Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên GP 120 của virus HIV phân type B lưu hành tại Việt Nam

Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên GP 120 của virus HIV phân type B lưu hành tại Việt Nam Triomune-30( or -40);Mỗi viên nén chứa: Stavudine 30 mg(or 40 mg); Lamivudine 150 mg; Nevirapine...

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài: Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên GP 120 của virus HIV phân

type B lưu hành tại Việt Nam

Người hướng dẫn : PGS.TS Đinh Duy Kháng

Sinh viên : Phạm Thu Trang

Tình hình HIV trên thế giới 2009

• Ước tính đến năm 2011, Việt Nam

có khoảng 311.500 người bị nhiễm bệnh.

• Tại Việt Nam tính đến ngày

31/12/2010

• 183.938 người

• 44.938 người

• 49.477 người

Kit

P24 gp41

gp120

Phân bố các phân type HIV-1 M theo vùng địa lý (2008)

Glycoprotein gp 120

Glycoprotein vỏ gp 120 của virus HIV

Phức hợp gp120-CD4-đồng thụ thể

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Vật liệu

• Plasmid mang gen gp120 của virus

HIV phân type B lưu hành ở Việt

Nam (mẫu số 6, Quảng Ninh) được

tách dòng thành công tại Phòng Vi

sinh vật học phân tử - Viện CNSH - Viện KH&CN VN.

• Các hóa chất, sinh phẩm và trang thiết

bị tại Phòng Vi sinh vật học phân tử - Viện CNSH - Viện KH&CN VN.

Phương pháp nghiên cứu

• Nhân bản gen mã hóa protein gp120B của virus HIV bằng phương pháp PCR.

• Gắn sản phẩm PCR vào vector.

• Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.coli.

• Cắt DNA bằng enzyme giới hạn.

• Xác định trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động

• Biểu hiện gen trong tế bào E.coli tái tổ hợp.

• Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột ái lực Ni 2+

• Phương pháp Western Blot.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Thiết kế vector biểu hiện pET32a(+) mang gen gp120B

Khuếch đại gen gp120B_EX bằng cặp mồi biểu hiện

ĐC1: Thang DNA chuẩn 1kb ĐC2: sản phẩm PCR.

Tạo vector tái tổ hợp pET32a(+) mang gen gp120B_EX

ĐC 1: Plasmid gốc vector pET32a(+)

ĐC 2-12: DNA plasmid có khả năng

mang gen gp120B_EX

ĐC1: Thang DNA chuẩn 1 kb

ĐC2-6: Các dòng plasmid 3, 4, 8, 10, 12

cắt bằng BamH I và Xho I ĐC7: Đối chứng (đoạn gen gp120B_EX)

Tinh sạch DNA plasmid

ĐC1-3: Tương ứng với dòng plasmid tái tổ hợp số 4, 10, 12

Gen gp120B_EX trong vector biểu hiện pET32a(+) đã được giải trình tự

Kiểm tra khung đọc của gen gp120B trong vector pET32a(+)

Biểu hiện gen gp120B trong vi khuẩn E.coli chủng BL21 StarTM (DE3)

ĐC 1: Thang Protein chuẩn

ĐC 2,4: Mẫu không cảm ứng

ĐC 3,5: Mẫu cảm ứng bằng IPTG 1mM

Kiểm tra trạng thái tồn tại của protein gp120B tái tổ hợp

M: Thang Protein chuẩn ĐC: Mẫu trước cảm ứng C: protein thu được ở pha cặn HT: Mẫu protein thu được ở pha nổi

Ảnh hưởng của nồng độ IPTG

ĐC M: Thang Protein chuẩn

ĐC 0: Mẫu không cảm ứng

ĐC 0,25; 0,5; 1: Mẫu cảm ứng bằng ITPG tương ứng nồng

độ 0,25mM, 0,5mM, 1mM

Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy

ĐC M: Thang Protein chuẩn

ĐC 0: Mẫu không cảm ứng

ĐC 1, 2, 3,4: Mẫu cảm ứng với thời gian tương ứng 1h, 2h, 3h, 4h

Tinh chế protein gp120B tái tổ hợp

ĐC 1: Thang protein chuẩn (Fermentas)

ĐC 2-8: Các phân đoạn đẩy ra khỏi cột sau khi tinh sạch

ĐC 9: Dịch phá tế bào bằng siêu âm, ĐC 10: Dịch chảy qua cột

Nghiên cứu khả năng phản ứng của GP120 tái tổ hợp với kháng thể kháng

HIV trong huyết thanh bệnh nhân HIV bằng Western blot

Hình A: Phản ứng giữa protein tái tổ hợp gp120B với huyết thanh dương tính với HIV Hình B: Phản ứng giữa protein tái tổ hợp gp120B với huyết thanh âm tính với HIV

ĐC 1: Thang protein chuẩn

ĐC 2: Protein tái tổ hợp GP120B

ĐC 3: Protein tái tổ hợp Thioredoxin

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

I KẾT LUẬN

1 Đã thiết kế thành công vector biểu hiện để biểu hiện gen gp120 phân type B của HIV lưu hành ở Việt Nam

2 Đã biểu hiện thành công gen mã hóa protein gp120 ở vi khuẩn

và đã tìm được điều kiện tối ưu để biểu hiện

3 Đã tinh sạch được kháng nguyên GP120 phân type B có độ

tinh sạch Sau khi tinh sạch kháng nguyên vẫn giữ được đặc tính kháng nguyên, phản ứng đặc hiệu với kháng thể kháng

HIV tự nhiên trong huyết thanh bệnh nhân HIV dương tính

II KIẾN NGHỊ

Tiếp tục nghiên cứu sử dụng kháng nguyên GP120 tái tổ hợp

từ phân type B để chế tạo kit chẩn đoán HIV

XIN TRÂN TRỌNG CẢM ƠN!

38.00%

3.00%

10.00%

Đường lây HIV/AIDS tại Việt Nam

Nhiễm qua đường máu Nhiễm qua đường tình dục Nhiễm qua đường mẹ-con Không rõ đường lây

Vòng đời của virus HIV

Các phương pháp phát hiện kháng thể

• Áp dụng - Giám sát dịch tễ.

• Các phương pháp :

- Huỳnh quang miễn dịch.

- Enzyme liên kết miễn dịch: ELISA (Enzyme

Linked Immunoadsorbent Asay).

- Kỹ thuật ngưng kết vi lượng thụ động (Serodia).

- Kỹ thuật xét nghiệm Western Blot.

-Kỹ thuật RIPA (Radioimmuno precipitation

assay).

Những phương pháp phát hiện trực tiếp

- Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

- Phát hiện kháng nguyên P24 của virus trong máu.

Nuôi cấy từ các lympho bào để phân lập virus

• Nguyên lý: Tách tế bào đơn nhân trong máu bệnh nhân

và nuôi cấy chung với tế bào đơn nhân của người lành

đã được hoạt hóa trong môi trường nuôi cấy PHA (phytohemagglutinin) thích hợp

• Xác định sự nhân lên của virus bằng kỹ thuật [5] :

• ELISA phát hiện kháng nguyên P24 trong nước nổi môi trường nuôi cấy tế bào

• Dùng đồng vị phóng xạ phát hiện enzyme sao chép ngược của virus (RT)

• Phương pháp này dùng chủ yếu là để nghiên cứu, còn để

chuẩn đoán thì ở giai đoạn mới nhiễm rất khó phân lập, vì khi huyết thanh có kháng thể kháng HIV thì việc phân lập được

virus là rất hạn hữu

Chẩn đoán sinh học có suy giảm miễn dịch và có rối

• Theo dõi kháng nguyên P24:

• Vừa có giá trị phát hiện sớm bệnh 50-70% (+) ở giai đoạn sơ nhiễm.

• Khi có hội chứng AIDS đầy đủ 50-70% (+) trở lại.

• Bệnh tiến triển trầm lặng thì kháng nguyên P24 giảm dần theo thời gian.

• Dấu hiệu gián tiếp suy giảm miễn dịch.

•

•

Những thuốc điều trị HIV hiện nay

Nevirapine 200 mg.Cả hai stavudine và lamivudine hoạt động bằng cách chấm dứt sự tăng trưởng của các chuỗi DNA và sao chép các ức chế ngược của HIV Nevirapine là một non-nucleoside ức chế sao chép ngược Nó hoạt động bằng cách sao chép ngược trực tiếp ức chế.

từ đó ức chế sự sao chép của virus bên trong tế bào Cũng thuộc loại này, Acyleovir ức chế sự tổng hợp DNA của virus Herpes.

mã ngược RNA thành DNA của HIV làm cho HIV ngưng phát triển, không sinh sản được Cũng thuộc loại này còn có Didanosine, Zalcitabine, Lamivudine

chép trưởng thành và phóng thích ra khỏi tế bào bằng cách ức chế men neuraminidase (chính là kháng nguyên N của lớp vỏ virus cúm).

phối hợp với AZT để trị HIV Cơ chế của thuốc ức chế protease là làm cho men phân giải đạm của HIV không hoạt động được, để nó không nhân lên nhiều HIV mới.

virus Gamma globulin ngăn virus xâm nhập vào tế bào vì có chứa kháng thể chống lại kháng

nguyên bề mặt nằm trên lớp vỏ của virus Còn Interferon kháng virus bằng cách ngăn cản virus tổng hợp protein, RNA hoặc DNA của nó trong tế bào

Human immune deficiency virus – HIV

Sơ đồ phân type virus HIV

Hình dạng và cấu trúc virus HIV

Cấu trúc genome của virus HIV-1

Glycoprotein vỏ gp 120 của virus HIV