VÀ TẠO CÁU TRÚC KHÔNG GIAN CHO PROTEIN Ở CÁC BẢO QUAN
4.5. SỰ PHÂN GIẢI PROTEIN
Sự phân giải protein đóng vai trò quan trọng trong tế bào. Đấy là quá trình xảy ra thường xuyên và liên tục trong tế bào. Chúng giúp cho việc loại bỏ các protein lạ, thúc đây quá trình lưu chuyển amino acid, điều hòa hoạt hóa protein bằng cách hạn chế số lượng protein không cần thiết trong khoảng thời gian dài.
4.5.1. Vai trò của sự phân giải protein trong tế bào
Vai trò của sự phân giải protein trong tế bào có thể khái quát thành mấy điểm sau đây:
(1) Sự phân giải này được coi như là quá trình gìn giữ bảo vệ tế bào khỏi bị nhiễm độc do các protein lạ sinh ra trong khi bị đột biến, bị lỗi do tạo cấu trúc không gian không đúng, do bệnh tật, các yếu tố cực đoan, do bị oxy hóa...
(2) Sự phân giải protein trong tế bào thúc đẩy việc bảo tồn các cấu trúc đúng của các phức protein và các cofactor của chúng ở tỉ lệ phù hợp nhất định. Ví dụ: các tiểu phần SSU của RUBISCO tổng hợp trên polyribosome lưới nội bào có hạt trong nguyên sinh chất thì bền, nhưng khi chuyên vào lục lạp và tham gia vào xúc tác phản ứng sẽ dễ bị phân hủy.
(3) Sự phân giải protein điều hòa một : số lớn các quá trình sinh học: sự
phân giải các chất hoạt hóa hoặc kìm hãm các phytohormon điều 167
chỉnh khá năng sinh trưởng và phát triển của các cơ quan cũng như thực vật nói chung. Ngoài ra, theo thời gian sống của mình, thường các protein hoặc enzyme ở trong trạng thái không hoạt hóa thì bền
vững, còn ở trạng thái hoạt hóa thì rất đễ bị phân giải (ví dụ như
phytochrome A).
(4) Sự phân giải protein cung cấp nguồn amino acid cho quá trình sinh tông hợp protein mới trong quá trình sinh trưởng và phát triển.
- Trong tế bào tồn tại các cách phân giải protein đặc thù cho các bào quan khác nhau. Trong quá trình này có nhiều enzyme tham gia:
protease, endopeptidase, exopeptidase, peptidase... Các bào quan khác nhau có các hệ enzyme đặc thù cho lục lạp, ty thể, nhân tế bào... phụ
thuộc vào nguồn gốc tiền hóa của từng bảo quan.
4.5.2. Đặc điểm của sự phân giải protein trong các bào quan
Không bào thường chiếm đến 90% thể tích của tế bào. Chúng chứa nhiều enzyme thủy phân. Chúng là nguồn cung cấp chính các amino acid cho tế bào. Trong trường hợp bị thiếu hụt dinh dưỡng, một phần protein của nguyên sinh chất được chuyển vào không bào để phân hủy thành _ amino acid cung cấp cho tế bào. Như vậy, không bào có chức năng như lysosome. Trong không bào dự trữ ở hạt chứa nhiều protein dự trữ và các
chất dự trữ khác. Chúng cung cấp nguồn dinh dưỡng, nguồn amino acid chính cho quá trình nảy mầm tạo nên cơ thể mới. Hệ protease này ở các loài thực vật khác nhau đều có nét đặc thù riêng (xem mục 2.2. Protease -
enzyme phân giải protein trong hạt).
Lục lạp chứa khoảng 50% protein của quá trình quang hợp. Một
trong sO protease dé cé dang gan giống với protease ClpAP cia E. coli.
Hé théng ClpAP protease 6 E. coli được cấu tạo từ 2 loại tiểu phan:
ClpP, 21 kDa là serine protease và ClpA, 81 kDa là ATPase. ClpA hoạt hóa ClpP và hoạt hóa cả protein cơ chất (protein không tạo được cấu trúc - cần phải phân hủy). Hệ thống này chỉ có hoạt tính khi hai vòng, mỗi vòng
gom 7 tiểu phần ClpP kết hợp với một vòng 7 tiểu phần ClpA tao thành phức hệ protein. Đây là phức hệ nhiều enzyme tham gia vào quá trình.
168
phân hủy protein trong lục lạp. Phức hệ này đặc biệt có ý nghĩa để loại bỏ các protein lạ hoặc bị biến tính khi lá bị già cỗi.
Lục lạp của thực vật chỉ có các protein đồng dạng với CIpAP. Ở Arabidopsis có 6 protein dạng ClpPl-6; 4 protein dang ClpR1-4 va 2 protein dang ClpS1-2. Phần lớn các protein này đều do các gen nhân tế bào mã hóa và được tổng hợp trong nguyên sinh chất và chuyên vào lục lạp. ClpR có hoạt tính protease yếu. Trong chất nền của lục lạp chúng tạo
thành các phức hệ protein ClpP/R/S voi khối lượng phân tử khoảng 325-
350 kDa, có hoạt tính protease. Nhóm protein này rất cần thiết cho quá trình sinh trưởng của cây: sự phát triển của lá non, quá trình quang hợp và phát triển của lục lạp.
Nguyên sinh chất thực vật có đến hơn 10000 loại protein khác
nhau tại cùng một thời điểm bất kỳ. Tế bào cần những cơ chế hoàn hảo để điều khiển và kiểm soát được hoạt động của từng protein ở mọi thời
điểm cần thiết. Nếu không có những cơ chế này, các enzyme có thể thủy phân bất kỳ protein nào đang cần thiết cho cơ thể. Quá trình thủy phân này cần có năng lượng ATP. Trong trình tự polypeptide ở đầu N đều có các dấu hiệu chỉ sự tồn tại của chúng. Nếu tổn tại trong thời gian ngắn,
polypeptide thường có gốc Pro, Glu, Ser va Thr, gọi là chuỗi các PEST (Pro-Glu-Ser-Thr). Đây là dấu hiệu báo protein cần bị thủy phân bằng
enzyme. Trong trường hợp đầu N có các amino acid như Met, Thr, Ser, Gly va Val, các protein đó thường bền vững. Nhưng nếu ở đầu N có các amino acid như Lys, Arg, His, Phe, Tyr, Trp, Ile, Leu, Asp, Glu, Gln va
Asn, những protein này thường nhanh chóng bị loại bỏ nhờ phức hệ ubiquitin - proteasome. Những protein trong nguyên sinh chất thường có đầu N với các 'amino acid bền vững. Thêm vào đó, chúng có thể được
acetyl hóa gốc amino của amino acid để được bền vững hơn. Những protein cần được vận chuyển vào các bào quan thường có cấu trúc đầu N với những chuỗi amino acid ít bền vững hơn. Chúng sẽ bị loại bỏ sau quá trình vận chuyển. Về nguyên tắc, tất cả các protein đều được bắt đầu bằng Met, nhưng amino acid nay có thể bị aminopeptidase loại bỏ để bộc
lộ amino acid khác ở đầu N. Ngoài ra, một số protein có thể bị cải biến
bằng cách gắn thêm gốc Arg qua phản ứng nh enzyme arginyl-tRNA- 169
protein transferase. Nhất là các protein có dau N 1a Glu va Asp. Ubiquitin khó nhận biết được các amino acid có hai gốc carboxyl để chuyển cho phức hệ proteasome. Nếu được gắn thêm Arg ở đầu N, protein trở thành dễ bị phân hủy. Còn nếu tận cùng đầu N là Gin và Asn, chúng sẽ được chuyên hóa thành Glu và Asp nhờ enzyme amidase, để tiếp sau đó gắn thêm Arg như quá trình đã mô tả trên đây. Trong trường hợp gặp các yếu tố cực đoan như nóng, lạnh, oxy hóa.... các protein bị biến tính, cấu trúc không gian của chúng bị thay đổi, các gốc ky nước lộ ra ngoài làm cho protein kém tan trong nước. Đây là dấu hiệu đầu tiên để protein bị thủy phân.
4.5.3. Hé ubiquitin — proteasome
Trong nguyén sinh chat va trong nhân tế bảo các protein, polypeptide bị biến tính thường bị phân giải trong proteasome với sự tham gia của một loại protein với khối lượng phân tử nhỏ — ubiquitin.
(A) (B)
Gly 75 976 Gly 75 Arg 74
40 70 Lys-4g
Hình 4.9: Câu trúc phan tử Ubiquitin: A. Cầu trúc không gian với các vị trí đặc hiệu: Lys29; Lys48, Lys63 và Giy76; B. Mô hình ribbon (theo Buchanan et al.,
2000).
170
Ubiquitin 14 Hsp nhỏ có tính bao thủ rất cao về trình tự amino acid ở tất cả các loài thực vật. Chúng cấu tạo từ chuỗi 76 amino acid, trong đó một số vị trí quan trọng như Gly76 ở đầu C, còn các gốc Lys29, Lys48 và Lys63 tham gia vào tạo chuỗi polyubiquitin (hình 4.9). Họ gen ubiquitin có hai loại đơn vị phiên mã chính: ubiquitin dang monomer và polyubiquitin. Gen polyubiquitin mã hóa cho polyprotein gồm vài đơn vị ubiquitin ké tiép nhau. Ubiquitin dang don được tách ra từ chuỗi polyprotein nay.
Qua trinh tuong tac gitra ubiquitin va protein dugc nhiéu enzyme tham gia hoạt hóa va vận chuyển theo quy trình phức tạp có nhiều bước sử dụng năng lượng ATP. Tén tại ít nhất 3 loại enzyme tham gia vào quá irinh nay: Enzyme hoat héa ubiquitin El (ubiquitin-activating enzyme), enzyme tiép hop voi ubiquitin E2 (ubiquitin-conjugating enzyme) va enzyme gan véi ubiquitin E3 (ubiquitin-ligating enzyme). Qua trinh cé
thé được tiễn hành theo các bước sau đây (hình 4.10):
Bước 1: Đầu tiên, nhóm carboxyl ở đầu C (Gly76) của ubiquitin gắn với nhóm SH của Cys trong enzyme E1 sử dụng năng lượng ATP. Thường mỗi loại ubiquitin chỉ có duy nhất một enzyme E1 tương ứng.
Bước 2: Ubiquitin được enzyme EI chuyên sang nhóm SH của Cys trong enzyme E2, đồng thời giải phóng ra enzyme E]. Số lượng E2 có thể nhận biết được mỗi E1 hơn gấp nhiều lần.
Bước 3: Những protein đích - protein cơ chất cần bị phân giải, được gắn với enzyme E3.
Bước 4: Enzyme E2 và E3 tương tác tạo phức hệ E2-E3 để thúc đây ubiquitin gần với protein đích. Số lượng enzyme E3 trong tế bào nhiều hơn E2 phụ thuộc vào protein cơ chất cần phân giải.
Bước 5: Phức hệ này tạo khả năng để nhóm carboxyl cia ubiquitin chuyén sang gan với nhóm amino của Lys trong protein cơ chất. Như vậy, ubiquitin gắn với protein đích bằng liên kết cộng hóa trị.
171
2” đích
ô 6-
1255 EA,
Phức bệ
N ubiquitin-
* proteasome
Vận chuyển đến
tee Ca) proteasome
3° _-
aCn,
OS 2Ó
Phức hệ enzyme E2-E3
Hình 4.10: Sự hình thành chuỗi polyubiquitin và vận chuyển protein cơ chất với
sự tham gia của các enzyme: enzyme hoạt hóa ubiquitin E1 (ubiquitin- activating enzyme);, enzyme tiếp hợp với ubiquitin E2 (ubiquitin-conjugating enzyme) va enzyme gan voi ubiquitin E3 (ubiquitin-ligating enzyme) str dung nang lugng ATP (theo Buchanan et al., 2000).
172
Bước 6: Việc chuyên ubiquitin được thực hiện liên tiếp nhiều lần, lặp lại các bước trên để tạo thành chuỗi polyubiquitin: gốc carboxy] ở đầu C (Gly76) của ubiquitin tiếp theo gắn với gốc amino của Lys48 của phân tử
ubiquitin trước nó. Số lượng ubiquitin chiếm 4 phân tử.
Bước 7: Phức hệ E2-E3-polyubiquitin-protein phân ly, tách enzyme E2
và E3 ra khỏi chuỗi polyubiquitin-protein đích.
Bước 8: Chuỗi polyubiquitin-protein đích thúc đây việc chuyển protein nay tir ubiquitin sang proteasome dé phan giai thanh amino acid.
Sự đặc hiểu của enzyme El déi v6i E2 va déi voi E3 duge thé hién
trong co thé sinh vat bằng sự tương quan số lượng của chúng: trong các cơ thể nhân thực có thể có một vài dạng enzyme E1, nhưng có nhiều E2 và rất nhiều E3. Ví dụ trong tế bào nắm men, mỗi loại ubiquitin có duy nhất một enzyme E1 đặc hiệu tương ứng, nhưng có đến 11 enzyme E2 có thể nhận biết được phức hệ E1-ubiquitin này và 20 loại enzyme E3 có thể tương tác với các E2 kể trên. Số lượng E3 nhiều như vậy là do sự đa dạng của protein cơ chất cần bị phân giải. Enzyme E3 cần có cấu trúc phù hợp để nhận biết và tương tác với các dạng protein cơ chất này. Ở Arabidopsis có trên 1400 gen mã hóa cho quá trình phân giải protein theo phức hệ ubiquitin/26S proteasome, chiém khoang 5% t tổng số gen của cây này, nó lớn hơn so với bất kỳ cơ thể động vật nào khác. Điều đó chứng tỏ nhiều quá trình trao đổi chất trong thực vật phụ thuộc vào sự _ phân giải protein. Trong số gen đó, có đến 90% gen mã hóa cho các
enzyme E3.
Enzyme E3 ở thực vật có thể chia thành hai nhóm: HECT E3 và RING E3
HECT (Homologuos to E6AP carboxy terminus) là một nhóm E3 nhỏ, ở Arabidopsis có 7 đại diện của nhóm này. Đây là những protein có khối lượng phân tử từ 100 đến 400 kDa. Vùng hoạt tính HECT khoảng 350 amino acid có chứa điểm gắn với ubiquiin và điểm gắn với enzyme E2.
173
RING (Really interesting new gene) là một nhóm protein lớn ở thực
vật, chúng có vùng gắn với ion Zn”” hoặc còn gọi là vùng dấu RING như
một đặc điểm quan trọng của protein đạng này. Vùng này có khoảng 70 amino acid chứa ion Zn” để ôn định cấu trúc và là điểm gắn với enzym E2. Ở Arabidopsis có đến trên 400 gen mã hóa cho protein dạng này.
RING có thể tổn tại.ở dạng đơn, chỉ có một tiểu đơn vị, hoặc dạng đa tiểu đơn vị. Trong các dạng đa tiểu đơn vị, nhóm SCF được nghiên cứu sâu nhất. Tên của nhóm protein này lấy từ tên của 3 trong số 4 tiểu đơn vị cấu thành (Skp1-Cullin protein, F box va Rbx1): SKP, Cullin protein va F-
box. Tiểu đơn vị thứ 4, Rbx1, chính là dấu RING protein. Các đại diện
của nhóm này điều khiển sự tổng hợp các chất hormon sinh trưởng trong thực vật thông qua việc phân giải các protein kìm hãm hoặc hoạt hóa phiên mã. Trong các chất hormon có auxin, gibberellin, ngoài ra còn có các chất ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của tế bào như JA, ethylene
và ánh sáng. SCF còn điều khiển sự không tương thích đối với bào tử, hạt
phan. Chi với điều kiện các yếu tố protein trong tế bào nhận biết được sự tương thích từ cấu trúc protein đặc thù của hat phan, hạt phấn mới phát triên được.
Polyubiquitination
Hình 4.11 : Mô hình cấu trúc SCF (SkpI-Cullin protein, F box và Rbx1) - E3
va sự dịch chuyén ubiquitin (Ubi) ti enzyme E] (enzyme hoat héa ubiquitin) dén E2 (enzyme tiếp hợp với ubiquitin) va gan véi SCF- E3 (enzyme gan voi ubiquitin) dé phân gidi protein DELLA (theo Zeng et al., 2002).
174
Mô hình của SCF được trình bày trên hình 4.11 trong trường hợp điều khiển sự sinh tổng hợp gibberellin bằng protein DELLA. DELLA là họ protein có chức năng TF, có tận cùng đầu N là chuỗi amino acid DELLA. Ngoài ra, chúng còn chứa vùng tín hiệu định vị nhân và vùng hoạt tính. Trong 4rabidopsis có 5 protein thuộc dạng này. DELLA điều khiển bằng cách ức chế sự tông hợp gibberellin. Khi không có gibberellin trong té bao, DELLA 6 dang ty do và ức chế sự sinh tổng hợp chất này.
Khi có chất hoạt hóa gibberellin, chất này tác động với GIPI (GIBBERELLIN INSENSITIVE DWAREI), thúc day DELLA đến với
SCF-E3 va bi phan giải trong phức hệ Ubiquitin-proteasome. DELLA bị
phân giải, quá trình tổng hợp gibberellin không còn bị ức chế và tạo điều
kiện tổng hợp nhiều gibberellin trong tế bào.
Proteasome là phức hệ protein với khối lượng phân tử trên 1,5 MDa, tồn tại ở hai dạng: 20S và 26S. Proteasome 20S cấu tạo từ 4 vòng liên kết (a, B, B, œ) có dạng hình trụ. Mỗi vòng cấu tạo từ 7 chuỗi polypeptide. Tâm hoạt tính protease nằm bên trong rãnh của các vòng.
Phức hệ protein điều hòa 19S gắn với hai đầu của proteasome 20S tạo thanh proteasome 26S str dung nang Iugng ATP. Tiếp theo, chuỗi polyubiquitin chuyển protein đích đến proteasome và đưa vào bên trong
lõi của phức hệ 26S. Thể hình khối 26 có hai nắp đậy ngăn cdc protein khác vào proteasome và không phân giải các protein khác của tế bào.
Protein 19S ở thực vật cấu tạo từ 9 tiêu đơn vị nhỏ (hình 4.12). Chức năng của chúng là nhận biết cơ chất protein do chuỗi ubiquitin chuyển đến và giải phóng chuỗi ubiquitin sau đó. Trong quá trình phân giải này
có sự tham gia của nhiều protein - sản phẩm biểu hiện của trên 100 gen.
- Chuỗi polyubiquitin không bị phân giải cùng với protein cơ chất.
Chúng bị phân giải bằng một loại enzyme đặc hiệu: enzyme loại
ubiquitin-DUBs (deubiquitilating enzyme). Tén tai nhiều loại DUBs với
các vùng đặc hiệu có cấu trúc khác nhau để có thể kiểm soát hoặc điều hòa các quá trình thủy phân trong tế bảo.
175
£=° Phức hệ Ưbiquitin-
protein Phức hệ e atte proteasome 26S
Phuc hé proteasome 20S
Giải phóng
` chuỗi Ubiquitin
Phức hệ Q
proteasome 19S coon 3
cooœn
Hình 4.12: Mô hình hoạt động của ubiquiin và phức hệ proteasome:
Proteasome 20S khớp nối với hai phức hệ 19S tạo thành phức hệ proteasome 26S sử dụng năng lượng ATP. Ubiquitin chuyên protein cơ chất đến phức hệ proteasome 26S để phân giải đến peptide va amino acid (theo Buchanan et al, 2000).