Chuong 4 cac ky thuat phan tich acid nucleic

MỘT SỐ KỸ THUẬT PHÂN TÍCH DỰA TRÊN ACID NUCLEIC  Nhận biết gen PCR, RFLP, lai DNA, lai DNA-protein, xác định trình tự của gen....  Định lượng số bản sao của gen RT-PCR  Biểu hiện gen

MỘT SỐ KỸ THUẬT PHÂN TÍCH DỰA TRÊN ACID NUCLEIC

 Nhận biết gen (PCR, RFLP, lai DNA, lai DNA-protein, xác định trình tự của gen )

 Định lượng số bản sao của gen (RT-PCR)

 Biểu hiện gen (lai Northern, DNA microarray, điện di hai chiều kết hợp phân tích khối phổ, lai Western, phân tích hoạt tính ).

 Aptamer và ứng dụng

Làm thế nào để biết sự có mặt của gen đó trong mẫu nghiên cứu?

Khi gen bị đột biến? Làm thế nào để phát hiện?

KỸ THUẬT PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (PCR)

VÀ CÁC KỸ THUẬT LIÊN QUAN

Những điểm cốt yếu nhất của kỹ thuật PCR hay nhân gen trong ống nghiệm:

 Gen đích (hoặc DNA chứa gen đích)

 Mồi hay primer đặc hiệu cho gen đích

 Các nguyên liệu tổng hợp DNA

 DNA polymerase với hoạt tính tổng hợp chuỗi polynucleotide

Các kỹ thuật PCR cải biến: PCR lồng (nested PCR), RAPD, PCR đa

cặp mồi (multiplex-PCR), RT-PCR, PCR định lượng (Real-time PCR), PCR miễn dịch, PCR-RFLP…

5’ 3’

3’ 5’

5’ 3’

3’ 5’

5’ 3’

3’ 5’

5’ 3’

3’ 5’

5’ 3’

3’ 5’

3 BƯỚC CƠ BẢN CỦA PCR • Khởi đầu : Primer 1 (Forward Primer) : Primer 2 (Reverse Primer) • Chu kỳ 1 • Chu kỳ 2 • Chu kỳ 3 5’ 3’

3’ 5’

5’ 3’

5’ 3’

3’ 5’

3’ 5’

5’ 3’

3’ 5’

5’ 3’

3’ 5’

5’ 3’

3’ 5’

5’ 3’

3’ 5’

Biến tính

Gắn mồi

Kéo dài chuỗi

KỸ THUẬT PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE

SỐ CHU KỲ (n)

1012

106

30

Nf = No.(1+Y)n-2

 Nf là số đoạn ADN đích cuối cùng

 No là số bản sao khuôn ban đầu

 Y là hiệu quả kéo dài primer qua mỗi chu kỳ (tối đa là = 1)

kb 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

NHÂN BẢN ĐOẠN GEN ĐẶC HIỆU CỦA XOẮN KHUẨN GIANG MAI

VÀ KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT

(Phan et al., 2008)

Xoắn khuẩn

giang mai

T pallidum

Ký sinh trùng sốt rét P falciparum (206 bp)

và P vivax (121 bp)

206 bp

121 bp

VNTR, PCR VÀ VIỆC NHẬN DẠNG CÁ THỂ

Trẻ A B C D E

Ai (trong số A, B, C, D, E) có thể là bố của đứa trẻ?

13 5 6 2 8

Loài A: Loài gốc (không có đột biến)

Loài B: Đột biến làm xuất hiện một điểm cắt của

ở đoạn 13 kb

Loài C: Tương tự loài B nhưng còn có một đột biến

mất điểm cắt giữa đoạn 5 và 6 kb

2

4 5

6 8

13

9

kb A B C

Phổ băng RFLP sử dụng các đoạn ADN của loài A làm mẫu dò

11

Điểm cắt của RE: 1 2 3 4

KỸ THUẬT ĐA HÌNH ĐỘ DÀI CÁC ĐOẠN PHÂN CẮT GiỚI HẠN Restriction fragment length polymorphism-RFLP

KỸ THUẬT PCR-RFLP

để phát hiện đột biến điểm hay nhận dạng

Fig 1 DNA electrophoresis of PCR product of target gene habouring Wilson

Disease Arg778 mutation after digestion with Msp I (CCGG) Lane 1 and 2: PCR products of normal subjects before and after digestion with Msp I,

respectively Lane 3 to 13: PCR product of 10 WD patients after digestion with

Msp I (295 = 236 + 59) CCGG -> CCTG ( Do TTH et al, 2010 )

B

PHÁT HiỆN ĐỘT BiẾN Arg778Leu Ở BỆNH WILSON

AATTCCAC GGTG

TCGT AGCAAT

Gắn với adaptor bằng ligase

GTAGTAGACTGCGTACC AATTCCAC

CAGCATCTGACGCATGGTTAA GGTG

GACTGCGTACCAATTCCAC

AGCAATGAGTCCTGAGTAG TCGTTACTCAGGACTCATCGTC AGCAATGAGTCCTGAGTAGCAG

EcoRI-adaptor -Đoạn phân cắt -MseI adaptor

Nhân bản bằng PCR

Các nucleotide chọn lọc

Sơ đồ minh hoạ kỹ thuật AFLP

Đoạn gen cắt bằng

EcoRI và MseI

MẪU DÒ/OLIGO SUY BIẾN

Khi nào thì phải dùng oligo suy biến?

Khái niệm “ Motif ”, “ Signature ”

Nên chọn oligo suy biến như thế nào?

Real-time PCR

• Tương quan giữa logarit số bản sao và số chu kỳ ngưỡng.

• Nội chuẩn/gen nội chuẩn.

PHÁT HIỆN, ĐỊNH LƯỢNG SỐ COPY MANG ĐỘT BIẾN

BẰNG REAL-TIME PCR

Mồi Huỳnh quang (FRET) và Taqman

Để nhận biết sự có mặt của gen X trong mẫu

nghiên cứu, cách tốt nhất là:

a)Tách gen X ra và xác định trình tự.

b)Sử dụng PCR với cặp mồi đặc hiệu để nhân gen X lên

c)Dùng enzyme giới hạn cắt hệ gen chứa gen X đó để xem gen đó có bị cắt tại các điểm xác định hay không.

d)Dùng kháng thể đặc hiệu của protein do gen X mã hoá và xem sự có mặt của protein X trong mẫu.

KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE (1)

KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE (2)

Xác định trình tự nucleotit tự động bằng hệ thống điện di mao quản

DNA microarray vµ nghiªn cøu biÓu hiÖn

gen

RNA APTAMER VÀ ỨNG DỤNG

cố định có trình tự đã biết.

không gắn, rửa chiết để thu aptamer gắn đặc hiệu (làm giàu)

đặc hiệu.