TRNG DI HC m TP HCM CNG HOA XA HI

Số điện thoại : 0909192195 Tên chuyên đề: Đánh giá khả năng đối kháng Vibrio parahaemolyticus của một số chủng Bacillus và sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến sinh khối của chủng có hoạt t

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Độc lập – Tự do – Hạnh Phúc

PHIẾU ĐĂNG KÝ TÊN CHUYÊN ĐỀ

THỰC TẬP TỐT NGHIỆP

Họ và tên SV : LÊ ANH TUẤN Mã số SV : 1053010888

Email : leanhtuan130692@gmail.com Điện thoại : 01656635759

Họ & tên GVHD : Nguyễn Văn Minh Học hàm – Học vị : Thạc sỹ

Đơn vị công tác: Khoa Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Mở Tp HCM

Địa chỉ liên lạc :Khoa Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Mở Tp HCM

Số điện thoại : 0909192195

Tên chuyên đề: Đánh giá khả năng đối kháng Vibrio parahaemolyticus của một số chủng Bacillus và sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến sinh khối của chủng có hoạt tính mạnh

Giảng viên hướng dẫn Sinh viên

(ký và ghi rõ họ tên) (ký và ghi rõ họ tên)

Ý kiến tổ chuyên ngành :

1 Tên chuyên đề:

2 Đề cương nghiên cứu:

3 Thời gian tiến hành:

4 Kết luận: Đạt Không đạt Xem xét lại

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

ĐỀ CƯƠNG CHUYÊN ĐỀ THỰC TẬP TỐT NGHIỆP

Tên chuyên đề: Đánh giá khả năng đối kháng Vibrio parahaemolyticus của một số chủng Bacillus và sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến sinh khối của chủng có hoạt tính mạnh

Chuyên ngành : Vi Sinh – Sinh Học Phân Tử

Họ và tên sinh viên : LÊ ANH TUẤN

MSSV : 1053010888

Giảng viên hướng dẫn : Nguyễn Văn Minh

Học hàm - học vị : Thạc sĩ

Đơn vị công tác : Khoa Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Mở Tp HCM

Thời gian thực hiện : từ 29/10/2013 – 23/2/2014

Địa điểm thực hiện : Phòng thí nghiệm Công Nghệ Vi Sinh, Trường Đại học Mở Tp HCM

1 Đặt vấn đề :

Nước ta là một nước rất có lợi thế để phát triển ngành nuôi trồng thủy sản Theo Tổng Cục Thủy Sản Việt Nam: ước tính giá trị nuôi trồng thủy sản 6 tháng đầu năm 2013 đạt 45.185

tỷ đồng (trong tổng số 83.318 tỷ đồng giá trị sản xuất thủy sản) Sản lượng ước đạt 1.405 nghìn tấn (tăng 2,6% so với cùng kỳ năm 2012) Do phải đối mặt với nhiều khó khăn khách quan và chủ quan nên kết quả sản lượng nuôi trồng chỉ đạt 40,5% kế hoạch năm; Trong đó, sản lượng tôm sú đạt 80 nghìn tấn (bằng 25,8% kế hoạch năm, giảm 27,1% so với cùng kỳ năm trước), tôm thẻ chân trắng đạt 20 nghìn tấn (bằng 9,5% kế hoạch năm, tăng 33,3% so với cùng kỳ năm trước) và cá tra đạt 461 nghìn tấn (bằng 35,8% kế hoạch năm, giảm 16,9% so với cùng kỳ năm trước)

Tuy nhiên, hiện nay tình trạng dịch bệnh ở tôm đang hoành hành trên nhiều vùng nuôi tôm ở nước ta đặc biệt là hội chứng tôm chết sớm Early Mortality Syndrome (EMS) hay còn gọi là hội chứng hoại tử gan tụy Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome (AHPNS) [3], [6]

Ở Việt Nam, căn bệnh này đã xuất hiện từ năm 2010, nhưng sự tàn phá rộng rãi nhất do EMS chỉ được báo cáo kể từ tháng 3 năm 2011 ở đồng bằng sông Cửu Long (Việt Nam) Nó ảnh hưởng chính đến khu vực sản xuất tôm: Tiền Giang, Bến Tre, Kiên Giang, Sóc Trăng, Bạc Liêu và Cà Mau với tổng diện tích ao tôm khoảng 98.000 ha Trong tháng 6 năm 2011, thiệt hại chưa từng thấy ở tôm sú đã được báo cáo trong 11.000 ha nuôi tôm ở Bạc Liêu, 6.200 ha tại Trà Vinh (tổng cộng 330 triệu con tôm đã chết gây thiệt hại trên 12 tỷ đồng), và 20.000 ha tại Sóc Trăng (gây ra thiệt hại 1,5 nghìn tỷ) [13]

Trong năm 2010, hội chứng tử vong sớm (EMS), một căn bệnh mới ở tôm, xuất hiện trên các trang trại nuôi tôm ở miền nam Trung Quốc và trên đảo Hải Nam của Trung Quốc AHPNS

đã được xác nhận tại Việt Nam và Malaysia năm 2011 [11], [12] Bệnh EMS đến Thái Lan trong năm 2012 [5], [6] Bệnh xuất hiện trong vòng 20-30 ngày sau khi thả giống, tôm sú và tôm thẻ chân trắng Tôm bị bệnh trở nên lờ đờ, ngừng ăn, dạ dày và ruột trống rỗng, vỏ mỏng, màu sắc nhợt nhạt, tăng trưởng chậm, gan tụy xanh xao, nhủng và teo và tỉ lệ chết lên tới 100% làm cho các ao nuôi tôm bị ảnh hưởng nghiêm trọng [12]

Vào đầu năm 2013, Phòng thí nghiệm bệnh học trên nuôi trồng thủy sản Đại học Arizona

đã có thể cô lập tác nhân gây bệnh EMS/AHPNS trong môi trường nhân tạo Thử nghiệm lấy từ

các mẫu thực địa cho thấy nguyên nhân gây bệnh là do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus [7]

Hội chứng tử vong sớm (EMS), hay được gọi là hội chứng hoại tử gan tụy (AHPNS), được công bố bởi các nhà khoa học, là nguyên nhân gây tử vong cao ở các trang trại tôm Việt Nam

EMS/AHPNS được gây ra bởi một loại vi khuẩn (Vibrio parahaemolyticus) bị nhiễm phage

(một thể thực khuẩn) làm cho độc tố của vi khuẩn tăng lên Chúng xâm chiếm đường tiêu hóa của tôm và sinh ra độc tố gây phá hủy mô và rối loạn chức năng của gan tụy, cơ quan tiêu hóa của tôm (theo FAO) [3], [5], [7], [11], [13]

Vấn đề đặt ra là nếu kiểm soát được Vibrio parahaemolyticus thì phage sẽ không có vật chủ để tồn tại cũng như không có Vibrio parahaemolyticus gây độc trên tôm Thêm vào đó, hiện

nay kháng sinh đã bị hạn chế sử dụng trong nuôi trồng thủy sản Việc điều trị bằng kháng sinh

và hóa chất, đặc biệt khi dùng quá nhiều hóa chất sẽ tiêu diệt phần lớn các vi khuẩn có lợi trong nước ao tôm, chứ không chỉ các vi khuẩn gây bệnh Bên cạnh đó, dư lượng kháng sinh và hóa

trên, chế phẩm sinh học giúp cho các sản phẩm từ thủy sản an toàn và không gây ảnh hưởng đến sức khỏe của con người [10], [16]

Trong nuôi trồng thủy sản và đặc biệt là tôm, vi khuẩn thường được ứng dụng làm chế

phẩm sinh học phần lớn thuộc chi Bacillus Trong thủy sản, Bacillus spp có khả năng tạo ra

được các enzyme ngoại bào hỗ trợ tiêu hóa, sinh kháng sinh hay những chất ức chế có những đặc tính đối kháng với các chủng vi sinh vật gây bệnh mà được ghi nhận nhiều nhất là khả năng

đối kháng với Vibrio spp [2], [15]

Nhóm nghiên cứu đã có những thành công in vitro về khả năng kiểm soát Vibrio spp của

vi khuẩn Bacillus Các kết quả này đã được công bố trên tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông

thôn và tạp chí Khoa học trường Đại học Mở TP.Hồ Chí Minh

Xuất phát từ tình hình trên chúng tôi xin tiến hành thực hiện đề tài “Đánh giá khả năng đối kháng Vibrio parahaemolyticus của một số chủng Bacillus và sàng lọc các yếu tố ảnh

hưởng đến sinh khối của chủng có hoạt tính mạnh”

2 Mục tiêu :

- Sàng lọc khả năng đối kháng của một số chủng Bacillus spp với Vibrio

parahaemolyticus

- Sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến sinh khối của chủng Bacillus có hoạt tính mạnh

3 Nội dung và kế hoạch thực hiện đề tài :

– 5/11/2013)

 Hiểu được cách thực hiện, phương pháp sàng lọc tính đối kháng và các yếu tố ảnh hưởng

đến sinh khối Bacillus

13/11/2013)

 Tổng hợp tất cả tài liệu

 Hoạt hóa chủng giống

Bacillus

1 tuần (14/11/2013 – 21/11/2013)

 Tăng sinh chủng giống để chuẩn bị thí nghiệm

 Thử tính đối kháng của các

chủng Bacillus với Vibrio

parahaemolyticus

2 tuần (22/11/2013 – 6/12/2013)

 Sàng lọc được chủng

có tính đối kháng mạnh nhất

 Xây dựng đường cong tăng

trưởng của chủng Bacillus vừa

sàng lọc được

2 tuần (7/12/2013 – 21/12/2013)

 Xác định đường cong tăng trưởng của chủng

Bacillus

 Xác định các yếu tố ảnh hưởng

đến sinh khối của Bacillus

4 tuần (21/12/2013 – 18/1/2013)

 Xác định các yếu tố môi trường cần thiết

17/1/2013)

 Bài báo cáo

4 Phương pháp nghiên cứu chính:

 Hoạt hoá giống: bằng cách cấy sinh khối Bacillus spp từ ống thạch nghiêng vào ống

nghiệm chứa 5 ml môi trường NB Ủ 37oC/ 18 giờ, tốc độ lắc 250 vòng/phút [15]

 Phương pháp đục lỗ thạch:

Các chủng Vibrio spp sau khi được phân lập được đưa vào môi trường nuôi cấy tăng sinh

(canh NB, 37oC ) Sau khi thêm 25 l môi trường nuôi cấy Vibrio spp được điều chỉnh tới mật

độ tế bào 106 CFU/ml, vào bình chứa 25ml dung dịch NA có bổ sung 1,5% NaCl ở 45oC, và đổ vào đĩa petri (đường kính 9cm) Dùng dụng cụ đục lỗ thạch tạo các giếng (đường kính 8mm),

trong 0,85 % NaCl) vào giếng và ủ ở 37oC trong 24 giờ Đo đường kính vòng ức chế vi khuẩn [15]

 Thử đối kháng bằng phương pháp vạch vuông góc:

Chủng vi khuẩn thử nghiệm được tăng sinh trên môi trường NB, vi khuẩn gây bệnh được tăng sinh trên môi trường pepton kiềm ở 30oC/ 24 giờ Vi khuẩn gây bệnh được cấy thẳng vạch thứ nhất trên môi trường NA bổ sung 1,5% NaCl Sau đó lấy vi khuẩn thử nghiệm vạch thẳng vuông góc với vạch thứ nhất, ủ ở 30oC Thử nghiệm được tiến hành 3 lần, quan sát sau 24 giờ,

48 giờ, 72 giờ [14]

 Xây dựng đường cong tăng trưởng bằng phương pháp đo mật độ quang ở bước sóng 600

nm Sau mỗi giờ nuôi cấy và liên tục trong 24 giờ [9]

 Xây dựng đường tương quan giữa OD600 và mật độ tế bào tương ứng

 Thực hiện pha loãng huyền phù tế bào chủng Bacillus sao cho thu được các huyền

phù có OD600 là 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0

 Định lượng tế bào ở các giá trị OD bằng phương pháp đếm khuẩn lạc:[4]

 Pha loãng huyền phù tế bào thành các nồng độ pha loãng 10-1, 10-2, 10 -3

, 10-4, …

 Hút 0,1 ml huyền phù ở mỗi nồng độ pha loãng cấy trang trên môi trường NA (24 – 48 giờ/37oC), mỗi nồng độ lặp lại 3 lần

có số khuẩn lạc mọc trong khoảng đếm thích hợp (25 – 250 khuẩn lạc/ đĩa), đếm số lượng tế bào trên cả 3 đĩa của cùng nồng độ pha loãng

Trong đó:

A: mật độ tế bào (CFU/ mL)

N: tổng số khuẩn lạc đếm được

ni: số đĩa được đếm ở nồng độ pha loãng i

V: số mL dịch mẫu cấy vào mỗi đĩa

fi: nồng độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn đếm

 Theo dõi khảo sát sự tăng trưởng của vi sinh vật tại các mốc thời gian bằng cách sử dụng đường tương quan giữa mật độ tế bào và OD600 để suy ra mật độ tế bào tại mỗi thời điểm khảo sát

 Xác định các yếu tố và mức ảnh hưởng đến sinh khối Bacillus bằng thí nghiệm thay đổi

từng yếu tố Các yếu tố được chọn là: glucose, peptone, (NH4)2SO4, K2HPO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O, MnCl2, CaCl2, FeSO4.7H2O, NaCl, pH, nhiệt độ [9], [15]

5 Tài liệu tham khảo (nếu có) :

 Tài liệu tiếng việt:

[1] Huỳnh Thị Thanh Hiền, Trịnh Thị Bích Huyền, Bùi Hồng Quân, (2010), Sử dụng ma trận PLACKETT-BURMAN và phương pháp đáp ứng bề mặt thiết kế cấu trúc có tâm nhằm tối ưu

hóa sinh tổng hợp Lipase từ Bacillus licheniformis GBDTY1, Tạp chí Công nghệ Sinh học

8(3A), pp 811-818

Yến, Nguyễn Văn Hòa, Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh, Khả năng ức chế Vibrio spp gây bệnh của một

số chủng Bacillus spp, phân lập từ trùn quế

[3] Dang Thi Hoang Oanh (email dthoanh@ctu.edu.vn , Department of Aquatic Pathology, College of Aquaculture and Fisheries, Cantho University, Vietnam), Tran Viet Tien, Truong Quoc Phu and Nguyen Thanh Phuong, February 2013, Hepatopancreatic Necrosis Syndrome (AHPNS) on Farmed Shrimp in The Mekong Delta, Vietnam

[4] Trần Linh Thước, Đặng Thị Phương Thảo, Đỗ anh Tuấn, Cao Thị Ngọc Phượng, Võ

Cẩm Quy, (2011), Thực tập vi sinh vật, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hồ Chí Minh

 Tài liệu tiếng anh:

[5] Eduardo M L and Mohan C.V (2012), Early Mortality Syndrome (EMS)/Acute

Hepatopancreatic Necrosis Syndrome (AHPNS): An emerging threat in the Asian shrimp

industry, fish health section asian fisherier society, pp 1-7

[6] Flegel, T.W (2012), Historic emergence, impact and current status of shrimp pathogens in Asia Journal of Invertebrate Pathology 110, pp 166-173

[7] Redman R.M., Pantoja C.R.,Noble B.L and Loc Tran (January/February 2012),

(Department of Veterinary Science and Microbiology, University of Arizona) Volume 15, Issue

[8] Rengpipat S ,Phianphak W ,Piyatiratitivorakul S ,Menasveta P.(1998) Effects of a

probiotic bacterium on black tiger shrimp Penaeus monodon survival and growth,

Aquaculture167, pp 301–313

[9] J Leonel Ochoa-Solano, Jorge Olmos-Soto*, (2005), The functional property of Bacillus for shrimp feeds,Molecular Microbiology Laboratory, Department of Marine Biotechnology,

Centro de Investigacio´n Cientı´fica y de Educacio´n Superior de Ensenada (CICESE),

Ensenada, Baja California, Me´xico

[10] Laurent Verschuere , Geert Rombaut , Patrick Sorgeloos , và Willy Verstraete , (2000),

Probiotic Bacteria as Biological Control Agents in Aquaculture, Microbiol Mol Biol Rev, 64(4),

pp 655–671

[11] Lightner D.V., Redman R.M., Pantoja C.R., Noble B.I., Tran L (2012), Early mortality syndrome affects shrimp in Asia, Global Aquaculture Advocate, pp 40

[12] Loc T., Linda N., Rita M R., Leone L M., Carlos R P., Kevin F., Lightner D.V.* (2013), Determination of the infectious nature of the agent of acute hepatopancreatic necrosis syndrome affecting penaeid shrimp, Diseases Of Aquatic Organisms, 105, pp 45–55

[13] Mooney, A (2012), An emerging shrimp disease in Vietnam, microsporidiosis or liver disease? Available at:

http://aquatichealth.net/issue/38607

[14] Purivirojkul W., and Areechon N (2007) Application of Bacillus spp isolated from the intestine of blacktiger shrimp (Penaeus monodon Fabricius) from natural habitat for control pathogenic bacteria in aquaculture, Kasetsart J (Nat Sci.) 41, pp 125-132.

Antimicrobial Activity of Bacillus spp Against Pathogenic Vibrio spp in Black Tiger Shrimp (Penaeus monodon), Kasetsart J (Nat Sci.) 40, pp 949 – 957

[16] Witte W ,Klare I ,Werner G (1999) Selective pressure by antibiotics as feed additives, Infection27 (Suppl 2), pp 35–38

 Nguồn internet:

[17] http://www.fao.org/news/story/en/item/175416/icode/

TP.HCM, ngày …… tháng …… năm ……

Xác nhận của GVHD Chữ ký sinh viên

(Ký và ghi rõ họ tên)

- -