VÀ TẠO CÁU TRÚC KHÔNG GIAN CHO PROTEIN Ở CÁC BẢO QUAN
4.7. MỘT SÓ NGHIÊN CUU VE PROTEIN LIEN QUAN DEN TÍNH CHỊU NÓNG Ở VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
4.7.2. Protien chịu nhiệt ở đậu tương
Nhóm protein chịu nhiệt là một nhóm protein lớn trong hạt và trong phôi mầm của hạt. Thành phần chính trong nhóm này chính là protein LEA và Hsp. Protein LEA là những protein chịu nhiệt điển hình trong hạt, bao gồm nhiều nhóm với khối lượng phân tử rất khác nhau từ 9 kDa- 181
200 kDa, mỗi nhóm đều có cấu trúc đặc thù đẻ thực hiện chức năng của
mình. Có nhóm có chức năng cô lập ion như protein LEA-D7, LEA-D29;
có nhóm có chức năng giữ nước như LEA2-D19; có nhóm có khả năng bảo vệ các cấu trúc tế bào trong điều kiện mắt nước như LEA-D113.
Cần phải lưu ý rằng proein LEA là nhóm protein chịu nhiệt chủ yếu trong hạt và quá trình phát triển của hạt, nhưng không phải tất cả các protein chịu nhiệt đều là protein LEA. Các Hsp có nhiều trong hạt và cũng có khả năng chịu nhiệt. Sự có mặt của chúng làm cho hạt có khả năng chống chịu nóng tốt. Một số nghiên cứu về protein chịu nhiệt được trình bày sau đây.
4.7.2.1. Khảo sát sự thay đổi của protein chịu nhiệt trong quá trình nay mầm trên giống đậu tương chịu nóng M103
Từ năm 1996, những thí nghiêm đầu tiên thăm dò ảnh hưởng của
nhiệt độ cao lên protein chịu nhiệt ở đậu tương đã được tiến hành. Thời gian đầu tuy chưa có kết quả rõ rệt nhưng đã phát hiện được 3 yếu tố có thể đóng vai trò quan trọng trong những thí nghiệm này. Đó là: (1) Thời gian thấm ẩm hạt trước khi xử lý nhiệt độ: từ 2 giờ đến 1 ngày; (2) Nhiệt
độ xử lý: từ 32°C đến 45°C: và 3) Thời gian xử lý nhiệt độ: từ vài phút cho đên 14 ngày,
Giống đậu tương M103 được chọn làm đối tượng để khảo sát sự
thay đổi protein chịu nhiệt trong quá trình nảy mầm. Hạt thấm ẩm trong các thời gian khác nhau (2 giờ, 4 giờ, l2 giờ, l ngày) sau đó lô thí nghiệm được xử lý nhiệt độ 45°C trong 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 12 giờ,
1 ngày. Lô đối chứng hạt đậu tương để nẫy mam ở nhiệt độ 25°C. Phôi
mầm được tách ra khỏi hạt để nghiên cứu protein chịu nhiệt.
Protein chịu nhiệt được tách chiết từ phôi mầm theo phương pháp của Blackman et al, 1992, Mam duge nghiền nhỏ, ủ trong dung dịch đệm
Tris-HCl 50 mM pH 7,5; MgCl. 5 mM; PMSF 1mM trong | gid & 4°C.
Ly tâm để loại cặn tế bào 12 nghìn vòng/phút trong 30 phút ở 4°C. Dịch ly tâm ủ 80°C trong 10 phút để biến tính và loại bỏ protein không chịu
182
nhiệt. Sau khi ly tâm, dung dịch chứa protein chịu nhiệt được phân tích
bằng SDS PAGE với nồng độ gel từ 12-18%.
1 2 2. ngày) kDa ô= M TNĐC TNĐC THRĐC 7”
oF a7 a3
30
20 -¿
14 se |
Hình 4.15: Phổ điện di protein chịu nhiệt trong phôi hạt khô (M) va hat tham ẩm ở điều kiện bình thường (ĐC) và xử lý 45°C trong 2 gid (TN), sau 1, 2,3
ngày nẫy mầm của giếng đậu tương M103 (Trần Thị Phương Lién et al., 2004).
Sau khi thay đổi thời gian thấm âm hạt khác nhau từ 2 giờ, 4 giờ , 6
giờ, 12 giờ, 1 ngày, thời gian thấm ẩm hạt là 1 ngày và xử lý nhiệt độ 45°C trong 2 giờ được chọn dé nghién cứu khảo sát trên giống đột biến chịu nóng M103. Hạt sau khi xử lý vẫn để nảy mầm trong điều kiện bình thường đến ngày nảy mắm thứ 4. Kết quả được trình bày trên hình 4.15.
Như vậy, trong giai đoạn hạt khô, protein chịu nhiệt rất đa đạng bao gồm 26 vạch với khối lượng phân tử từ 10 đến 126 kDa. Những vạch đậm nhất tương ứng với khối lượng phân tử khoảng 100 kDa, 70 kDa, 60 kDa, 30 kDa, 20 kDa, 16 kDa, 10-14 kDa. Trong giai đoạn nảy mầm chúng giảm mạnh cho đến ngày thứ 4. Tuy nhiên, vạch tương ứng với 27,5 kDa không giảm mà còn tăng lên rõ rệt cả ở lô thí nghiệm và đối chứng. Điều đó chứng tỏ rằng chính ở giai đoạn này vẫn có tăng cường thêm protein chịu nhiệt. Không nhận thấy sự khác biệt ở tất cả các lô thí nghiệm so với lô đối chứng. Như vậy đối với giếng M103 điều kiện xử lý này không ảnh hưởng đến thành phần protein chịu nhiệt. Protein chịu nhiệt được nghiên cứu trên nhiều đối tượng và các phòng thí nghiệm khác nhau ở 183
điều kiện phát triển bình thường cũng như trong điều kiện mất nước. Sự giảm dần protein chịu nhiệt trong thời gian nẫy mầm cũng được các tác
giả khác phát hiện thấy.
4.7.2.2. Nghiên cứu protein chịu nhiệt trong phôi mầm của hạt một số giống đậu tương địa phương và một số giống đại trà có khả năng chịu nóng, chịu hạn
Trên cơ sở kết quả của nhiều thử nghiệm với giống M103 với các thời gian xử lý nhiệt độ khác nhau, chúng tôi tiến hành thí nghiệm với
các giống đậu tương địa phương chịu hạn là Đỗ Lạng, Thúa Lá, Azumpa
- Gia Lai, Cúc Hữu Lũng-Lạng Sơn, Cúc Vàng, VX93 và giống chịu
nóng: Ba tháng-Đơn Ca-Chi Lăng. Hạt thắm âm sau 1 ngày được xử lý nhiệt độ 45°C trong 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 1 ngày, phôi mầm được tách
riêng ra để phân tích protein chịu nhiệt bằng SDS PAGE. Két qua cho thấy các giống khác nhau có sự khác nhau về thành phần protein chịu nhiệt. Tốc độ giảm thành phần protein chịu nhiệt từ ngày nảy mầm thứ I đến ngày nảy mầm thứ hai khác nhau giữa các giống: Cúc Vàng có tốc độ giảm nhanh nhất, Đỗ Lang, M103, Ba thang-Don Ca-Chi Lang giảm cham hơn. Cần phải nhấn mạnh rằng đặc tính phát triển sinh lý của các giống này rất khác nhau, nhất là thời gian sinh trưởng và khối lượng hạt.
Trên thực tế sự chuyển trạng thái từ hạt khô - có khả năng chống chịu với mọi điều kiện ngoại cảnh, sang trạng thái nây mầm là cả một sự biến đổi về lượng và chất, đặc biệt là giải phóng dần dần các chất bảo vệ các cầu trúc tế bào trong hạt khô như protein LEA, oligosaccharide... Khả năng chống chịu của mầm non của đậu tương trong thời gian này đối với từng điều kiện khắc nghiệt nhất định giúp cho các nhà chọn giống dự đoán khả năng chống chịu ở các giống đậu tương tương ứng.
Protein chịu nhiệt ở hai giống đậu tương chịu nóng
Các giống chịu nóng M103 và Ba tháng-Đơn Sa-Chi Lăng đều có tốc độ giảm thành phần protein chịu nhiệt chậm trong quá trình nay mam.
Đối với cả hai giống lô thí nghiệm 4 giờ, § giờ, không nhận thấy sự thay đổi đỏng kẻ. Tuy nhiờn trong lụ thớ nghiệm 6 giờ ử ở giống M103 cú thờm vạch 41 kDa và mất đi vạch 126 kDa; còn ở giống Ba thang-Don Ca-Chi
184
Lăng có thêm vạch 30 kDa, còn các vạch 36 kDa, 24 kDa đều đậm hơn
so với lô đối chứng. Sự thay đổi rõ nét nhất là ở lô thí nghiệm I ngày của
cả hai giống: nhóm protein chịu nhiệt ở lô thí nghiệm của giống M103 đã giảm đáng kể theo thời gian, nhưng so với lô đối chứng số vạch vẫn nhiều và đậm hơn: protein chịu nhiệt 43-70 kDa vẫn còn nhận rõ nét, đặc biệt có thêm vạch protein chịu nhiệt 22,3 và 35,4 kDa; Còn ở giống Ba thang-Don Ca-Chi Lăng, trong khi lô đối chứng, các nhóm protein chịu
nhiệt giảm đáng kể thì ngược lại lô thí nghiệm có mặt hầu hết các đại
diện của protein chịu nhiệt, rõ nhất là các protein chịu nhiệt 40,9; 43;
34,5 và từ 20-22 kDa. Protein chịu nhiệt 27,5 kDa được lưu ý đến vì protein này có ở lượng nhỏ trong hạt khô của M103, lượng tăng lên đồng thời trong cả lô đối chứng và thí nghiệm và hiện tượng này cũng được
nhận thấy ở giống Ba tháng-Đơn Ca-Chi Lăng. Kết quả nhận được cho phép giả thiết rằng, phôi mầm của các giống M103 và Ba thang-Don Ca- Chỉ Lăng đã phản ứng với nhiệt độ cực đoan bằng cách không tăng
cường sự phân giải mà duy trì các phức hệ protein chịu nhiệt với chức
năng bảo vệ vốn có. Chính vì vậy mà ở lô thí nghiệm, đặc biệt là lô thí nghiệm 1 ngày, phổ điện đi đa dạng và vạch đậm hơn hắn so với lô đối chứng. Tuy nhiên, mỗi giống đậu tương đều đã phản ứng một cách khác nhau.
Protein chịu nhiệt ở một số giống địa phương chịu hạn, lạnh
Các giống địa phương chịu hạn, lạnh phản ứng với nhiệt độ cực
đoan rất khác nhau, thể hiện rõ nhất ở lô thí nghiệm 8 giờ (hình 4.16).
Vùng thay đổi rõ nhất là vùng protein chịu nhiệt 50-70 kDa (ký hiệu E trên hình): ở các lô thí nghiệm về số vạch và độ đậm đều kém so với lô đối chứng. Vùng protein chịu nhiệt 25- 35 kDa cũng có sự khác biệt giữa
các giống: nếu như Azưmpa -Gia Lai có protein chịu nhiệt 27,5 kDa xuất hiện ở lô thí nghiệm và đối chứng như nhau về độ đậm; thì lô thí nghiệm giống Thúa Lá vạch protein này đậm hơn hẳn so với đối chứng, còn Cúc Hữu Lũng-Lạng Sơn và Cúc Vàng thì ngược lại lô đối chứng đậm hơn so với lô thí nghiệm.
185
Thúa Lá là một giống chịu hạn lạnh có phản ứng với hiện tượng sốc nhiệt rất khác so với tất cả các giống còn lại. Ở tất cả các lô thí nghiệm
(xử lý nhiệt độ cao 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ và I ngày) đều nhận thấy phổ protein chịu nhiệt yếu hơn so với đối chứng, đặc biệt là vùng protein chịu
nhiệt từ 70-100 kDa, trong khi vạch 27,5 kDa lại đậm lên.
kDg - TNĐC TNDC TN ĐCTN ĐC.
Hình 4.16: Phổ điện di protein chịu nhiệt trong phôi hạt đậu tương nây mam 6 diéu kién binh thường đối chứng (ĐC) và thí nghiệm xử lý 45°C trong 8 giờ (TN) của các giống đậu tương: l- Azưmpa Gia Lai; 2- Cúc Hữu Lũng; 3- Cúc Vàng; 4- Thúa Lá (Trần Thị Phuong Lién et al., 2004).
Phản ứng với nhiệt độ thể hiện khác nhau giữa các giống chịu hạn, lạnh rõ nhất ở các lô thí nghiệm 1 ngày và có thể chia thành 2 nhóm:
Nhóm 1 - Cúc Vàng và Azưmpa-Gia Lai có phản ứng giống như các giống chịu nóng M103 và Ba tháng-Đơn Ca- Chi Lăng: tốc độ giảm thành phần protein chịu nhiệt ở lô thí nghiệm chậm hơn so với lô đối chứng: số vạch và độ đậm của vạch ở lô thí nghiệm nhiều hơn lô đối chứng. Phản ứng này tương tự như phản ứng của nhóm protein LEA đưới tác động của ABA khi tế bào bj mat nước.
Nhóm 2- VX93, Đỗ Lạng, Cúc Hữu Lũng-Lạng Sơn lại có phổ protein chịu nhiệt ở lô thí nghiệm giảm nhanh hơn so với lô đối chứng, nhất là vùng protein chịu nhiệt 43-70 kDa. Sự giảm thành phần protein chịu nhiệt ở lô thí nghiệm đối với các giống chịu hạn lạnh như Thúa Lá, 186
VX93, Đỗ Lạng, Cúc Hữu Lũng-Lạng Sơn và thể hiện rõ nhất khi xử lý
1 ngày có thê giả thiết rằng dưới tác động của nhiệt độ đã làm yếu đi sự tương tác giữa protein chịu nhiệt và các cầu trúc tế bào đẩy nhanh quá trình phân hủy chúng.
Phôi mầm của các giống đậu tương khác nhau đã phản ứng một cách khác nhau dưới sự tác động của nhiệt độ tăng cao hơn nhiệt độ tối ưu. Trong số các vạch protein chịu nhiệt, đặc biệt chú ý đến vạch protein chịu nhiệt 27,5 kDa: đây là vạch xuất hiện thêm trong quá trình nây mầm của M103, chúng có ở trong cả lô thí nghiệm và lô đối chứng của các giống chịu nóng như M103, Ba tháng-Đơn Ca-Chi Lăng và giống chịu hạn lạnh Azưmpa-Gia Lai, Cúc Vàng. Nhưng ở giống chịu hạn lạnh Thúa
Lá vạch này đậm hẳn ở các lô thí nghiệm 4, 6, 8 giờ và I ngày. Có thể
đây là một loại protein chịu nhiệt đặc biệt, luôn có mặt trong các giống đậu tương có khả năng chịu nóng, nhưng chỉ tổng hợp khi có tác động của nhiệt ở giống chịu hạn lạnh Thúủa Lá như phản ứng tự vệ.
Trong điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa ở nước ta, việc cất giữ
đậu tương giống dé dam bảo độ ndy mdm qua năm là rất khó. Vì vậy, đi
đôi với các giống thích hợp với từng vụ có năng suất cao, hướng chọn tạo được các giống có khả năng trong cả 3 vụ trong năm, ít mẫn cảm với ánh sáng, thời gian sinh trưởng ngắn ngày là điều cần thiết. Các giống chịu hạn lạnh như Azưmpa-Gia Lai, Cúc Vàng lại có phản ứng với nhiệt độ cao như các giống chịu nóng có thể sử dụng làm nguyên liệu lai tạo cho mục đích này. Tuy vậy, cần nghiên cứu sâu rộng hơn trên tập đoàn giống đậu tương địa phương cũng như các dòng nhập nội, đồng thời mở rộng ra những nhóm chất khác liên quan đến tính chịu nóng hạn như Hsp, oligosaccharide... và các yếu tố liên quan đến sự mẫn cảm ánh sáng để có thể tìm ra quy luật của chúng.
Tóm lại, protein chịu nhiệt đã được tách chiết từ phôi mầm của hạt
khô và hạt này. mầm của giống chịu nóng M103, Ba thang-Don Ca-Chi
Lăng và các giếng chịu hạn lạnh Azưmpa-Gia Lai, Cúc Hữu Lũng-Lạng Sơn, Cúc Vàng, Đỗ Lạng, Thúa Lá, VX93 và nghiên cứu bằng phương pháp SDS PAGE cho thấy phô điện di protein chịu nhiệt rất đa dạng ở 187
hạt khô và giảm dan trong quá trình nây mầm ở giống M103. Trong quá trình nây mầm, protein chịu nhiệt của các giống đậu tương phân giải với tốc độ khác nhau. Dưới tác động của nhiệt độ 45°C trong thời gian 4, 6, § giờ và 1 ngày, các giống đậu tương khác nhau phản ứng một cách khác nhau, thể hiện rõ qua mức độ duy trì hoặc mất đi của các vạch protein chịu nhiệt ở lô thí nghiệm 8 giờ và 1 ngày: Chúng có thể chia thành 2 nhóm:
+ Hai giống chịu nóng như M103, Ba thang-Don Ca-Chi Lang và
giống chịu hạn lạnh Azưmpa-Gia Lai, Cúc Vàng đều có phổ điện di
protein chịu nhiệt ở lô thí nghiệm Ingày đa đạng về số lượng vạch và
cường độ đậm hơn lô đối chứng:
+ Ngược lại, các giống chịu hạn lạnh Đễ Lạng, Thúa Lá, VX93, Cúc Hữu Lũng-Lạng Sơn đều có phổ điện di PCN ở lô TN Ingày kém da dạng về số lượng và vạch nhạt hơn lô ĐC.
Đặc biệt, protein chịu nhiệt 27,5 kDa không có trong hạt khô, nhưng
xuất hiện đồng thời ở lô thí nghiệm và đối chứng trong quá trình nẩy
mầm ở giống đậu tương chịu nóng M103. Vạch protein chịu nhiệt này cũng có đồng thời với độ đậm tương đương trong cả lô thí nghiệm và đối chứng ở giống đậu tương chịu nóng Ba tháng-Đơn Ca-Chi Lăng, giếng đậu tương chịu hạn Azumpa-GiaLai và lô thí nghiệm, đối chứng 1 ngày ở giống Cúc Vàng. Còn ở các giống chịu hạn lạnh khác, vạch protein này ở lô thí nghiệm xuất hiện với độ đậm khác nhau so với lô đối chứng. Đặc biệt ở giống chịu hạn Thúa Lá, protein 27,5 kDa ở tất cả các lô thí nghiệm đều có độ đậm hơn so với các lô đối chứng.
Để nghiên cứu sâu hơn, phân tích đa dạng sinh học ở mức độ gen trên nhóm Hsp60- -chaperonin giữa các giống đậu tương chịu nóng, chịu hạn đã được tiến hành và trình bay sau day.
4.7.3. Nghién ciru tinh da dang sinh học của gen chaperonin ở đậu tương
Hsp60 (Chaperonin) là chất môi giới phân tử có khối lượng phân tử