Protease, enzyme thủy phân protein, được tìm thấy trong hạt cách đây hơn 100 năm. Từ đó đến nay rất nhiều công trình nghiên cứu về protease ở các mức độ khác nhau và gần đây nhất là tỉnh sạch, xác định trình tự, phân lập gen mã hóa, nghiên cứu các tâm hoạt tính, cấu trúc không gian...
40
Protease đóng vai trò quan trọng trong cơ thể sống và nhất là trong thoi ky nay mầm của hạt. Protease không chỉ tham gia vào thủy phân protein dự trữ nhằm cung cấp amino acid cho thời kỳ phát triển đầu tiên của cây mà chúng còn tham gia vào quá trình vi xử lý phân tử tiền chất protein, phân hủy các protein lạ hoặc bị biến tính khi bị stress (lạnh, mặn, hạn, tác động cơ học...).
Protease trực tiếp tham gia vào thủy phân protein dự trữ có một số đặc tính như sau:
(1) Có khả năng thủy phân protein dự trữ ở trạng thái tĩnh hoặc sản phẩm thủy phân của chúng trong giai đoạn nay mdm (tir polypeptide dén dipeptide).
(2) Không có sự cản trở về không gian và thời gian đôi với tác động của protease lên cơ chât tự nhiên của chúng. Điều này có nghĩa là enzyme và cơ chất cùng tồn tại trong một vị trí của tế bào.
(3) Có khả năng hoạt hóa ở điều kiện môi trường bào quan chúng tồn tại (pH tối ưu, không có hoặc hoạt tính ức chế protease thấp).
Một số protease trong hạt có thể được tông hợp trước ở dạng tiền chất và tồn tại song song với protein dự trữ, cũng có một số khác được tổng hợp mới trong quá trình nay mam. pH tối ưu của các protease trong vùng acid nhẹ: 5,0-5,3. Đó cũng chính là pH đặc trưng cho bảo quan.
Thành phần phức tạp của các protease hạt được tạo ra bởi sự đa dạng chức năng do chúng đảm nhiệm trong thời kỳ nay mầm: ngoài thủy phân protein dự trữ, protease còn có thể tham gia vào quá trình hoạt hóa các enzyme khác. Hơn nữa quá trình phân giải protein dự trữ đến amino acid không phải chỉ có một enzyme mà cả một nhóm các enzyme khác nhau bởi đặc tính sinh học, khả năng gắn đặc hiệu vào cơ chất cũng như thứ tự tác động lên các cơ chất đặc hiệu. Các protease được nghiên cứu ở mức độ sâu được trình bày sau đây.
2.2.1. Protease A (EC 3.4.22)
Protease A 1A cysteine endopeptidase dang papain. Céng trinh dau tiên về enzyme này thuộc về nhóm nghiên cứu của GS Chrispeels, năm 41
1977. Enzyme thủy phân vicilin trong hat Vigna radiata nay mam và được tông hợp đe novo. Sau khi tách chiết và tỉnh sạch xác định được
khối lượng phân tử là 23kDa, pI 3,75; pH tối ưu 5,1. Trong điều kiện thí
nghiệm, chúng thủy phân mối liên kết ester tạo bởi gốc Asn hoặc Gin của vicilin. Trong hạt, enzyme có hoạt tính cao nhất từ ngày nây mầm thứ 2
đến ngày thứ 5 khi vicilin hầu như bị phân giải hoàn toàn.
Cysteine endopeptidase dạng papain hiện diện như một protease chính trong quá trình thủy phân protein dự trữ được tìm thấy trong một loạt các cây họ đậu: trong lá mầm của hạt đậu trắng (Phaseolus vulgaris) hoặc đậu xanh (Vigna mungo) ma 6 day được đặt tên là SH-ED; ở hạt đậu tim nay mam (Vicia sativa) dugc goi la protease A-va proteinase A;
trong hat dau tuong (Glycine max) ở các giai đoạn đang chín, đã chín và nảy mầm có protease P34. Protease đạng này còn tìm thấy trong vỏ quả đậu trắng được gọi là EP-C1.
Trong cây một lá mầm, nghiên cứu một số protease A đã tính sạch
bằng phương pháp điện di không biến tính với cơ chất là gelatin và
vicilin cho thấy: ở đại mạch có 2 isozyme EP-A, EP-B, con & hat nay mam của lúa mỳ có 3 isozyme. Chúng có chuỗi amino acid tận cùng đầu N giống nhau và đều cùng là NH;-SEQLP. Hai isozyme của đại mạch
đều giống nhau đầu N, chúng khác nhau ở chuỗi amino acid đầu C.
Protease A, proteinase A, SH-EP, P34 đều được tổng hợp trên màng lưới nội bào, được vận chuyển và cuối cùng xuất hiện trong không bào dự trữ. Sản phẩm đầu tiên của protease A có khối lượng phân tử 43 kDa
và còn chịu sự thủy phân hạn chế từ 3 đến 4 lần tiếp theo, ví dụ như cắt
chuỗi peptide tín hiệu-SP (signal peptide) tại đầu N. Sau lần cắt hạn chế
cudi cing, enzyme sé cé 6 trạng thái được hoạt hóa hoàn toàn. Tiền chất
của protease A đều có vùng gắn với gốc glycosyl, có chuỗi KDEL-tin hiệu của lưới nội bào, nhưng không thấy trong enzyme đã thuần thục.
P34 luôn ở dạng dimer trong hạt chín và không có hoạt tính enzyme ở
trạng thái này. Sau quá trình thuần thục, bị cất hạn chế, chúng chuyển
thành đạng monomer và có hoạt tính enzyme ở trạng thái mới này.
42
Protease ở nhóm này có khối lượng phân tử rất khác nhau: SH-EP — 33 kDa (được xác định bằng phương pháp điện dị), P34 — 28,6 kDa, protease A — 25,5 kDa (cả hai đều được tính theo cDNA), proteinase A- 25,2 kDa. pH tối ưu của các enzyme này đều trong khoảng gần 5. Chúng có 7 gốc Cys tham gia vào tâm hoạt tính enzyme. Chính vì vậy chúng đều thuộc nhóm cysteine endopeptidase.
Becker và đồng tác giả đã tìm thấy 2 cysteine endopeptidase dạng papain khac CPR1, CPR2 trong lá mầm hạt đậu tằm (Vicia sativa) dang nay mam. Chang được téng hop de novo trong qua trình nảy mầm và có trình tự giống như cysteine endopeptidase sinh ra khi bị hạn trong hạt cây đậu Ha Lan (Pisum sativum). Chúng cũng giỗng với protease GMCP3 trong hạt đậu tương đang hình thành.
2.2.2. Protease B (EC 3.4.23)
Protease B (cysteine endopeptidase dang legumain) được nghiên cứu đầu tiên tại phòng Hóa protein của GS. Vaintraub, nam 1982, trong lá mam hạt đậu tim Vicia sativa dang nay mầm, có pH tối ưu ở 5,6 và điểm cắt đặc hiệu tại Asn. Chính vì vậy chúng còn có tên là asparaginyl endopeptidase. Becker và đồng tác giả, năm 1995, đã xác định trình tự cDNA của protease B. Khối lượng phân tử của chúng khoảng 37-39 kDa.
Cơ chất chính là globulin, nhưng chỉ những globulin đã được hoạt hóa bang protease A. Hoat tinh cla protease B chỉ xuất hiện sau protease A.
Protease B còn tham gia vào quá trình vi xử lý của legumin, globulin 11S, từ tiền chất prolegumin. Vì vậy chúng còn có tên là “legumain”.
Cysteine endopeptidase dạng legumain được nhiều tác giả nghiên cứu trên đậu tương, đậu kiếm, đậu xanh, lạc, đậu thận trong các thời kỳ phát triển khác nhau của hạt và nhận thấy rằng chúng là một nhóm có
khối lượng phân tử từ 33-63 kDa. Nghiên cứu so sánh các gen mã hóa
cho trên 30 enzyme thuộc loại này cho thấy chúng chia thành hai nhóm chính ở thực vật bao gồm: (1) Nhóm enzyme phát hiện thấy trong quá trình phát triển của hạt; (2) Nhóm enzyme — trong các cơ quan sinh dưỡng. Ngoài ra, còn một vai enzyme tìm thấy trong giai đoạn sớm quá trình hình thành phôi. Ngoài vi xử lý tiền chất legumin, enzyme này còn
43
OD me
tham gia vi xử lý tiền chất một số protein có điểm cắt đặc hiệu tại Asn như một vài lectin, các protease, chất ức chế protease và albumin z 28.
Protease B được tổng hợp trên mảng của lưới nội bào, sau đó, đoạn -- peptide tín hiệu bị loại bỏ, nhưng enzyme vẫn chưa có hoạt tính. Enzyme chỉ hoạt động khi được chuyển vào bào quan dự trữ và được thuần thục bằng cách loại bỏ các tiền peptide đầu N và đầu C.-:
2.2.3. Serine endopeptidase Cl (EC 3. 4, 21)
Serine endopeptidase C1 tim thay trong lá mầm của hạt đậu tương ' dang nay mam. Enzyme nay tham gia thủy phân chuỗi œ, œ` của B-conglycinin cũng như loại protein tương tự ở cõy đậu Họ Lan. Serine endopeptidase Cl co pH tối ưu từ 3,5-4,5 và khối lượng phân tử là 70 kDa. Trung tâm hoạt tính của enzyme có chứa gốc Ser. Hoạt tính của chúng không có trong hạt khô mà chỉ xác định được sau một ngày thấm âm hạt. Trong hạt nây mầm của cây đậu xanh đã tìm thay enzyme tuong tu nhu serine endopeptidase C1 tham gia thay phan tiéu don vj protein 64 kDa ở đây.
2.2.4. Endopeptidase chứa kim loại (EC 3.4.24)
Endopeptidase chứa kim loại (metallo endopeptidase) tìm thấy trong hạt kiều mạch. Enzyme này có chứa Zn trong tâm hoạt tính. Dạng endopeptidase này có khả năng thủy phân legumin trong hạt nguyên thủy của kiều mạch. lon Zn”” có nhiệm vụ làm trung gian chuyên enzyme từ trạng thái tĩnh sang trạng thái hoạt hóa, tách khỏi chất ức chế và bắt đầu thủy phân globulin. Còn cysteine endopeptidase chỉ thủy phân globulin ở giai đoạn sau trong quá trình nây mầm của kiều mạch. Belozersky và đồng tác giả đã đưa ra giả thuyết về sự thủy phân hạn chế legumin của endopeptidase chứa kim loại tạo điều kiện quyết định đầu tiên cho sự thủy phân tiếp tục globulin bằng các cysteine endopeptidase khác. Hoạt tính của các protease thường bị ức chế bởi lượng dư thừa các sản phẩm phân hủy của chúng.
44
2.2.5. Carboxy peptidase (EC3.4.16)
Carboxypeptidase - protease thiy phan chudi polypeptide ti tan cùng đầu C của chuỗi. Nhóm enzyme có một số đặc tính như sau: có chứa Ser trong tâm hoạt tính, pH tối ưu trong vùng acid 4-6 và tính đặc hiệu thấp. Đại mạch có 5 carboxypeptidase, còn lúa mỳ, lúa nước, đậu tương thì có Ít nhất 2 carboxypeptidase. Trong số 5 carboxypeptidase của đại mạch có 2 enzyme thủy phan mối liên kết peptide tạo bằng gốc carboxyl của Pro. Khối lượng phân tử của chúng rất đa dạng, dao động trong khoảng từ 43 kDa đến 170 kDa. Carboxypeptidase chứa trong hạt protein dự trữ, hoạt tính của chúng tăng dẫn trong quá trình nay mam.
2.2.6 Aminopeptidase (EC3.4.11)
Aminopeptidase 14 protease phân hủy polypeptide tir tan cuối đầu N. Loại enzyme này tìm thấy trong hạt nay mam cla cac cay mét 1a mam và hai lá mầm. Đây là nhóm các enzyme có khả năng tác động lên các cơ
chất mô hình có hoạt tính ở pH trung tính. Chúng khác nhau bởi sự đặc
hiệu của cơ chất. Chúng tác động chủ yếu lén di-, tri- va oligopeptide co chứa amino acid ky nước Pro. Enzyme này hoạt động ở khâu cuối cùng trong quá trình phân giải protein.