Tóm tắt luận án nghiên cứu chọn chủng vi rút cúm a h5n1 hiện đang lưu hành tại việt nam tạo được đáp ứng miễn dịch bảo hộ cao trên vịt

Để phát triển văc xin phòng bệnh nói chung và văc xin cúm gia cầm nói riêng, với công nghệ bất hoạt vi rút dùng nguyên chủng hay chủng di truyền ngược, công nghệ tinh sạch kháng nguyên h

Công trình được hoàn thành tại: Viện Thú Y

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Viết Không

Phản biện 1: GS.TS Hồ Đình Chúc

Phản biện 2: GS.TS Nguyễn Quang Tuyên

Phản biện 3: PGS TS Khuất Hữu Thanh

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp nhà nước họp tại Viện Thú y, 86 đường Trường Chinh, Đống Đa, Hà Nội

vào hồi: giờ ngày tháng năm

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Viện Thú y;

- Thư viện Quốc gia

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1: Nguyễn Thị Hồng Thắm, Bùi Ngọc Anh, Phạm Thị Nga, Đào

Thanh Vân, Phạm Hồng Sơn và Nguyễn Viết Không 2014 “Đặc tính của vi

rút cúm A Clade 2.3.2.1C phân lập từ ổ dịch năm 2012” Tạp chí Khoa học

kỹ thuật Thú y, tập XXI số 6 - 2014, trang 12-19

2: Vuong Nghia Bui, Tung Duy Dao, Tham Hong Thi Nguyen, Lien

Thi Nguyen, Anh Ngoc Bui, Dai Quang Trinh, Nga Thi Pham, Kenjiro Inui, Jonathan Runstadler, Haruko Ogawa, Khong Viet Nguyen, Kunitoshi Imai

2014 “Pathogenicity of an H5N1 avian influenza virus isolated in Vietnam in

2012 and reliability of conjunctival samples for diagnosis of infection” Virus

Research 179: pp125–132

3: Vuong Nghia Bui, Haruko Ogawa, Dai Quang Trinh, Tham Hong Thi Nguyen, Nga Thi Pham, Duc Anh Truong, Anh Ngoc Bui, Jonathan

Runstadler, Kunitoshi Imai, Khong Viet Nguyen 2014 Genetic

characterization of an H5N1 avian influenza virus from a vaccinated duck

flock in Vietnam Virus Genes 49: pp278–285

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết

Bệnh cúm gia cầm (Avian Influenza - AI) do vi rút cúm A/H5N1 thể độc lực cao (HPAI) là một bệnh truyền nguy hiểm gây thiệt hại kinh tế nặng nề cho nhiều nước trên thế giới, và có khả năng lây nhiễm cho người

Từ khi dịch do vi rút cúm A/H5N1 bùng phát đầu tiên tại Hồng Kông năm

1997 [13] đến tháng 10/2014, dịch đã xảy ra ở 65 quốc gia, trong đó Việt Nam là nước có nhiều ổ dịch cúm gia cầm nhất (2720 ổ dịch) [6]; và có 668 người nhiễm

vi rút cúm A/H5N1, trong đó có 393 người chết [12] Ở nước ta, đại dịch cúm gia cầm do vi rút cúm A/H5N1 bùng phát vào cuối năm 2003 [1], giết hại nhiều gia cầm, gây thiệt hại to lớn về kinh tế Bệnh đặc biệt nguy hiểm khi lây nhiễm cho người với tỷ lệ chết cao Từ 2003 đến nay đã có 127 người nhiễm cúm A/H5N1 trong đó 64 trường hợp tử vong [11] Sự xuất hiện biến chủng mới do lây lan từ bên ngoài và tái tổ hợp từ những chủng đã lưu cữu làm cho diễn biến tình hình dịch cúm ở nước ta rất phức tạp

Nguồn dịch cúm A/H5N1 khó kiểm soát nhất là ở vịt do chúng có thể nhiễm vi rút mà không có biểu hiện lâm sàng và bài thải một lượng lớn vi rút vào môi trường, lây truyền cho gia cầm khoẻ và con người [4]

Công tác phòng chống dịch cúm gia cầm ở nước ta chủ yếu dựa vào các biện pháp tổng hợp, trong đó văc xin là công cụ phòng bệnh hữu hiệu, sự phụ thuộc vào nguồn nhập ngoại đôi khi không đáp ứng kịp sự xuất hiện biến chủng vi rút mới Hơn nữa, các văc xin hiện tại có độ bảo hộ không ổn định đối với vịt, đòi hỏi cấp bách nghiên cứu tạo văc xin

Để phát triển văc xin phòng bệnh nói chung và văc xin cúm gia cầm nói riêng, với công nghệ bất hoạt vi rút dùng nguyên chủng hay chủng di truyền ngược, công nghệ tinh sạch kháng nguyên hay tái tổ hợp, khâu đầu tiên vẫn là lựa chọn được chủng có đặc tính kháng nguyên phù hợp với các chủng vi rút đang lưu hành

Trong nghiên cứu này chúng tôi bắt đầu tiến hành “Nghiên cứu chọn chủng vi rút cúm A/H5N1 hiện đang lưu hành tại Việt Nam tạo được đáp ứng miễn dịch bảo

hộ cao trên vịt”

2 Mục tiêu của đề tài :

Nhằm tiến tới chủ động chế tạo được vắc xin phòng bệnh do cúm A/H5N1 ở thủy cầm (vịt) có hiệu quả cao, mục tiêu cụ thể của đề tài là: Chọn được chủng vi rút cúm A/H5N1 phân lập tại Việt Nam làm chủng sản xuất văc xin, có khả năng tạo miễn dịch bảo hộ cao cho vịt nhằm tiến tới chủ động chế tạo vắc xin phòng bệnh cúm gia cầm, đặc biệt là cho thủy cầm nuôi ở nước ta

3 Ý nghĩa khoa học của đề tài :

1 Thành công của đề tài đã chứng minh được khả năng chọn lựa (một cách hệ thống từ các chủng phân lập) được 1 chủng đại diện có tính gây miễn dịch cao, có khả năng bảo hộ đối với nguyên chủng và các chủng cùng clade, đồng thời có khả năng bảo hộ chéo với các chủng dị clade vi rút cúm A/H5N1 lưu hành trước đó (hoặc các chủng “tiền thân”)

2 Đề tài đã cung cấp trình tự sàng lọc chủng để lựa chọn chủng vi rút làm văc xin khi có biến chủng mới xuất hiện đảm bảo tính miễn dịch phù hợp và khả năng nhân lên tốt trong các điều kiện phòng thí nghiệm thông dụng

4 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài:

1 Cả 2 giống gốc vi rút tạo ra từ 1 chủng đại diện cho vi rút clade 2.3.2.1c đang lưu hành đều có thể sử dụng để chế tạo văc xin vô hoạt phòng bệnh do cúm A/H5N1 ở gia cầm nói chung và vịt nói riêng (trong đó chủng thích nghi trên nuôi cấy tế bào có ưu thế hơn về thao tác an toàn sinh học); văc xin chế từ những chủng này có ý nghĩa đặc biệt quan trọng là tạo được miễn dịch kháng thải trùng, miễn dịch bảo hộ với các chủng đang lưu hành phổ biến đồng thời kháng cả các chủng

“tiền thân” hiện còn đang lưu hành ở một số địa phương

2 Chủng vi rút A/Dk/VN/QB7412 với các đặc tính di truyền, kháng nguyên ổn định, sẽ là nguồn vi sinh vật tốt dùng trong tạo chủng Reverse genetic an toàn hơn cho người sản xuất văc xin

5 Đóng góp mới của đề tài:

Kết quả của đề tài có 4 đóng góp mới:

1 Tạo được hai giống gốc từ một chủng vi rút cúm A/H5N1 cho miễn dịch bảo

hộ cao trên vịt kháng chủng đang lưu hành (clade 2.3.2.1c) và kháng chéo các chủng đã lưu hành trước đây (các clade 1, 2.3.2.1a, và 2.3.2.1b)

2 Đã thiết lập được quy trình cấy truyền vi rút trên phôi trứng gà 10 ngày tuổi

và tế bào MDCK có hiệu giá vi rút cao và thích ứng được vi rút trên nuôi cấy tế bào để sản xuất văc xin vô hoạt

3 Phát hiện vùng “thích ứng ký chủ mới” ở gene HA2 và kiểu gene xác định

và phân biệt chủng thích nghi ở các “ký chủ” khác nhau với chủng tiền thân đối với chủng A/Dk/VN/QB7412

4 Đã thiết lập được điều kiện sử dụng chủng vi rút cúm A/H5N1 phân lập gây nhiễm cho vịt với tỷ lệ gây chết ổn định trên 80% dùng trong thử thách hiệu lực văc xin cúm A/H5N1

6 Bố cục của luận án: Luận án gồm 162 trang: Mở đầu (3 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu (30 trang); Chương 2: Đối tượng, nội dung, vật liệu và phương pháp (27 trang); Chương 3: Kết quả và thảo luận (77 trang); Kết luận và kiến nghị (3 trang); Danh mục công trình đã công bố (1 trang); Tài liệu tham khảo (20 trang

có 249 tài liệu tham khảo); Luận án có 38 bảng và 13 hình

1 Chương 1 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU

1.1 Khái niệm, lịch sử bệnh cúm gia cầm

Bệnh cúm gia cầm là một bệnh truyền nhiễm cấp tính ở gia cầm, bệnh đã tồn tại từ lâu trên thế giới, tuy nhiên chỉ từ sau đại dịch cúm gia cầm do vi rút cúm A/H5N1 khởi phát ở Hồng Kông năm 1997, người cũng bị nhiễm vi rút cúm A/H5N1 và tử vong, bệnh này mới được tập trung nghiên cứu có hệ thống

1.2 Vi rút cúm gia cầm, đặc tính vi rút cúm A/H5N1

1.2.1 Phân loại vi rút cúm

Lịch sử đã ghi nhận, vi rút cúm A trên tất cả các loài đều có nguồn gốc từ thủy cầm Mặt khác, trong số 6 type vi rút thuộc họ Orthomyxoviridae tất cả các vi rút ở thủy cầm đều thuộc type A

1.2.2 Vi rút cúm A/H5N1, clade (tộc) và tên gọi

Tên vi rút: Theo danh pháp quốc tế, tên gọi cho vi rút cúm A/H5N1 thể độc lực cao bắt đầu bằng type, sau đó đến tên ký chủ, địa danh phát hiện vi rút và cuối cùng là mã số phòng thí nghiệm, thí dụ rút cúm A/Goose/Guangdong/1/96

Tên tộc vi rút: Theo WHO/OIE/FAO, tên tộc (clade) vi rút được đánh số thập phân đến 4 ký tự, nội tộc được thêm dấu chấm Với những tộc tiếp tục phân kỳ, đến ký tự thứ 5, tách tộc bằng chữ theo alpha beta Thí dụ clade 2.3.2.1c

1.2.3 Một số đặc tính sinh học

Đặc tính sinh học quan trọng nhất của vi rút cúm A/H5N1 là tính thích ứng và gây nhiễm đa vật chủ Độc lực của mỗi chủng vi rút có thể là cao (Highly pathogeneic: HPAI) hay thấp (Low pathogeneic: LHAI) tùy thuộc vào bản chất di truyền của chúng và loài ký chủ Có 3 subtype H (H5, H7 và H9) thường gây bệnh cho gia cầm và người

Vi rút cúm A/H5N1 có khả năng nhân lên trên phôi trứng nhưng do độc lực cao thường gây chết phôi quá nhanh, không sản sinh đủ lượng vi rút để chế tạo văc xin vi rút cũng có thể thích nghi trên tế bào thận chó (MDCK), dễ công nghiệp hóa trong phát triển văc xin

Vi rút cúm A/H5N1 vỏ trần, nhậy cảm với các chất sát trùng, ánh sáng và nhiệt

độ có thể tiệt trùng sau vệ sinh cơ giới Có thể bảo quản vi rút ở nhiệt độ âm sâu và đông khô

1.2.4 Đa dạng sinh học, di truyền, biến dị

Vi rút cúm A/H5N1 có hai đặc tính di truyền quan trọng: Genome phân 8 đoạn,

dễ tái tổ hợp khi đồng nhiễm và tích lũy đột biến điểm do không có enzyme chỉnh sửa khi sao chép Biến đổi của vi rút vì vậy là liên tục và chủng mới luôn được tạo

ra từ chủng tiền thân

1.2.5 Kháng nguyên bề mặt: protein HA và NA

HA và NA là hai loại protein chính trên bề mặt vi rút do vậy có tính quyết định kháng nguyên Protein NA là một enzyme, có vai trò quan trọng trong sự xâm nhập của vi rút vào tế bào chủ

Protein HA là thành phần kháng nguyên chủ yếu gây miễn dịch cho gia cầm Protein HA mang epitope nhận biết thụ thể, đồng thời mang yếu tố chỉ báo độc lực

Ngoài ra, HA có khả năng gây ngưng kết hồng cầu Kháng thể đặc hiệu có khả năng ngăn trở ngưng kết hồng cầu Đặc tính này được sử dụng trong phản ứng HI

để đánh giá hiệu giá kháng thể kháng vi rút cúm gia cầm

Kháng nguyên bề mặt HA quyết định tính đặc hiệu loài, độc lực và tính kháng nguyên nên trở thành đối tượng nghiên cứu chính trong sản xuất văc xin

1.3 Miễn dịch chống bệnh Cúm gia cầm

Khác với gia súc, miễn dịch dịch thể ở gia cầm do kháng thể IgY đảm nhiệm

Do tính phân đoạn, dễ tái tổ hợp, người ta không sử dụng văc xin nhược độc phòng CGC (ngoại trừ vi rút dị loài làm vật mang) Những yếu tố ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch khi tiêm văc xin vô hoạt gồm chất lượng kháng nguyên, liều lượng, bổ trợ, đường tiêm, số lần lặp lại và ảnh hưởng của miễn dịch qua trứng Ngoài ra còn có sự phụ thuộc loài trong đó đáp ứng miễn dịch ở vịt có một số điểm bất lợi và chưa được nghiên cứu kỹ

1.5 Tình hình dịch và biến chủng vi rút cúm A/H5N1 ở Việt Nam

1.5.1 Diễn biến tình hình dịch cúm gia cầm ở Việt Nam

Từ 2003-2007, Việt Nam đã trải qua 5 đợt dịch cúm gia cầm, sau đó bệnh thường tái phát ở dạng dịch địa phương Ngoài gây chết gia cầm, thiệt hại kinh tế đến nay đã có 127 người nhiễm bệnh, trong đó 64 tử vong Nghiên cứu các biện pháp phòng chống là một yêu cầu cấp bách

1.5.2 Diến biến sự xuất hiện vi rút cúm A/H5N1 tại Việt Nam

Đã có 8 clade vi rút cúm A/H5N1 xuất hiện ở Việt Nam, trong đó 5 clade lưu hành phổ biến Những chủng/biến chủng vi rút này có thể do lây lan từ bên ngoài hoặc do tái tổ hợp hình thành trong nước Để phòng bệnh, chương trình Quốc gia

áp dụng các biện pháp tổng hợp, trong đó văc xin là một biện pháp quan trọng

1.6 Vắc xin cúm A/H5N1 nội địa và tồn tại cần nghiên cứu

Diễn biến “biến chủng” của vi rút cúm A/H5N1 xảy ra rất nhanh, phát triển văc xin luôn là đòi hỏi cấp bách, đặc biệt là phát triển và sản xuất văc xin nội địa Tiêm phòng là biện pháp chủ động phòng dịch cúm, trong đó phòng bệnh cho thủy cầm, vịt nuôi vốn được coi là loài mang trùng là hết sức quan trọng

Văc xin đã bắt đầu được sản xuất tại Việt Nam nhưng chủng văc xin do nước ngoài tạo ra từ chủng đã lưu hành trước đây, ít hoặc không còn phù hợp để phòng bệnh do các chủng mới Mấu chốt của phát triển văc xin là lựa chọn chủng, tạo giống gốc có miễn dịch cao kháng chủng đang lưu hành ở thủy cầm (vịt)

2 Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Đối tượng và nội dung nghiên cứu

(1) Nghiên cứu chọn chủng vi rút để chế tạo văc xin cúm A/H5N1

- Nghiên cứu xác định các subtype vi rút cúm A/H5N1 lưu hành phổ biến tại Việt Nam

- Nghiên cứu lựa chọn sơ bộ chủng tiềm năng để sản xuất văc xin từ nguồn vi rút hồi cứu và phân lập

- Nghiên cứu lựa chọn chủng vi rút cúm A/H5N1 đại diện cho clade 2.3.2.1c hiện đang lưu hành

- Nghiên cứu quan hệ di truyền và kháng nguyên giữa đại diện các subtype vi rút cúm A/H5N1 lưu hành phổ biến tại Việt Nam

(2) Nghiên cứu thích nghi chủng tiềm năng để làm giống gốc sản xuất văc xin

- Nghiên cứu xác định đặc tính di truyền của chủng tiềm năng làm giống gốc sản xuất văc xin

- Nghiên cứu thích nghi vi rút chủng tiềm năng trên phôi trứng gà

- Nghiên cứu thích nghi vi rút chủng tiềm năng trên tế bào dòng

- Nghiên cứu đặc tính độc lực của chủng đã thích nghi qua tiếp đời

- Nghiên cứu đặc tính di truyền của chủng đã thích nghi qua tiếp đời

- Nghiên cứu đặc tính kháng nguyên của chủng đã thích nghi qua tiếp đời

(3) Nghiên cứu khả năng tạo miễn dịch bảo hộ của văc xin vô hoạt chế từ chủng gốc đã thích nghi

- Nghiên cứu khả năng gây miễn dịch của văc xin vô hoạt chế từ chủng gốc đã thích nghi trên gia cầm

- Nghiên cứu xác định liều thử thách cường độc sử dụng trong đánh giá hiệu lực của văc xin

- Nghiên cứu khả năng bảo hộ nguyên chủng và bảo hộ chéo của văc xin cúm

vô hoạt chế từ chủng gốc đã thích nghi

- Nghiên cứu đặc tính miễn dịch bảo hộ và thải trùng của văc xin cúm vô hoạt chế từ chủng gốc đã thích nghi

- Nghiên cứu thử nghiệm bảo hộ của văc xin cúm A/H5N1 vô hoạt chế từ chủng gốc trên vịt nuôi tại thực địa

2.2 Thời gian, địa điểm

Thời gian: Từ 12/2011 đến 10/2014

Địa điểm Thực địa: Mẫu bệnh phẩn dùng để phân lập vi rút cúm A/H5N1 được thu thập từ các địa phương thông báo có dịch Thử đáp ứng miễn dịch thực địa tại trại chăn nuôi gia cầm thôn Thụy Ứng, thị trấn Phùng, Đan Phượng, Hà Nội

Phòng thí nghiệm: Phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp độ 2 Plus của Viện Thú Y và Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc Thú y Trung ương I

2.3 Vật liệu nghiên cứu

Động vật thí nghiệm, vịt, gà, gà đẻ và trứng không mang kháng thể kháng vi rút cúm A/H5N1 chủ yếu từ nguồn nuôi ở khu cách ly tại Viện Thú Y; tế bào dòng

do ĐH Hồng Kông cung cấp

Vi rút cúm A 268 chủng trước năm 2010 hồi cứu từ nguồn lưu trữ tại Viện Thú

Y, 119 chủng phân lập từ 2010 đến 7/2013; 4 chủng vi rút cúm A/H5N1 tham chiếu phòng thí nghiệm do Viện Thú Y cung cấp Huyết thanh chuẩn do PTN tham chiếu Italia và Viện Thú Y cung cấp

Sử dụng 4 loại kít chuẩn phân tích DNA và các hóa chất siêu sạch Phòng thí nghiệm an toàn sinh học BSL2 plus và ABSL2 plus và các trang thiết bị hiện đại

2.4 Phương pháp nghiên cứu

Đề tài luận án đã sử dụng 19 kỹ thuật và phương pháp khác nhau:

2.4.6 Phương pháp phân lập vi rút, cấy truyền trên phôi trứng gà

2.4.7 Phương pháp nuôi cấy tế bào

2.4.8 Phương pháp phân lập và cấy truyền vi rút trên tế bào MDCK

2.4.9 Phương pháp chuẩn bị kháng nguyên cúm A/H5N1

2.4.10 Phương pháp bất hoạt vi rút cúm A/H5N1

2.4.11 Phương pháp lọc cô đặc vi rút

2.4.12 Phương pháp bổ trợ, tạo nhũ kháng nguyên

2.4.13 Phương pháp chế tạo kháng thể đa dòng

2.4.14 Phản ứng ngưng kết hồng cầu (Haemagglutination- HA)

2.4.15 Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI)

2.4.16 Phản ứng HI xác định type huyết thanh

2.4.17 Phương pháp xác định chỉ số gây bệnh IVPI

2.4.18 Phương pháp xác định LD50 và liều gây chết 100% gà thí nghiệm

2.4.19 Phương pháp xác định MLD và liều gây chết 80% vịt thí nghiệm

2.5 Thiết kế và bố trí thí nghiệm

2.5.1 Bố trí thí nghiệm chọn chủng vi rút cúm A/H5N1

2.5.2 Bố trí thí nghiệm chọn chủng đại diện cho clade 2.3.2.1

2.5.3 Phương pháp thích nghi vi rút cúm A/H5N1 trên phôi và tế bào

2.5.4 Phương pháp đánh giá sự ổn định của vi rút cúm A/H5N1 tiếp đời

2.5.5 Phương pháp đánh giá đáp ứng miễn dịch ở gà, vịt phòng thí nghiệm 2.5.6 Phương pháp đánh giá đáp ứng miễn dịch ở gà, vịt tại thực địa

2.5.7 Phương pháp phân tích số liệu

3 Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nghiên cứu chọn chủng vi rút để chế tạo văc xin cúm A/H5N1

3.1.1 Kết quả xác định subtype vi rút cúm A/H5N1 lưu hành tại Việt Nam

Để xác định các subtype vi rút cúm A/H5N1 đã lưu hành tại Việt Nam, chúng tôi đã truy cập genbank quốc tế, tải các trình tự gene HA của vi rút cúm A/H5N1

có nguồn gốc từ Việt Nam, lược bỏ những trình tự hoàn toàn giống nhau và xây dựng cây phả hệ của gene HA Kết quả được trình bày ở hình 3.1

Từ kết quả phân tích phả hệ cho thấy, cho đến thời điểm tháng 7/2013, các vi rút cúm A/H5N1 đã lưu hành ở Việt Nam chủ yếu gồm 5 clade chính: Clade 1; clade 2.3.4, clade 2.3.2.1a, clade 2.3.2.1b và clade 2.3.2.1c

3.1.2 Kết quả lựa chọn sơ bộ chủng tiềm năng để sản xuất văc xin

Nguồn vi rút cúm A/H5N1

Chúng tôi đã sử dụng nguồn gene vi rút tại Viện thú y đến năm 2010 và các chủng vi rút mới phân lập 2010-7/2013 để lựa chọn sơ bộ vi rút cúm A/H5N1 làm ứng viên chủng vắc xin Nguồn gốc chủng được trình bày ở bảng 3.1

Ngân hàng vi rút gồm 268 chủng (trước 2010) và 119 chủng phân lập mới từ

2011 đến 7/2013 Trong tổng số 387 chủng qua sàng lọc sơ bộ bằng RT-PCR, sử dụng các cặp mồi đặc hiệu cho H5 và N1, 227 chủng dương tính H5N1 Phân tích ngẫu nhiên 90 chủng chúng tôi thu được 68 chủng có hiệu giá HA từ 7log2 trở lên

Bảng 3.1 Nguồn gốc vi rút cúm A/H5N1 trong lựa chọn sơ bộ

TT Thời gian (ngân hàng) Số vi rút Số vi rút H5N1* Số lựa chọn Số có [HA] ≥ 7 log

*Kết quả RT-PCR xác định H5 và N1; **Chỉ tính số giải trình tự ở nghiên cứu này

Nguồn gốc vi rút sơ tuyển theo clade vi rút cúm A/H5N1 đã lưu hành:

Chúng tôi đã giải trình tự phân đoạn 4 mã hóa cho gene HA của 53 chủng (trong số 68 chủng có hiệu giá HA cao), phân tích phả hệ (hình 3.2) và thông tin chi tiết về nguồn gốc chủng (bảng 3.2) cho biết trong bộ sưu tập 53 chủng sơ tuyển này có đầy đủ vi rút đại diện các clade vi rút cúm A/H5N1 lưu hành phổ biến nhất

ở Việt Nam từ 2003 đến 2013: 2 chủng thuộc clade 1, 12 chủng thuộc clade 2.3.4,

14 chủng thuộc clade 2.3.2.1a, 11 chủng clade 2.3.2.1b và 14 chủng clade 2.3.2.1c

3.1.3 Kết quả lựa chọn chủng vi rút cúm A/H5N1 đại diện clade 2.3.2.1c

Để lựa chọn một chủng đại diện cho clade 2.3.2.1c hiện đang lưu hành chúng tôi lần lượt khảo sát các chỉ tiêu nhân lên của 12 chủng (cùng clade như phân loại ở hình 3.2) vi rút trên phôi gà, trên tế bào MDCK, chỉ tiêu độc lực vi rút và quan trong nhất là chỉ tiêu đại diện kháng nguyên tính cho cả nhóm chủng Kết quả lần lượt được trình bày từ bảng 3.3 đến 3.7

Tại bảng 3.3, kết quả xác định hiệu giá HA ở nước trứng tiếp đời cho thấy có 7 chủng với hiệu giá HA lần sau cao hơn lần trước và đạt 8log2HA Đây là những chủng sẽ ưu tiên lựa chọn do chúng tăng khả năng thích nghi trên phôi gà khi tiếp đời Xét về chỉ số gây nhiễm 50% phôi trứng (EID50, bảng 3.4), có 3 chủng cho chỉ

số 6,3log10EID50, cả ba chủng này đều thuộc nhóm có hiệu giá HA cao (bảng 3.3) Bảng 3.5 so sánh đồng thời EID50 và chỉ số TCID50 cho biết có 03 chủng nhân lên tốt cả trên trên phôi gà và trên tế bào MDCK, tuy nhiên trong số này chỉ có 2 chủng thuộc có EID50 cao nhất

Đối chiếu từ bảng 3.3 đến 3.5, chỉ có hai chủng: chủng A/MD/VNHN/72a/12

và chủng A/Dk/VN/QB7412 phù hợp cả 3 tiêu chí Hai chủng này sẽ được ưu tiên lựa chọn chủng để phát triển văc xin trên cả phôi trứng và tế bào

Bảng 3.6 Trình tự axit amin tại cleavage site của các chủng phân lập

Các Amino acid bề mặt Glycosyl

TT Tên chủng Trình tự amino acid

Đặc tính chỉ báo di truyền về độc lực và kháng nguyên bề mặt: Vi rút cúm

A gây nhiễm cho gia cầm nhờ điểm cấu trúc trên protein HA1 nhận biết và bám vào thụ thể trên tế bào của ký chủ

Bảng 3.6 (trích đoạn những amino acid tại điểm cấu trúc quan trọng của protein HA1) cho biết (i) Cả 12 chủng vi rút đều có điểm chỉ báo clevaege site là

cao (theo OFFLU); (ii) Hai điểm Glycosyl hóa NSS hoặc NTS tại vị trí amino acid 140-142 và điểm NNT ở vị trí 165-167 (điểm thứ hai này được biết tương đồng với chủng có độc lực cao); và (iii) Điểm quyết định tính đặc hiệu kháng nguyên (nhận biết kháng thể trung hòa) là đặc trưng của vi rút clade 2.3.2.1c : L129, N140, S141, D154, N155, K162, và R189 (theo cấu trúc không gian mới đăng tải năm 2013) Cấu trúc của protein HA của 12 chủng là tương đồng

Về độc lực, chỉ số tiêm tĩnh mạch

(IVPI) của 12 chủng vi rút đều đạt 3,

chứng tỏ chúng đều là những chủng có độc

lực mạnh, không có sự khác biệt về chỉ số

IVPI nên không áp dụng được tiêu chí độc

lực cao hơn trong lựa chọn

Tính tương đồng kháng nguyên giữa

các chủng vi rút phân lập: Chúng tôi đã

chế tạo kháng thể đa dòng từ hai chủng lựa

chọn ở phần trên, thực hiện phản ứng HI

với cả 12 chủng (bảng 3.7) Phản ứng

kháng nguyên-kháng thể nội nhóm cho

thấy: (i) tương đồng nhận biết chéo là cao

(trên 6,5log2 so với nguyên gốc 8log2);

(ii) kháng thể HTαQB7412 có khả năng

cho miễn dịch chéo với các chủng cao hơn

so với kháng thể HTαHN72a12 Như vậy

chủng A/Dk/VN/QB7412 có thêm ưu thế

được lựa chọn

3.1.4 Quan hệ di truyền và kháng nguyên giữa đại diện 5 clade phổ biến

Để xác định mối quan hệ của chủng được lựa chọn để phát triển văc xin với vi rút các clade đã lưu hành phổ biến trước đây, chúng tôi phân tích tương quan di truyền và kháng nguyên của vi rút cúm A/Dk/VN/QB7412 với 4 chủng đại diện cho các clade lưu hành phổ biến trước đây Sự lựa chọn những chủng này cũng được tiến hành như quá trình lựa chọn chủng A/Dk/VN/QB7412 đã trình bày Bảng 3.8 cung cấp thông tin về nguồn gốc 4 chủng cùng chủng đã lựa chọn

Quan hệ di truyền và vị trí của 5 chủng đại diện được trình bày trong cây phả

hệ hình 3.3 Các chủng này xuất hiện vào các thời điểm khác nhau và thuộc về các clade khác nhau (bảng 3.8 và hình 3.3) Bảng 3.9 cung cấp thông tin về tương đồng trình tự nucleotide (phía trên bảng) và amino acid (phía dưới) giữa 5 chủng đại diện của 5 clade (clade 1, clade 2.3.4, 2.3.2.1a, 2.3.2.1b và 2.3.2.1c), trong đó mức tương đồng gene HA cao nhất là giữa vi rút A/MDk/VN/TB0410 và vi rút