tách dòng, biểu hiện gen mã hóa protein p24 của virus hiv-1 phân type crf01_ae lưu hành tại việt nam và ứng dụng protein tái tổ hợp trong chẩn đoán

Vì vậy, công tác phát hiện và kiểm soát sự lây lan của dịch bệnh được coi là giải pháp phù hợp với điều kiện các nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam.. Giới thiệu chung Về nguồn g

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

………… o0o…………

TRẦN MINH ĐỨC

TÁCH DÕNG, BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN P24 CỦA VIRUS HIV – 1 CRFO1_AE LƯU HÀNH TẠI VIỆT NAM VÀ ỨNG DỤNG PROTEIN TÁI TỔ

HỢP TRONG CHẨN ĐOÁN

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

………… o0o…………

TRẦN MINH ĐỨC

TÁCH DÕNG, BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN P24 CỦA VIRUS HIV – 1 CRFO1_AE LƯU HÀNH TẠI VIỆT NAM VÀ ỨNG DỤNG PROTEIN TÁI TỔ

HỢP TRONG CHẨN ĐOÁN

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

MỞ ĐẦU

Đại dịch HIV/AIDS đang là một vấn đề nan giải và là mối hiểm họa đối với nhân loại Kể từ khi ca nhiễm bệnh đầu tiên được phát hiện vào năm 1981 cho đến nay đại dịch HIV/AIDS đã gây ra cái chết cho hàng triệu người mỗi năm Theo báo cáo của tổ chức phòng chống AIDS toàn cầu (UNAIDS) thì tính đến hết năm 2009 trên thế giới có khoảng 33,3 triệu người vẫn đang sống chung với HIV, và riêng trong năm 2009 có khoảng 1,8 triệu người tử vong do các bệnh liên quan đến HIV/AIDS [36]

HIV/AIDS không những là nguyên nhân gây tỉ lệ tử vong cao ở người mà còn tác động tiêu cực tới sự phát triển kinh tế xã hội mỗi quốc gia, nhất làcác nước đang phát triển Với cơ sở hạ tầng, trang thiết bị kỹ thuật y tế còn nhiều yếu kém thì việc chăm sóc và điều trị bệnh nhân HIV/AIDS ở các nước này gặp rất nhiều khó khăn Vì vậy, công tác phát hiện và kiểm soát sự lây lan của dịch bệnh được coi là giải pháp phù hợp với điều kiện các nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam

Việt Nam là một trong những nước có tỉ lệ nhiễm HIV cao trên thế giới Theo báo cáo của Bộ Y tế thì tính đến ngày 30/9/2010, cả nước có 180.312 người đang sống chung với virus chết người này, trong đó có 42.339 bệnh nhân AIDS và tổng số người chết do AIDS đã được báo cáo là 48.368 người Số lượng người nhiễm HIV cao sẽ là gánh nặng với xã hội và nền kinh tế [10]

Hiện nay, vấn đề sản xuất thuốc điều trị và vaccine phòng ngừa HIV/AIDS vẫn là một bài toán hóc búa đối với nền y học thế giới Mặc dù các nghiên cứu trong những năm gần đây đã mang lại nhiều kết quả tích cực xong vẫn chưa có vaccine phòng chống HIV Trong bối cảnh diễn biến tình hình dịch bệnh ở nước ta hiện nay ngày càng phức tạp, việc chẩn đoán sớm để có các biện pháp phòng ngừa hữu hiệu

là rất cần thiết

Trên thị trường Việt Nam đã xuất hiện rất nhiều loại Kit chẩn đoán HIV nhưng đa phần là nhập ngoại, các loại Kit này thường có giá thành cao và có thể không phù hợp với các phân type HIV đang lưu hành tại Việt Nam Do đó, việc

nghiên cứu phát triến các bộ Kit chẩn đoán HIV có độ nhạy, độ đặc hiệu cao trên cơ

sở các kháng nguyên có nguồn gốc từ các chủng virus đang lưu hành trong nước có

ý nghĩa rất lớn cả về mặt khoa học cũng như thực tiễn

Xuất phát từ những vấn đề nêutrên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu:

“Tách dòng, biểu hiện gen mã hóa protein P24 của virus HIV-1 phân type CRF01_AE lưu hành tại Việt nam và ứng dụng protein tái tổ hợp trong chẩn đoán”

Nghiên cứu này được thực hiện tại phòng Vi sinh Vật học Phân tử – Viện Công nghệ Sinh học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Virus gây suy giảm miễn dịch ở người (Human immunodeficiency

virus – HIV)

1.1.1 HIV là gì?

HIV (Human Immunodeficiency Virus) - virus gây suy giảm miễn dịch ở người, là loại virus khi xâm nhập vào cơ thể gây hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS), dẫnđến nguy cơ nhiễm các bệnh cơ hội và làm cho bệnh nhân dễ mắc phải ưng thư và những tác động do chính HIV gây ra [1]

HIV chủ yếu lây nhiễm các tế bào quan trọng trong hệ thống miễn dịch của người như là tế bào T trợ giúp (đặc biệt là T CD4+), các đại thực bào và các tế bào đuôi gai Lây nhiễm HIV dẫn đến sự giảm số lượng tế bào T CD4+ theo 3 cơ chế chính sau: Một là, các tế bào nhiễm bị giết chết trực tiếp bởi virut; hai là, tăng tỉ lệ

tế bào chết theo chương trình; ba là, sự giết chết tế bào T CD4+ bị nhiễm bởi tế bào lympho gây độc CD8 Khi số lượng tế bào T CD4+ suy giảm xuống dưới một mức nhất định thì quá trình miễn dịch qua trung gian tế bào bị mất, cơ thể dễ mắc các bệnh nhiễm trùng cơ hội [54]

1.1.2 Đặc điểm của virus HIV

1.1.2.1 Giới thiệu chung

Về nguồn gốc của virus HIV gây suy giảm miễn dịch ở người thì vẫn là một câu đố đối với các nhà khoa học kể từ khi trường hợp mắc bệnh đầu tiên được phát hiện đầu những năm 80 của thế kỷ trước

Ngày nay thì mọi người đều đồng ý rằng HIV có quan hệ họ hàng với virus gây suy giảm miễn dịch ở khỉ - SIV (simian immunodeficiency virus) Đặc biệt là công bố vào năm 1999 của một số nhà nghiên cứu tại Đại học Alabama, họ nhận thấy rằng HIV-1(một type HIV) rất giống SIV tinh tinh (SIVcpz) Nguồn gốc động

vật, thời gian và địa điểm chính xác của sự lây truyền hiện vẫn chưa rõ và là đề tài cho các cuộc khảo sát và tranh luận [21]

HIV thuộc nhóm Lentivirus và thuộc họ Retroviridae

Lentivirus (lenti có nghĩa là chậm), loài virus đặc trưng bởi thời gian dài ủ

bệnh Lentivirus có thể truyền thông tin di truyền của mình vào DNA tế bào chủ và loài duy nhất trong các Retrovirus có khả năng tái bản mà không thông qua phân

chia tế bào [61]

HIV có những đặc trưng của retrovirus:

• Là một loại virus RNA, nhưng có một enzyme phiên mã ngược, mà bản chất là DNA polymerase phụ thuộc RNA Với enzyme phiên mã ngược này cho

phép tổng hợp một DNA kép trong tế bào chủ mà retrovirus xâm nhập

• DNA mới được tạo ra đều có những đoạn tự lặp lại, có kích thước khác nhau được gọi là đoạn cuối dài tự lặp lại, nhờ vậy mà gắn được một cách ổn định trong nhiễm sắc thể của tế bào chủ và trở thành một tiền virus (provirus) Tiền virus này sẽ như một gen của tế bào và truyền sang cho thế hệ khác khi có sự phân bào, hoặc được phiên mã thành RNA thông tin, tổng hợp protein của virus để hình thành một virus hoàn chỉnh

HIV có các đặc trưng của một Lentivirus :

 Phát triển chậm

 Không biến đổi tế bào nhưng lại làm tiêu huỷ tế bào

 Cấu trúc kháng nguyên dễ biến đổi [1], [6]

1.1.2.2 Phân loại HIV

HIV là loại virus có tính biến đổi cao và dễ xảy ra đột biến Điều này có nghĩa

là sẽ có nhiều chủng HIV khác nhau, thậm chí chúng có thể cùng lây nhiễm vào một

chúng đều là nguyên nhân dẫn đến triệu chứng lâm sàng bệnh AIDS nhưng khó phân biệt được là do type nào gây ra HIV-1 thì có mức độ lây lan rộng, còn HIV-2

khó lây nhiễm hơn, thời kì ủ bệnh cũng dài hơn [40]

HIV-1 đã được Luc Montagnier và các cộng sự ở viện Pasteur Paris phát hiện vào năm 1983 [48] HIV-1 được chia ra làm 4 nhóm: Nhóm M (major), nhóm

O (outlier), 2 nhóm mới N và P (hình 1.1) [40]

 Nhóm O thì chỉ xuất hiện giới hạn ở khu vực Tây-Trung phi

 Nhóm N - một chủng được phát hiện năm 1998 ở Cameroon thì lại rất hiếm xuất hiện

 Nhóm P - một chủng mới, có quan hệ rất gần với virus gây suy giảm miễn dịch ở khỉ được phát hiện ở người phụ nữ Cameroon vào năm 2009 [39]

 Nhóm M chiếm hơn 90% HIV-1 gây đại dịch trên toàn thế giới Trong nhóm M lại chia ra thành các phân type: A, B, C, D, E, F, G, H, I, J và K Đôi khi có hiện tượng 2 virus thuộc 2 phân type khác nhau, cùng hiện diện trong tế bào người nhiễm và hòa trộn các chất liệu di truyền để tạo thành 1 virus lai mới Nhiều virus thuộc chủng mới này có khả năng sống sót không cao, nhưng chủng nào lây nhiễm được sẽ gọi là CRF (Circulating Recombinat Forms) CRF A/E được coi là sự lai tạo giữa phân type A và 1 phân type gốc là E Tuy nhiên, vì chưa tìm thấy được phân type E ở dạng riêng rẽ nên hầu hết người ta coi CRF A/E là phân type E (trên thực tế tên gọi đúng hơn là CRF01_AE) [40]

HIV-2 được phát hiện ở các bệnh nhân ở Cameroon vào năm 1985 và thường chỉ thấy xuất hiện ở tây phi, rất ít gặp ở nơi nào khác [49] HIV-2 cũng được chia

thành 8 phân type là A, B, C, D, E, F, G, H (hình 1.1) [34,42]

Trong giới hạn của luận văn này, tôi chỉ tìm hiểu loại HIV-1 là loại virus gây

ra đại dịch HIV/AIDS trên thế giới

1.1.2.3 Đặc điểm hình thái và cấu trúc của HIV

HIV có dạng hình cầu, kích thước 100 – 120nm Về cấu tạo thì HIV gồm 3

phần chính là lớp vỏ, lớp protein nền và lõi capsid (hình 1.2) [1]

 Lớp vỏ (Envelope): Vỏ ngoài có cấu tạo từ lớp lipid kép với các gai

glycoprotein Mỗi gai có hai tiểu đơn vị glycoprotein có khối lượng 41kDa là gp41 cắm xuyên màng và glycoprotein có khối lượng 120kDa (gp120) gắn với gp41 nhờ cầu nối disulfua tạo thành gp160

 Lớp Protein nền (Matrix protein): Nằm ngay sau lớp vỏ là lớp protein

nền có khối lượng phân tử 17kDa (p17)

 Lõi capsid: Có dạng hình trụ lệch tâm, được cấu thành bởi các protein

có khối lượng 24kDa (p24) Bên trong là hai sợi RNA đơn, protein lõi (p7 và p9) và enzyme phiên mã ngược [1]

Hình 1.2: Sơ đồ cấu trúc của virus HIV[50]

1.1.2.4 Cấu trúc hệ gen HIV

Genome của HIV bao gồm hai chuỗi RNA đơn, giống nhau Mỗi chuỗi có kích thước khoảng 9200bp, gồm có 9 gen với 2 nhóm chính: nhóm gen cấu trúc

(gag, pol, env) và nhóm gen điều hòa (tat, rev, nef, vif, vpr, vpu) (hình 1.3) [50]

 Nhóm gen cấu trúc

 Gag (group-specific-antigen): mã hoá các kháng nguyên đặc hiệu

nhóm bao gồm các gen mã hóa tổng hợp protein nền, lõi capsid và các cấu trúc protein lõi (nuclecapsid protein)

 Pol (polymerase): mã hóa tổng hợp protease, enzyme phiên mã

ngược và intergrase

 Env (envelope): mã hóa tổng hợp kháng nguyên bề mặt gp160 với hai

tiểu phần là gp41 và gp120

 Nhóm gen điều hòa

 Tat (Trans Activator of Transcription – yếu tố hoạt hóa phiên mã)

Gen tat kích hoạt các gen mã hoá protein cấu trúc, protein điều hòa (kể cả gen tat) Gen tat mã hóa tổng hợp protein Tat, có 102 amino acid, protein

này chịu trách nhiệm hoạt hóa phiên mã virus thông qua việc tạo ra vị trí gắn

cho RNA pol 2 và các protein khác của tế bào

 Rev (Regulator of Expression of Virion proteins – yếu tố điều hòa

sự biểu hiện các protein hạt virus) : Gen rev có chức phận điều chỉnh quá

trình nhân lên của virus thông qua gen tat và nef, mã hóa tổng hợp cho

protein Rev Rev bao gồm 117 amino acid, protein này có chức năng chuyển

mRNA ra tế bào chất

 nef (Negative Regulator Factor - yếu tố điều hòa âm): mã hóa cho

protein Nef, ức chế hoặc tăng cường sự tái bản virus, phụ thuộc vào chủng và

loại tế bào Trong các tế bào nhiễm, Nef sẽ thay đổi con đường vận chuyển endosome, qua đó giảm sự biểu hiện các protein CD4, MHC I và MHC II ở

bề mặt tế bào nhiễm Những thay đổi này có thể bảo vệ các tế bào nhiễm

HIV khỏi sự giám sát miễn dịch

 Vif (Virion Infectivity Factor - yếu tố lây nhiễm của virus): mã hóa

protein Vif, làm tăng tính thâm nhập của virus vào các tế bào chủ tự do và

giúp ngăn chặn sự xâm nhập của các enzyme tế bào chủ ngăn cản sự tái bản

virus vào các virion mới hình thành

 Vpu (Viral Protein U - protein U của virus): mã hóa protein Vpu, có

tác dụng tăng cường sự giải phóng virus khỏi tế bào, làm giảm sự biểu hiện

của CD4, MHC I trên bề mặt tế bào

 Vpr (Viral Protein R - protein R của virus): mã hóa protein Vpr, có

tác dụng tăng cường sự tái bản virus trong các tế bào ban đầu, là protein liên kết với virion, ngăn cản pha G2/M, là tín hiệu định vị nhân [43], [44], [46]

Hình 1.3: Sơ đồ cấu trúc genome HIV[44]

1.1.3 Chu trình virus HIV

HIV có khả năng xâm nhập rất nhiều loại tế bào: tế bào lympho T hỗ trợ (TH)

có thụ thể CD4, tế bào đơn nhân, đại thực bào và các tế bào tương tự như: tế bào tua (ở da và niêm mạc (Langerhans), ở hạch lympho), tế bào thần kinh đệm (microglia) của hệ thần kinh trung ương Nhưng xét về sinh bệnh học, tế bào lympho T có CD4

và hệ thống đại thực bào đơn nhân là tế bào đích chính của HIV CD4 là protein tiếp nhận, giúp cho HIV gắn với tế bào [1], [17]

Sự xâm nhập và nhân lên của virus HIV có thể chia làm bốn giai đoạn chính:

Gắn kết và xâm nhiễm vào tế bào; phiên mã ngược và cài xen; sao chép và dịch mã; lắp ráp và trưởng thành (hình 1.4)

Hình 1.4: Sơ đồ minh họa chu trình nhân lên của HIV-1[17]

Gắn kết và xâm nhiễm tế bào

HIV bắt đầu chu trình của mình bằng việc gắn protein vỏ gp120 với thụ thể CD4 và đồng thụ thể trên bề mặt tế bào Tương tác của gp120 với thụ thể và đồng thụ thể gây ra một sự sắp xếp lại cấu trúc không gian của gp41, qua đó tạo ra sự dung hợp màng virion và màng tế bào Khi xâm nhiễm thì RNA và một số vật liệu

di truyền của virus được giải phóng vào trong tế bào chủ [18]

Phiên mã ngƣợc và cài xen

Sự phiên mã ngược tạo DNA mạch kép từ RNA genome virus dưới sự hoạt

động của enzyme reverse transcriptase xảy ra sau khi virus xâm nhiễm tế bào Quá

trình sao chép ngược này có thể bị lỗi và dẫn đến xuất hiện các đột biến Những đột biến như vậy có thể gây ra sự kháng thuốc [1]

DNA mạch kép mới được đưa vào nhân tế bào, tại đây xảy ra hiện tượng cài xen DNA virus vào genome của tế bào dưới sự xúc tác của enzyme integrase để tạo thành các provirus Các provirus này có thể tồn tại ở trạng thái không hoạt trong nhiều năm, có thể sản sinh rất ít hoặc không sản sinh bản sao nào [19]

Sao chép và dịch mã

Ngay sau khi tế bào vật chủ nhận được tín hiệu hoạt động, provirus sử dụng enzyme RNA polymerase của tế bào vật chủ để sao chép tổng hợp các vật liệu di truyền của HIV như là các RNA genome và các mRNA có kích thước ngắn hơn Các mRNA được sử dụng như một khuôn để tổng hợp các protein virus HIV [19]

Bản phiên mã ban đầu có chiều dài xấp xỉ bằng phân tử RNA monomer (khoảng 9,3 kb), sau đó một phần được gắn đuôi polyA ở đầu 3’ và gắn mũ metylguanin ở đầu 5’ tạo thành các mRNA để dịch mã tạo các protein sớm và protein muộn; phần còn lại không được gắn mũ và đuôi polyA sẽ đóng vai trò làm RNA genome của các virus thế hệ sau [34]

Lắp ráp và trưởng thành

Giai đoạn cuối cùng của chu trình tái bản virus, tạo thành các hạt virus HIV hoàn chỉnh được bắt đầu tại màng sinh chất của tế bào chủ Protein Env (gp160) đi qua màng lưới nội chất và được vận chuyển vào phức hệ Golgi, nơi mà chúng sẽ bị enzyme protease phân cắt tạo thành 2 glycoprotein vỏ gp41 và gp120 Các protein này được vận chuyển vào màng sinh chất tế bào vật chủ Các polyprotein Gag (p55)

và Gag-Pol (gp160) cũng liên kết với bề mặt phía trong màng và cùng với RNA genome virus khi hạt virus định hình bắt đầu nảy chồi từ tế bào vật chủ

Sự trưởng thành xảy ra ở cả dạng mới nảy chồi hoặc ở dạng hạt virus trưởng thành sau khi được giải phóng khỏi tế bào vật chủ Trong quá trình trưởng thành, protease của HIV phân cắt các polyprotein thành các enzyme và protein cấu trúc Các thành phần cấu trúc khác nhau sau đó được lắp ráp thành hạt virus HIV trưởng thành Giai đoạn phân cắt có thể bị ức chế bởi các protease Hạt virus trưởng thành sau đó có thể đi lây nhiễm tế bào khác và bắt đầu một chu trình tương tự [20]

1.2 Protein P24

1.2.1 Cấu trúc và chức năng của P24

Protein p24 là thành phần chủ yếu cấu tạo nên lõi capsid của HIV-1 và hình

thành cấu trúc vỏ hình nón đặc trưng (hình 1.5), bao quanh phức hợp RNA-

nucleoprotein của hạt virus trưởng thành, đồng thời cũng là vị trí mà cycophilin A gắn với nhóm protein Gag và có ý nghĩa quan trọng trong quá trình nhân lên của

virus [25] Protein p24 được mã hóa bởi gen Gag của HIV-1, gồm 231 amino acid

và có khối lượng phân tử xấp xỉ 24 kDa [23, 27]

Gen Gag của HIV-1 mã hóa tổng hợp cho một khung đọc mở của protein có

khối lượng phân tử 55kDa (p55) Protein p55 được cấu thành từ 3 protein thành

phần, protein nền P17, protein P24 và protein nucleocapsid p15 Các protein thành phần sẽ được giải phóng khi p55 bị thủy phân bởi protease hạt virus [24]

Trong virus HIV-1 trưởng thành, lõi capsid hình nón được cấu thành từ khoảng 1500 phân tử protein P24 Các phân tử này đóng gói với nhau để tạo nên cấu trúc mắt lưới 6 cạnh (hexamer) và bao bọc lấy RNA genome virus [30] Sự đóng gói genome virus và sự liên kết với các enzyme vào trong lõi capsid là rất cần thiết trong quá trình xâm nhập các tế bào chủ của virus [31]

Hình 1.5: Cấu trúc lõi capsid[30]

Có khoảng 250 hexamer tham gia lắp ráp tạo nên một cấu trúc protein lõi capsid hoàn chỉnh Mỗi hexamer bao gồm 6 domain đầu N-terminal xếp vòng tròn quanh một lõi trung tâm, bao bọc lấy vòng tròn này là 6 domain đầu C-terminal di

động ở phía ngoài (hình 1.6) Dựa vào cấu trúc tinh thể từng domain riêng rẽ và dựa

vào dữ liệu hiển vi điện tử lắp ráp của hexamer cho thấy, domain đầu C-terminal tiếp xúc với đầu N-terminal bởi 6 trục và có độ xoay tròn là 600 Do tính linh động của của các domain cho phép các hexamer có cấu hình thích ứng một các linh hoạt trong các trúc cong của protein capsid [31]

Hình 1.6: Cấu trúc Hexamer Capsid của virus HIV [31]

Protein p24 gồm có 2 domain, domain đầu N-terminal (N- terminal domain)

và domain đầu C-terminal (C- terminal domain) liên kết với nhau bởi 1 cầu nối có

tính linh hoạt (hình 1.7) Trong quá trình lắp ráp hạt virus chưa trưởng thành thì cả

2 domain của protein capsid tham gia cấu thành một phần của protein Gag Protein Gag bị thủy phân trong quá trình trưởng thành của virus giải phóng CA protein và các tiểu phần CA tự do tự lắp ráp hình thành cấu trúc lõi capsid hình nón cụt [26]

Hình 1.7: Cấu trúc P24[26]

+ C-terminal domain: có vai trò quan trọng trong quá trình dimer hóa lõi

capsid, oligomer hóa Gag và hình thành hạt virus Domain này cũng bao gồm đoạn trình tự bảo thủ 20 amino acid được gọi là MHR (major homology region), trình tự

này là trình tự bảo thủ ở các retrovirus và nó có vai trò quan trọng trong lắp ráp,

trưởng thành và lây nhiễm của virus [28]

Cấu trúc của domain đầu C-terminal kéo dài từ vị trí amino acid 148 đến 23,

là domain hình cầu, được cấu thành từ 4 chuỗi xoắn và một chuỗi amino acid mở

rộng, tạo nên một cấu trúc dimer tương đối bền vững (hình 1.8) [32]

Hình 1.8: Cấu trúc domain đầu C-terminal của p24[32]

+ N-terminal domain: CA (1-145) là thành phần hình thành lên lõi virus và

gắn kết với cyclophilin A [28] Phân tích cấu trúc dựa trên kỹ thuật MHMRS (Multidimensional Heteronuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) cho thấy đặc điểm cấu trúc của CA (1-145) không giống với protein vỏ virus, mà nó gồm có 7

chuỗi xoắn α, 2 chuỗi β kẹp tóc (hairpin) và vị trí tiếp xúc loop (hình 1.9) [29]

Hình 1.9: Cấu trúc domain đầu N-terminal của p24[29]

1.2.2 P24 và các ứng dụng trong chẩn đoán

Kháng nguyên p24 là protein cấu thành của lõi virus, bao bọc các chất liệu di truyền và là một chỉ số phản ánh sự nhân lên của virus Kháng nguyên p24 tồn tại

dưới dạng tự do hoặc trong phức hợp kháng nguyên - kháng thể Phát hiện kháng nguyên p24 thông thường được sử dụng trong các chẩn đoán [49] :

 Chẩn đoán nhiễm HIV ở trẻ sơ sinh

 Phát hiện sớm giai đoạn mới nhiễm HIV: P24 là một trong những

kháng nguyên xuất hiện rất sớm trước khi kháng thể kháng HIV được tạo ra

 Theo dõi diễn tiến nhiễm HIV: Kháng nguyên p24 xuất hiện rất sớm

ở giai đoạn mới nhiễm Sau một thời gian, kháng thể kháng p24 mới được tạo ra Cùng với sự xuất hiện kháng thể, nồng độ kháng nguyên p24 tự do trong máu giảm Ở giai đoạn cuối, cùng với sự giảm kháng thể kháng p24, sự tái xuất hiện và gia tăng nồng độ p24 tự do là một tiên lượng chuyển sang AIDS

 Theo dõi đáp ứng điều trị với thuốc kháng virus

 Phát hiện có sự nhân lên của virus

Với đặc điểm là kháng nguyên xuất hiện sớm (3-6 tuần) ở giai đoạn cửa sổ trong diễn biến quá trình nhiễm HIV/AIDS, p24 đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong sản xuất các bộ Kit chẩn đoán sớm sự lấy nhiễm của virus Trên thế giới hiện có rất nhiều loại Kit chẩn đoán nhanh HIV đang được sử dụng Hầu hết các Kit chẩn đoán HIV bằng kỹ thuật ELISA hay Western blot đều dựa vào việc phát hiện p24 hoặc gp41 hoặc cả p24/gp41 So với các phương pháp chẩn đoán HIV dựa trên việc phát hiện RNA của virus, phương pháp chẩn đoán HIV dựa trên việc phát hiện kháng nguyên p24 có độ nhậy thấp hơn, và thường không được dùng là phương pháp duy nhất cho chẩn đoán virus HIV [59] Tuy nhiên phương pháp phát hiện p24 đã được gộp vào các phương pháp chẩn đoán HIV thế hệ mới-phương pháp chẩn đoán HIV thế hệ thứ 4, phát hiện đồng thời kháng thể kháng HIV và kháng nguyên p24 trong các mẫu huyết thanh Phương pháp được chứng minh là nhạy hơn và có độ chính xác cao hơn so với các phương pháp chẩn đoán chỉ phát hiện kháng thể kháng HIV [55,56] Ngoài ra sự kết hợp giữa phát hiện kháng nguyên p24 và gp41 có thể giúp xác định các phân type/các kiểu gen

(subtypes/genotypes) khác nhau của HIV [57] Nhiều nghiên cứu cho thấy phương pháp phát hiện p24 của virus HIV có độ chính xác cao và rẻ tiền so với các phương pháp phát hiện RNA của HIV [58]

1.3 Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải-AIDS (Acquired Immuno

deficiency Sydrome)

1.3.1 Khái niệm AIDS

AIDS là tên viết tắt của cụm từ tiếng Anh: Acquired Immuno Deficiency Syndrome (Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải) Trước đây, bệnh được gọi là SIDA (viết tắt từ tiếng Pháp: Syndrome d'Immuno Deficience Acquise), nhưng do tên này trùng với tên của Tổ chức phát triển quốc tế Thụy Điển SIDA và tên của Tổ chức CIDA (Canađa) cũng gọi là "Si đa" nên thống nhất gọi là AIDS để tránh nhầm lẫn và phù hợp với tên quốc tế

AIDS là một bệnh mạn tính do HIV gây ra HIV phá huỷ các tế bào của hệ

miễn dịch, khiến cơ thể bị nhiễm các bệnh nhiễm trùng cơ hội AIDS được coi là giai đoạn cuối của quá trình nhiễm HIV Tuy nhiên, người bị nhiễm AIDS có những triệu chứng khác nhau, tùy theo loại bệnh nhiễm trùng cơ hội mà người đó mắc phải, và khả năng chống đỡ của hệ miễn dịch Bản thân virus và nhiễm trùng được gọi là HIV Thuật ngữ AIDS được dùng để chỉ giai đoạn muộn hơn của bệnh Như vậy, thuật ngữ nhiễm HIV/AIDS được dùng để chỉ những giai đoạn khác nhau của cùng một bệnh [2,33]

1.3.2 Lịch sử xuất hiện HIV/AIDS

Năm 1959, chứng bệnh AIDS được phát hiện lần đầu tiên tại Cộng hòa dân Chủ Congo, nhưng thời điểm đó chưa ai biết bệnh đó là do HIV gây ra [51] Mãi tới năm 1981, bệnh AIDS trên lâm sàng mới được phát hiện tại Mỹ Đó là 5 trường hợp đồng tính luyến ái nam bị viêm phổi nặng ở Los Angeles, và nhiều trường hợp ung thư da Kaposi được báo cáo ở New York Đến cuối 1982, dựa trên những trường hợp AIDS đầu tiên được thông báo, CDC (trung tâm kiểm soát dịch bệnh của Mỹ – Centers for Disease Control) đã đưa ra tiêu chuẩn đầu tiên về các triệu chứng lâm

sàng chẩn đoán bệnh AIDS khi chưa có phương pháp xét nghiệm căn nguyên [14], [52]

Năm 1983, Barre Sinoussi trong nhóm nghiên cứu của Montagnier (Viện Pasteur - Paris) đã phát hiện được virus có liên quan đến bệnh hạch nên đặt tên là LAV (Lymphadenopathy Associated Virus) Năm 1984, Gallo đã phân lập được 1 virus có ái tính với Lympho T của người nên đặt tên là HTLV typ III (Human T- Lymphotrophic Virus typ III) Cùng năm đó, Levy đã phân lập được 1 virus có liên quan đến hội chứng suy giảm miễn dịch và đặt tên là ARV (AIDS Related Virus) Đến hội nghị định danh quốc tế năm 1986, cả 3 được thống nhất gọi là virus gây bệnh suy giảm miễn dịch trên người, viết tắt là HIV-1 [53,35]

Năm 1985, Barin và cộng sự phân lập được HIV thứ 2 ở Tây Phi,đặt tên là HIV-2 HIV-2 có những đặc tính rất giống với virus gây suy giảm miễn dịch ở khỉ viết tắt là SIV cũng ở Tây Phi Trên cơ sở nghiên cứu dịch tễ học, HIV-2 có thể đã

có ở Tây Phi từ năm 1966 Như vậy, có thể giả định HIV đã xuất hiện từ những năm

60 của thế kỉ này hoặc trước đó vài chục năm, nhưng đến thập kỉ 80 mới bùng phát thành đại dịch AIDS/SIDA Để ghi nhận công lao là những người đầu tiên phát hiện

ra virus HIV, Luc Montagnier và Francoise Barré – Sinoussi đã được trao giải thưởng Nobel Y học năm 2008 [4,35]

1.3.3 Tình hình nhiễm HIV/AIDS trên thế giới và ở Việt Nam

1.3.3.1 Tình hình nhiễm HIV/AIDS trên thế giới

Theo UNAIDS, ước tính đến hết năm 2009 trên thế giới có khoảng 33,3 triệu người đang sống chung với HIV, 1,8 triệu người đã tử vong do các bệnh liên quan đến AIDS Đây vẫn là con số đáng báo động với tình hình phòng chống HIV/AIDS trên toàn thế giới [36]

Trong năm 2009 trên thế giới có khoảng 2,6 triệu người nhiễm mới, so với 3,1 triệu người nhiễm mới năm 1999 và 3,2 triệu người năm 1997 thì đã giảm đáng

kể nhưng số lượng người nhiễm vẫn ở mức cao Với 1,8 triệu người nhiễm mới trên

tổng số 2,6 triệu người nhiễm mới thì Châu Phi, nhất là vùng sa mạc Sahara vẫn là trung tâm của đại dịch AIDS [36]

Các khu vực khác trên thế giới như Tây, Trung, Đông âu, Trung á và Bắc mỹ

có tỉ lệ nhiễm mới là tương đối ổn định trong vòng 5 năm trở lại đây Tuy nhiên các bằng chứng gần đây lại cho thấy sự lây nhiễm HIV gia tăng trở lại ở những người nam có quan hệ tình dục đồng ở các nước phát triển Ở Đông Âu và Trung Á tỉ lệ lây nhiễm cao xảy ra chủ yếu ở nhóm đối tượng tiêm trích ma túy và bạn tình của

họ (hình 1.10) [36]

Hình 1.10: Bản đồ tình hình dịch HIV/AIDS trên thế giới năm 2009[39]

Ở Châu Á có khoảng 4,9 triệu người đang sống chung với HIV, có 360 nghìn trường hợp nhiễm mới trong năm 2009 Tình hình dịch bệnh ở đây tập trung chủ yếu nhóm đối tượng nghiện hút, mại dâm, khách mua dâm và những người nam có quan hệ tình dục đồng giới, đặc biệt là ở các nước đang phát phát triển như là Ấn

độ Có đến 90% người nhiễm HIV ở Ấn Độ tin rằng họ bị nhiễm HIV do quan hệ tình dục không an toàn, nhưng sự sử dụng chung bơm kim tiêm nhiễm bệnh là phương thức lây truyền chính ở các bang Đông Bắc Ấn Độ [36]

1.3.3.2 Tình hình HIV/AIDS ở Việt Nam

Tại Việt Nam, trường hợp nhiễm HIV đầu tiên được phát hiện vào 12/1990, 12/1992 có thêm 11 trường hợp bị nhiễm HIV và đến tháng 06/1999, toàn quốc đã

có 13.623 trường hợp nhiễm HIV, 2.532 bệnh nhân AIDS và 1.320 người đã tử vong vì AIDS Theo Bộ Y tế, tính đến 30/11/2010 số trường hợp nhiễm HIV hiện còn sống là 181.355 trường hợp, số bệnh nhân AIDS hiện còn sống là 42.729 và 48.641 trường hợp tử vong do AIDS [12]

Cùng với sự đô thị hóa, phát triển kinh tế xã hội đang diễn ra một cách mạnh

mẽ, sự di dân tự nhiên tập trung vào các thành phố lớn đã gia tăng đột biến dân số ở các khu vực này, làm cho diễn biến tình hình lây nhiễm HIV/AIDS ở đây càng trở lên phức tạp và khó kiểm soát Số lượng người ở nhiễm HIV/AIDS được báo cáo tính đến hết ngày 31/3/2010, vẫn tập trung chủ yếu ở các thành phố lớn mà điển hình là thành phố Hồ Chí Minh với 42.454 trường hợp nhiễm HIV hiện còn sống, tiếp theo là Hà Nội với 16.830 trường hợp nhiễm HIV hiện còn sống, Hải Phòng với 6.577 trường hợp nhiễm HIV hiện còn sống, Thái Nguyên với 5.635 trường hợp nhiễm HIV hiện còn sống, Sơn La với 5.206 trường hợp nhiễm HIV hiện còn sống [9,12]

Dịch bệnh được phát hiện đầu tiên ở thành phố HCM, nhưng đã lây lan và có mặt ở hầu khắp các tỉnh thành trên cả nước Cho đến hết 11/2010, đã có trên 74%

số xã, phường và 97,8% số quận/huyện trong toàn quốc đã có báo cáo về người nhiễm HIV/AIDS Thành phố Hồ Chí Minh vẫn là địa phương có số người nhiễm HIV/AIDS được báo cáo cao nhất, chiếm khoảng 23% số người nhiễm HIV/AIDS được báo cáo của cả nước [10]

Phương thức lây truyền HIV ở nước ta chủ yếu là qua đường tình dục và tiêm chích ma tuý Phân tích hình thái nguy cơ lây nhiễm cho thấy, trong số những người mới được phát hiện nhiễm HIV trong 9 tháng đầu năm 2010 có 49% bị nhiễm qua đường máu, 38% qua đường tình dục, 3% qua đường mẹ - con và 10% không rõ đường lây Điều này nhấn mạnh nguy cơ tăng tỷ lệ nhiễm HIV ở đối tượng nghiện chích ma tuý cũng như nguy cơ lan truyền từ người tiêm chích ma tuý sang các

nhóm khác trong cộng đồng Bên cạnh đó, hình thức lây nhiễm HIV qua đường tình dục cũng đang có dấu hiệu gia tăng Trong 5 năm trở lại đây, tỷ lệ nhiễm HIV báo cáo do lây nhiễm qua quan hệ tình dục không an toàn theo từng năm tăng dần từ 12% năm 2004 lên 29% năm 2009 và tính đến cuối tháng 9/2010 tỷ lệ này là 38% Tình hình lây nhiễm HIV ngày càng trở nên phức tạp bởi sự lây lan giữa hai nhóm đối tượng có nguy cơ cao này [9,10]

1.3.4 Dịch tễ học

1.3.4.1 Các phương thức lây truyền của HIV

Người nhiễm là nguồn truyền nhiễm duy nhất cho cộng đồng, không có ổ chứa nhiễm trùng tự nhiên ở động vật HIV có thể phân lập từ máu, tinh dịch, dịch tiết âm đạo, nước mắt, sữa mẹ và các dịch khác của cơ thể, tuy nhiên chỉ có máu, tinh dịch và dịch tiết âm đạo đóng vai trò chính trong lây truyền HIV [3]

Có 3 phương thức lây truyền đã được xác định [3]:

 Lây truyền qua đường tình dục

 Lây truyền theo đường máu

 Lây truyền từ mẹ sang con

Sau khi HIV xâm nhập vào trong tế bào chủ, huyết thanh người có những diễn biến thay đổi và được chia làm 3 giai đoạn [5]:

 Giai đoạn nhiễm trùng khởi phát (Primary infection):

Sau nhiễm HIV 1-2 tuần, chưa tìm thấy kháng nguyên (KN) và kháng thể (KT) kháng HIV trong huyết thanh nhưng từ tuần thứ 3 đến tuần thứ 6 sau nhiễm HIV, thường thấy KN p24 xuất hiện và sự hình thành KT kháng HIV type IgM (IgM-anti-HIV) Sau đó KN p24 giảm dần đồng thời với sự xuất hiện KT kháng p24

và KT kháng HIV type IgA Kháng thể IgM và IgA xuất hiện sớm nhưng không qua được nhau thai nên không truyền sang cho thai nhi

 Thời kỳ nhiễm trùng tiềm tàng (Latent infection):

Ở giai đoạn này, KT kháng p24 mất dần đồng thời với sự giảm dần của nồng

độ IgM anti-HIV để thay thế bằng sự hình thành IgG anti-HIV Thời kỳ này có thể kéo dài từ 3 tháng đến 10 năm thậm chí có thể kéo dài lâu hơn nữa tuỳ thuộc vào khả năng đáp ứng miễn dịch của cơ thể IgG anti-HIV xuất hiện muộn sau khi nhiễm HIV 6-8 tuần nhưng lại tồn tại lâu dài, ổn định trong suốt quá trình nhiễm HIV nên đã được sử dụng để xét nghiệm sàng lọc IgG anti-HIV trong máu người

mẹ nhiễm HIV có thể qua nhau thai để sang thai nhi và nó có thể tồn tại trong máu con tới 15-18 tháng vì vậy nên xét nghiệm tìm IgG anti-HIV ở trẻ trước 18 tháng tuổi luôn dương tính

 Giai đoạn nhiễm trùng cấp: (Acute infection):

Giai đoạn này có sự xuất hiện của hội chứng AIDS Thời kỳ đầu có biểu hiện suy giảm miễn dịch do sự giảm sút tế bào TCD4 cũng như sự rối loạn miễn dịch của

tế bào lympho B và đại thực bào nên lâm sàng có hạch sưng ở nhiều nơi kéo dài 2-4 tháng nhưng điều trị viêm không tác dụng Sau đó, hệ miễn dịch suy giảm trầm trọng, hội chứng AIDS xuất hiện toàn diện Trong huyết thanh bệnh nhân thấy sự xuất hiện trở lại của KN p24 và có thể thấy sự xuất hiện của KN gp41, KT kháng

gp41, KT kháng gp120 (hình 1.11)

Hình 1.11: Sự biến động của các thông số sinh học trên bệnh nhân nhiễm

HIV[5]

1.4 Tình hình nghiên cứu HIV ở việt nam

Trong những năm gần đây thì HIV đã thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học trong và ngoài nước Các nghiên cứu này không những có ý nghĩa về mặt khoa học mà còn có nghĩa về mặt thực tiễn rất cao

Trong nghiên cứu “Sơ lược tình hình nhiễm HIV-1 và các đột biến kháng thuốc trong điều trị ban đầu ở Hải Phòng, Việt Nam” của nhóm tác giả Nhật Bản và Việt Nam, được công bố 2/2009 trên tạp chí AIDS RESEARCH AND HUMAN RETROVIRUSES, đã nghiên cứu về các đột biến liên quan đến tính kháng thuốc và

sự lưu hành các phân type HIV-1 ở Hải Phòng Trong công trình này, các tác giả đã khảo sát 1355 mẫu huyết thanh người nhiễm HIV, trong đó 760 mẫu từ những người nghiện ma túy, 91 mẫu từ gái mại dâm, 94 mẫu từ các thủy thủ, 200 mẫu từ các phụ nữ có thai, 210 mẫu từ người cho máu Phân tích cây phân loại di truyền cho thấy phân type HIV-1 phổ biến nhất là CRF01_AE chiếm tới 98,3%, 1,4 % thuộc phân type B và 0,3% là chủng tái tổ hợp giữa B và C cũng được phát hiện [45]

Một nghiên cứu trước đó của nhóm tác giả ở Viện Vệ Sinh Dịch Tễ TW về

“HIV-1 phân type CRF 01_AE trong những người tiêm trích ma túy ở Hà Nội, Việt Nam”, đã cho thấy đặc điểm lưu hành của các phân type HIV ở đối tượng tiêm trích

ma túy ở Hà Nội Kết quả phân tích 17 mẫu bệnh phẩm được lấy từ 12 vùng thuộc

Hà Nội thì đa số thuộc phân type CRF 01_AE và chỉ có một mẫu duy nhất là thuộc CRF 01/C tái tổ hợp [48]

Theo nghiên cứu của nhóm tác giả ở thành phố Hồ Chí Minh được công bố vào năm 2003, xác định 200 mẫu bệnh phẩm được thu thập ngẫu nhiên ở một số tỉnh ở miền Nam và tại thành phố Hồ Chí Minh thì có đến 198 mẫu bệnh phẩm thuộc phân type CRF 01_AE (99%) và chỉ có 2 mẫu bệnh phẩm thuộc phân type B (2%) [47]

Ngoài các công trình nghiên cứu về HIV đã được công bố còn có rất nhiều công trình khác thuộc các đề tài, dự án cấp nhà nước do các nhóm nghiên cứu ở các Viện nghiên cứu và các trường Đại học đã và đang tiến hành

1.5 Các kỹ thuật phát hiện HIV trong cơ thể

Phát hiện HIV là một việc rất quan trọng trong chẩn đoán, điều tra dịch tễ học, theo dõi diễn biến của bệnh và giúp cho điều trị hiệu quả [3,]

1.5.1 Phát hiện trực tiếp sự có mặt của HIV

Các phương pháp phát hiện trực tiếp sự có mặt của HIV có thể là phát hiện bản thân virus ở dạng hoàn chỉnh, RNA/cDNA virus hoặc phát hiện những KN đặc trưng của virus [5, 8]

* Phân lập virus hoàn chỉnh

Bệnh phẩm có thể là máu, dịch não tuỷ, dịch sinh dục, sữa mẹ, mảnh cắt tổ chức nhưng phổ biến nhất là sử dụng bạch cầu đơn nhân trong máu ngoại vi

Sau khi phân lập, bạch cầu đơn nhân của người bệnh được nuôi cấy trong môi trường nhân tạo có thêm những bạch cầu của người lành (có CD4) để virus thâm nhiễm, nhân lên đạt đủ mật độ để phát hiện ra bằng các kỹ thuật riêng như tìm

KN hay protein đặc trưng của virus Đây là một kỹ thuật có giá trị, được cho là chuẩn vàng, nhưng cho kết quả chậm sau khoảng 15 ngày nuôi cấy, đòi hỏi trang thiết bị hiện đại và tốn kém nên chỉ sử dụng trong nghiên cứu, xác định chủng virus được phân lập, đánh giá tính kháng thuốc, chẩn đoán HIV ở trẻ sơ sinh và ở những bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng bất thường Độ nhạy của xét nghiệm chẩn đoán HIV ở trẻ sơ sinh khi mới sinh khoảng 43% và khi trẻ trên 3 tháng có thể đạt 90-95% [4]

* Phát hiện virus bằng kính hiển vi điện tử kết hợp với phương pháp miễn dịch [7]

Kỹ thuật:

 Bệnh phẩm cần phát hiện virus (KN) được ủ với KT đặc hiệu kháng HIV (IgG anti-HIV) Sau đó, ủ tiếp với KT đơn dòng của chuột chống IgG người có gắn vàng Au (ký hiệu là α-IgG-Au)

Kết quả: Nếu phản ứng dương tính, ta có phức hợp KN-IgG-α-IgG-Au và khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử sẽ nhìn rõ các hạt vàng và nơi HIV khư trú

1.5.2 Phát hiện kháng nguyên của HIV

KN HIV, đặc biệt KN lõi p24 có trong huyết thanh, huyết tương, dịch não tuỷ có thể được phát hiện bằng phương pháp ELISA tóm bắt kháng nguyên (Capture ELISA) hoặc bằng kỹ thuật RIA

Nguyên lý chung của các kỹ thuật này là dùng KT đa dòng (polyclonal antibody) kháng HIV cố định trong các giếng nhựa hoặc trên các viên bi polystyrene tiếp xúc với bệnh phẩm cần thử, sau đó, ủ tiếp phức hợp này với KT kháng HIV có gắn enzyme hoặc chất phóng xạ Enzyme sẽ làm biến đổi màu cơ chất Khi đo màu cơ chất hoặc đo hoạt tính phóng xạ có thể định tính và định lượng

KN

Về lý thuyết người ta có thể phát hiện tất cả các KN của virus nhưng trên thực tế, do tính đặc hiệu và ái lực của các KT chủ yếu hướng tới các protein chính trong lõi nucleocapsid như p24 Vì vậy, kỹ thuật này thường sử dụng để phát hiện

KN p24 Dấu hiệu mất KN p24 ở những người đã có phản ứng huyết thanh học HIV dương tính là dấu hiệu nói lên sự khởi đầu của AIDS lâm sàng [11]

Đây là xét nghiệm có độ đặc hiệu cao (98-99%) nhưng độ nhạy chỉ đạt 25% ở trẻ sơ sinh và 50% ở trẻ lớn hơn [16]

10-1.5.3 Các kỹ thuật sinh học phân tử trong xét nghiệm HIV

Các kỹ thuật sinh học phân tử ngày càng được áp dụng rộng rãi trong công tác xét nghiệm, theo dõi điều trị và nghiên cứu sinh học di truyền của virus và là công cụ hữu hiệu trong chẩn đoán sớm nhiễm HIV, theo dõi tiến triển bệnh, chỉ định và theo dõi hiệu quả điều trị thuốc, nghiên cứu tính kháng thuốc

+ Các kỹ thuật định tính

- Kỹ thuật PCR

PCR thường ít được sử dụng hơn so với chẩn đoán huyết thanh học và chỉ được sử dụng trong một số trường hợp nghi là mới nhiễm HIV còn đang trong giai

đoạn cửa sổ và chưa thể phát hiện được kháng thể bằng phương pháp huyết thanh học

+ Các kỹ thuật định lƣợng

Định lượng virus, RNA huyết tương hoặc DNA provirus thông số quan trọng

để theo dõi mức độ xâm nhập và nhân lên của HIV, chỉ định điều trị và theo dõi, đánh giá kết quả điều trị

- Kỹ thuật AMPLICOR

Kỹ thuật dùng để định lượng RNA HIV trong huyết tương Nhờ enzyme RT (Revese Transcriptase), sao chép ngược RNA thành cDNA Sản phẩm PCR sẽ được lai ghép với các mẫu dò đặc hiệu với DNA đích đã được cố định trên giá đỡ và được phát hiện với mẫu có gắn các tín hiệu cho phép đọc được bằng phương pháp

so màu

- Kỹ thuật Real Time PCR

Đây là phương pháp cho phép khuếch đại và xác định số lượng các chuỗi DNA được tạo ra trong từng chu kỳ nhiệt Sau mỗi chu kỳ nhiệt, số lượng các bản sao DNA được tổng hợp tăng lên sẽ cho các tín hiệu phát quang tăng tỷ lệ thuận Dựa vào một gam mẫu chuẩn có số lượng DNA đích xác định tiến hành đồng thời cùng mẫu thử để xây dựng một đường chuẩn dựa trên số liệu bản sao DNA đích và giá trị Ct của từng mẫu tương ứng (Ct là thời điểm ở chu kỳ n của PCR cho tín hiệu huỳnh quang tăng vọt so với tín hiệu nền) Nếu số lượng DNA bản đích càng lớn thì

Ct càng nhỏ Có nhiều phương pháp sử dụng phép phát quang để xác định số lượng bản sao DNA được nhân lên Thông thường người ta thường dùng: SYBR Green 1 hoặc mẫu dò đặc hiệu

1.5.4 Phát hiện gián tiếp sự có mặt của HIV

Các kỹ thuật phát hiện gián tiếp sự có mặt của HIV thông qua các thành phần đặc hiệu kháng lại các thành phần cấu trúc của virus [13]

+ Kỹ thuật ngƣng kết (agglutination)

Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý ngưng kết thụ động, những hạt như gelatin (SERODIA test), latex hoặc hồng cầu người làm giá đỡ cho các protein virus Khi

cho tiếp xúc với KT kháng HIV, các hạt này tạo thành một mạng lưới ngưng kết có thể nhận định bằng mắt thường

Đây là kỹ thuật đơn giản, nhanh, không đòi hỏi trang bị hiện đại và có thể dùng để tiến hành sàng lọc hàng loạt Tuy nhiên phương pháp này có độ đặc hiệu thấp so với các phương pháp chẩn đoán khác và có thể cho phản ứng dương tính giả

+ Kỹ thuật miễn dịch ELISA

ELISA là phương pháp cho phép phát hiện hầu hết các mẫu xét nghiệm có

KT kháng HIV Tuy nhiên, đây là phương pháp có độ nhạy cao, do đó có thể cho những kết quả dương tính giả Để hạn chế nguy cơ này, cần phải có phương pháp kết hợp để khẳng định chẩn đoán của ELISA Western blot là phương pháp hỗ trợ phổ biến nhất để khẳng định kết quả dương tính của ELISA, IFA cũng được dùng như một phương pháp thay thế/bổ sung cho WB

ELISA được ứng dụng để phát hiện các KT IgG anti-HIV, IgA anti-HIV hoặc IgM anti-HIV bằng 3 kỹ thuật sau:

- Kỹ thuật ELISA gián tiếp

KT kháng HIV trong máu bệnh nhân kết hợp đặc hiệu với KN HIV đã được

cố định sẵn trên giá đỡ (ở các giếng phản ứng trên hạt nhựa) Phức hợp KN-KT được nhận biết bởi một cộng hợp là KT kháng Ig người có gắn enzyme và sẽ cho phản ứng hiện màu với một cơ chất thích hợp Giá trị mật độ quang của phản ứng màu tỷ lệ thuận với lượng KT kháng HIV hiện diện trong mẫu thử

Đây là xét nghiệm có độ nhạy cao nhưng độ đặc hiệu không cao do thường

bị dương tính giả

- Kỹ thuật ELISA Sandwich

KT kháng HIV được cố định trong giếng để tóm bắt các KN virus trong mẫu thử và được phát hiện bởi kháng thể 2 gắn enzyme Giá trị mật độ quang của phản ứng màu tỉ lệ thuận với lượng KN hiện diện trong mẫu thử ELISA sandwich thường được sử dụng để phát hiện KN P24 của HIV trong chẩn đoán sớm HIV

+ Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang (IFA)

Nguyên lý của IFA cũng tương tự ELISA nhưng chất gắn đánh dấu là chất

màu huỳnh quang và kết quả được đọc dưới kính hiển vi huỳnh quang Phản ứng dương tính được thể hiện bằng những tế bào bị nhiễm HIV phát quang ở ngoại vi

+ Kỹ thuật Western Blot (WB)

Nguyên tắc: là một kỹ thuật theo nguyên lý ELISA gián tiếp thực hiện trên băng giấy, cho phép xác định KT kháng các thành phần khác nhau của protein virus

Có WB riêng cho HIV-1 và HIV-2

HIV được ly giải và điện di trên gel polyacrilamide để phân tách các thành phần KN virus theo trọng lượng phân tử, sau đó được chuyển lên màng nitrocellulose hoặc PVDF (Polyvinylidene Difluoride) và được cắt thành từng dải băng để sử dụng Mỗi dải băng dùng cho một mẫu thử nghiệm Ủ huyết thanh của mẫu thử với băng giấy Nếu trong mẫu thử có KT kháng HIV thì chúng sẽ gắn đặc hiệu lên các protein là KN tương ứng và được phát hiện bằng cộng hợp là KT kháng

Ig người đã được đánh dấu bằng enzyme cho màu phản ứng với cơ chất Vị trí các băng màu tương ứng với thành phần protein virus gắn với KN đặc hiệu

Giá trị: Xét nghiệm khẳng định WB có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, được thực hiện trong trường hợp các kết quả xét nghiệm phát hiện sàng lọc không phù hợp và khó biện luận

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU

2.1.1 Đối tượng

DNA tách chiết từ mẫu máu của bệnh nhân nhiễm HIV đã được xác định thuộc phân type CRF01_AE được tách từ mẫu máu nhiễm HIV lấy từ các bệnh viện thuộc 13 tỉnh và thành phố trên cả nước

2.1.2 Hoá chất và Sinh phẩm

Thang DNA chuẩn, thang protein chuẩn, các enzyme giới hạn (New England

Biolabs, Mỹ); enzyme Taq DNA polymerase, T4 DNA ligase (Invitrogen, Mỹ)

Ethidium bromide, IPTG, X-gal, H2O2, màng polyvinylidene difluoride (PVDF), BSA, 4-chloro-1-naphtol; Tris-HCl, glycine, chloroform, iso-amylalcohol, TEMED, ethanol, methanol, Acrylamide, bis-Acrylamide, cao nấm men, tryptone, agarbacter, agarose và một số hoá chất khác dùng trong sinh học phân tử của các hãng có uy tín BioLab, BioRad, Merk, Fermentas

Kit tách dòng TA cloning (Invitrogen), kit làm phản ứng xác định trình tự BigDyeđ Terminator v3.1, Kit tinh sạch plasmid - S.N.A.P.TM (Invitrogen), Kit tinh sạch protein - Nikel chelating Resin (Invitrogen)

Vector biểu hiện pET32a(+) của Novagen, chủng vi khuẩn E coli DH5α dùng để tách dòng gen , chủng vi khuẩn E coli BL21 Star™ (DE3) dung để biểu

hiện protein tái tổ hợp

2.1.3 Trang thiết bị và máy móc

- Máy xác định trình tự DNA tự động – ABI prism 3100 Sequencer (Applied Biosystem, Mỹ)

- Máy đo quang phổ (Shimadzu, Nhật Bản)

- Máy ly tâm lạnh (Microcentrifuge – Sorvall, Mỹ)

- Máy PCR (PCR system 9700, Applied Biosystems, Mỹ)