẩy mầm với 30 ml nước cất Để yên 15 phút, lọc lấy nước qua lọc, thêm 5 ml cồn tuyệt đối vào lắc và để lắng lại

Để phần cồn qua giấy lọc và giữ chất trầm hiện trong ống nghiệm Rửa lại 3-4 lần với cồn tuyệt đối, sau đó đổ tất cả trầm hiện qua giấy lọc Khi tất cả nước chảy qua hết, để ống nghiệm sạch dưới phễu và đổ trên giấy lọc 20ml nước để hòa tan chất trầm hiện,

ta có một dung dịch Amylase khá tinh sạch

1.3 Trích Enzyme từ môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Nghiền cẩn thận môi trường nuôi cấy bề mặt

Cân 20g mẫu đã nghiền nhuyễn, cho vào bình tam giác hoặc bình cầu

Thêm 500 ml dung dịch NaCl 1%, đặt vào máy lắc Lắc liên tục từ 1-2 giờ ở nhiệt độ trong phòng

Lọc hoặc ly tâm ở 6000v/phút trong 5 phút để nhận được dịch trong suốt Nếu là môi trường lỏng, cần ly tâm để loại bỏ tế bào vi sinh vật Dịch trong suốt lọc được dùng để phân tích

2 QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT MẠCH NHA

2.1 Nguyên lý

Dùng enzyme –amylase (Termamyl) tác dụng lên mạch tinh bột khoai mì Loại enzyme này có khả năng thủy phân nhanh tinh bột trong điều kiện nhiệt độ cao

2.2 Sản phẩm mạch nha

Đường nha là sản phẩm ứng dụng cho nhiều ngành sản xuất thực phẩm khác nhau, đặc biệt là ngành công nghiệp sản xuất bánh kẹo Đường nha được sản xuất chủ yếu bằng phương pháp axit và phương pháp enzyme

Trong cơng nghiệp chế biến thực phẩm, các sản phẩm được chế biến từ mạch nha bao gồm: Thực phẩm cho trẻ em; Các loại bánh mì và các loại sản phẩm khác: bánh bích quy, các loại bánh hoặc kẹo dịn, kem lịng trắng trứng, bánh hạnh nhân, bánh quy, cookies…; Các loại thức uống lên men như rượu, bia, thực phẩm điểm tâm, màu caramel, pho mát, kẹo chewingum, sữa đặc, bánh kẹo, …

2.3 Quy trình công nghệ

(Nguồn: Công ty Đường Biên Hòa, 1997)

Chuẩn bị dung dịch Nước Tinh bột

Hồ hóa

Dịch hóa

Đường hóa

Tẩy màu

Lọc

Trao đổûi ion

Cô đặc

Thành phẩm

Enzyme

Enzyme

Than hoạt tính

Bột trợ lọc

pH = 6,0 - 6,5

to = 100 – 105oC tlưu = 5 phút

to = 95 – 100oC tlưu = 2h

DE = 8 - 16

to = 55 – 60oC; tlưu = 12h

pH = 5 – 5,5

DE = 40 - 45

to = 55 – 60oC tlưu = 30 – 45 phút

Pck = 650 – 700mmHg

to s = 60 – 65 oC

DE = 40 - 45

2.4 Thuyết minh quy trình

2.4.1 Chuẩn bị dung dịch

Nguyên liệu tinh bột khoai mì được hòa trộn với một lượng nước thích hợp để tạo thành dung dịch huyền phù có hàm lượng chất khô khoảng 30 – 35%

Để tạo điều kiện tối ưu cho hoạt động của enzyme, cần điều chỉnh pH của dung dịch ở mức thích hợp (pH = 6,0 - 6,5) bằng cách sử dụng NaOH 30% hoặc HCl 30%

Lượng –amylase cần thiết để dịch hóa được bổ sung vào giai đoạn này (0,6 – 0,8 kg/tấn chất khô)

2.4.2 Hồ hóa

Dưới tác động của nhiệt độ cao, liên kết giữa các hạt tinh bột sẽ bị phá vỡ, tinh bột sẽ hút nước và trương nở, tạo điều kiện cho các phản ứng thủy phân tinh bột sau này xảy

ra dễ dàng

Quá trình hồ hóa sử dụng hơi nước trực tiếp phun vào dung dịch huyền phù để nâng nhiệt độ dung dịch lên 105oC Duy trì nhiệt độ này trong vòng 5 phút để hồ hóa hoàn toàn tinh bột

2.4.3 Dịch hóa

Dịch tinh bột đã được hồ hóa được làm nguội đến 90 – 95oC, dưới tác dụng của enzyme –amylase, tinh bột được phân cắt thành đường và dextrin hòa tan

Quá trình dịch hóa diễn ra khoảng 2 giờ, sau dịch hóa dung dịch có DE = 8 – 16,

pH = 5,5 – 6,0 Ở điều kiện như vậy, enzyme bị giảm hoạt tính đáng kể, nếu tiếp tụckéo dài thời gian dịch hóa sẽ không làm tăng hiệu suất chuyển hóa và DE của dung dịch, đồng thời lại làm tăng màu của dung dịch do sự biến đổi của đường khử ở nhiệt độ cao

2.4.4 Đường hóa

Dịch thủy phân sau khi dịch hóa được tiếp tục đường hóa với enzyme –amylase để tạo thành Maltose

Nhiệt độ của dịch thủy phân được làm nguội xuống 55oC bằng nước và được điều chỉnh pH khoảng 5,3 bằng dung dịch HCl

Lượng chính xác của enzyme được bổ sung vào dịch thủy phân tại thùng đường hóa (0,1 – 0,2 kg/tấn chất khô) Thời gian đường hóa khoảng 12 giờ

Sau khi đường hóa xong, dịch thủy phân được gia nhiệt lên 70oC để tiêu diệt enzyme

2.4.5 Tẩy màu và lọc

Dịch thủy phân sau khi diệt enzyme được trộn đều với than hoat tính (khoảng 1 kg/tấn chất khô) để hấp phụ tạp chất, chủ yếu là chất màu Quá trình lấy màu diễn ra trong khoảng 30 - 45 phút

Sau khi tẩy màu, dịch thủy phân được cho thêm bột trợ lọc và lọc bằng thiết bị lọc ép Bột trợ lọc được chuẩn bị trước bằng cách hòa trộn với sirô hoặc với nước (nếu sản xuất Maltose Dextrin), được sử dụng để làm áo cho bàn lọc trong giai đoạn chuẩn bị lọc Lớp bột trợ lọc giúp cho việc giữ lại các tạp chất và than để tạo thành dịch thủy phân sạch

2.4.6 Trao đổi ion

Siro sau khi lọc vẫn còn chứa các tạp chất hữu cơ và vô cơ hòa tan (chủ yếu là các muối khoáng) có trong nguyên liệu và từ các hóa chất bổ sung vào trong các giai đoạn trước Phần lớn các tạp chất này tồn tại ở dạng ion cân bằng phân ly

Để khử các tạp chất này sirô được đưa qua 3 cột trao đổi ion Trong trao đổi cation, phần lớn ion kim loại được loại ra khỏi sirô, các ion H+ được giải phóng khỏi nhựa và chuyển vào sirô Trong trao đổi anion, phần lớn các anion như Cl-, SO42+, amino acid hòa tan, chất màu được loại khỏi sirô, ngược lại ion OH- sẽ tách khỏi nhựa và đi vào sirô Ion

OH- này sẽ kết hợp với ion H+ tạo thành nước Sirô tiếp tục được dẫn qua cột nhựa hỗn hợp để loại triệt để các tạp chất hòa tan còn sót lại Hệ thống bao gồm hai bộ thiết bị trao đổi ion Một bộ hoạt động, bộ còn lại được tái sinh hoặc ở trạng thái chờ

2.4.7 Cô đặc và thành phẩm

Sirô được cô đặc đến nồng độ chất khô khoảng 80% bằng nồi cô đặc gia nhiệt gián tiếp buồng đốt ngoài ở điều kiện chân không (pck = 650 – 700 mmHg, tos = 60 – 65oC) để bảo đảm chất lượng sản phẩm Sirô sau khi cô đặc được đưa vào các thùng bán thành phẩm hoặc can để tồn trữ hoặc xuất sản phẩm

2.4.8 Chỉ tiêu đánh giá chất lượng sản phẩm

❖ Cảm quan

Chỉ tiêu Yêu cầu

Trạng thái

Màu sắc

Mùi vị

Tạp chất

Sánh, kéo chỉ trong suốt Màu vàng rơm hoặc vàng nâu caramen Thơm đặc trưng, vị ngọt hơi mặn (đối với nha sản xuất bằng phương pháp thủy phân bằng acid), không có vị lạ

Không có tạp chất, cặn bẩn

❖ Hóa lý

Chỉ tiêu Yêu cầu

1 Độ khô (Bx), %

2 Đường khử (RS), %

3 Độ pH

4 Hàm lượng tro, %

5 Kim loại nặng, %

6 Tinh bột và acid tự do

7 Hàm lượng muối, %

8 Nhiệt độ cháy xém, oC

82 – 84

36 – 39 5,0 – 5,5

 0,6

 0,001 Không có

 0,5

140 - 148

3 BÀI TƯỜNG TRÌNH

- Tường trình quá trình thực hiện

- Nhận xét chất lượng sản phẩm

Bài 3: ENZYME BROMELIN

1 Trích ly Bromeline từ dứa

Bromeline là protease có nguồn gốc thực vật Bromeline có nhiều trong các phần khác nhau của cây dứa: quả, chồi, thân, vỏ…

Bromeline có thể ly trích như sau: Dứa xanh đem gọt vỏ bằng dao inox, cân xác định trọng lượng lấy phần thịt, lõi Mắt cho vào máy xay sinh tố xay nát Đổ ra trên vải màng, vắt thật kỹ, đem lọc để loại bỏ chất xơ Đo thể tích dịch chiết

2 Ứng dụng enzyme bromelin trong làm mềm thịt

Thịt nạc được cắt ra thành từng lát mỏng giống nhau theo chiều dọc để cĩ thể quan sát được

sớ thịt Chia thịt ra làm 4 phần:

Dĩa 1: bổ sung 20 ml nước dứa, ngâm trong ít nhất 2 giờ

Dĩa 2: bổ sung 20 ml enzyme protease đã pha lỗng 100 lần, ngâm trong ít nhất 2 giờ

Dĩa 3: khơng xử lý (đối chứng)

Sau 2 giờ, đun nĩng thịt trong các dĩa trên trong 5 phút ở 100oC Quan sát, đánh giá và so sánh mùi vị, cấu trúc của thịt giữa các mẫu

3 Bài tường trình

- Tường trình quá trình thực hiện

- Tính toán hiệu suất thu hồi dung dịch enzyme thơ (%)

- Kết quả so sánh ứng dụng enzyme bromelin trong làm mềm thịt