VIEN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
2.4.1. Nghiên cứu tính đa dạng của protein hạt các giống đậu tương
2.4.2.3. Sự thủy phân protein hạt trong quá trình nẫy mầm của hạt
, đậu tương
_ Protein dy trữ và các sản phẩm phân giải của chúng trong quá trình nây mâm được dong thời tiến hành nghiên cứu nhằm đánh giá vai trò của các protease. PhO SDS PAGE trên gel 12,5% của protein tách từ hạt giông M103 trong quá trình nây mầm được trình bày trong hình 2.16.
70
Nếu lấy nồng độ dịch chiết lá mầm hạt nảy mầm 11 ngày tuổi là 1 thì độ pha loãng của ngày nây mầm thứ § là 2/3, thứ 6 là 1/2, thứ 4 là 1/3, thứ 2 là 1⁄5 và hạt khô là 1/15 (như vậy địch chiết hạt khô pha loãng 15 lần so với hạt nây mầm 11 ngày tuổi). Kết quả nhận được cho thấy hàm lượng protein dự trữ cũng như các tiểu đơn vị của chúng giảm đi rõ rệt. Sự thay đổi về độ đậm đặc của các tiểu phần phản ánh quy luật thủy phân protein dự trữ trong quá trình nay mam. Cac tiéu don vi a’, a cia B-conglycinin được thủy phân đầu tiên, đến ngày thứ 4 là mắt hắn. Điều đó chứng tỏ tác dong cua serine endopeptidase C1- enzyme đóng vai trò quan trọng nhất trong việc thủy phân các tiểu đơn vị của B-conglycinin.
. s
8-conglycinin Sao
Glycinin
0 2 4 6 8 11 ngay
Hinh 2.16: Phé dign di protein trong hat tiềm sinh và hat nay mam cac ngay 2, 4,6, 8, 11 của giống M103. A- Các tiểu đơn vị có tính acid của glycinin. B- Các tiểu đơn vị có tính kiềm cua glycinin (Tran Thị Phương Liên eí al., 1997).
Các tiểu đơn vị có tính acid A¡ dén As cha glycinin cũng bắt đầu thủy phân từ ngày đầu với tốc độ lớn dân, đến ngày nẫy mầm thứ 6 thì bị phân hủy hết. Đồng thời vào ngày 4 xuất hiện các vạch có khối lượng phân tử là 31,63 kDa; 25,1 kDa; 23,7 kDa. Các ngày tiếp theo xuất hiện thêm các vạch 29,5 kDa; 27,6 kDa; 19 kDa; 12,3 kDa; 11,7 kDa.
Các tiêu đơn vị B của B-conglycinin và các tiểu đơn vị có tính kiềm B; đến Ba bị thủy phân sau cùng: bắt đầu từ ngày nây mầm thứ 4. Tiểu 71
phần B của B-conglycinin phân hủy hết vào ngày nây mam thứ 8. Các
tiểu phần có tính kiểm phân hủy chậm hơn. Ngày nây mầm thứ 11 vẫn
còn nhiều sản phẩm trung gian chưa bị phân hủy hết.
Kết quả nhận được cho thấy quá trình phân hủy protein dự trữ theo
quy luật chặt chế với 2 cơ chế "khóa kéo" và thứ tự lần lượt. Để khởi đầu
quá trình thủy phân protein dự trữ trong hạt, một số endopeptidase giữ vai trò chủ chốt, chúng thủy phân hạn chế một vài mối liên kết trên bẻ mặt phân tử globulin. Chúng phá vỡ cấu trúc không gian làm các chuỗi peptide duỗi ra, tạo điều kiện cho hàng loạt protease khác tham gia vào quá trình thủy phân. Kết quả cuối cùng là tạo thành các peptide có khối lượng phân tử nhỏ và các amino acid. Serine endopeptidase C1 phan huy những mối liên kết đầu tiên của B-conglycinin. Sy phân hủy B-conglycinin tạo thành các sản phẩm trung gian của tiểu đơn vị œ là 74 kDa; 55 kDa; 50 kDa; tiểu đơn vị œ là 65 kDa; 53,5 kDa và 48 kDa trong những ngày đầu tiên. Protease P34 được hoạt hóa, tạo thành P32 có hoạt tính enzyme, thủy phân hạn chế các globulin dau tuong. Protein dy
trữ bị thủy phân tạo thành sản phẩm với phân tử lượng nhỏ dần. Nếu sự thủy phân mang tính chất tùy tiện thì sản phẩm sẽ cho phô điện di là một
vệt kéo dài,
Protease trong hạt đậu tương được nhiều tác giả trên thế giới nghiên
ctu nhu Becker ef al., 1997; Kalinski et al., 1992; Qi et al., 1994; con su phân giải protein - nhu Shutov et al., 1996, Mũntz ef al., 2003.
Sau khi khảo sát hoạt độ và thành phần protease của giống đậu tương chịu nóng M103 (tạo bằng phương pháp đột biến), có một số kết luận như sau:
- Hoạt độ của protease trong hạt nây mầm đạt đỉnh cao vào ngày nây mâm thứ 7.
- Pho điện di hoạt tinh protease chiét từ hạt nây mầm rất đa đạng, tăng dân từ ngày nay mam thir 2 dén thứ 6. Trong đó, các protease có 3
nhóm chính: nhóm khếi lượng phân tử cao, khối lượng phân tử trung bình, khối lượng phân từ nhỏ. Nhóm khối lượng phân tử trung bình là đa
72
dạng nhất. Phổ điện di của ngày nẫy mầm đầu tiên và ngày thứ 7 có đầy đủ các thành phân protease. Vì vậy, có thể chọn để nghiên cứu so sánh giữa các giống khác nhau.
- Sự thủy phân protein dự trữ trong quá trình nay mam tạo thành các sản phâm tương ứng với các vạch có khối lượng phân tử thấp dần theo
thứ tự nhất định.
- Protease của giống M103 với thành phần và hoạt độ như trên đặc trưng cho đậu tương và hoàn toàn đảm bảo cho sự phát triển bình thường, ổn định của giống.
Tóm tắt
Protein thực vật được quan tâm đến nhất là protein hạt - thành phan quan trong trong nguồn lương thực của nhân loại. Hàng năm trên toàn cầu, loài người sử dụng hàng triệu tấn lương thực. Sản xuất lượng thực không đồng đều, tập trung tại những vùng nhất định, nạn đói vẫn hoàng hành ở một số nước châu Phi và châu Á. Việc tạo ra các giống cây lương thực có chất lượng năng xuất cao, việc kết hợp sử dụng có hiệu quả các loại hạt cây lương thực, việc vận chuyển, dự trữ lượng thực vẫn đạt chất lượng tốt luôn là vấn đề cấp bách đối với từng quốc gia, đòi hỏi các nhà khoa học không chỉ nghiên cứu sâu về hàm lượng, thành phần và cấu trúc của các protein hạt các cây ngũ cốc, cây họ đậu nói riêng và các cây trồng nói chung, mà còn đi sâu vào các cơ chế phân tử chuyển hóa, dự trữ và phân giải protein cũng như các chất khác (carbohydrat, lipid...) trong hạt. Protein dự trữ của mỗi loại cây trồng đều có thành phần amino acid đặc trưng riêng, vì vậy, việc kết hợp sử dụng các loại hạt khác nhau để làm tăng giá trị dinh dưỡng cho thức ăn là vấn để khoa học. Việc phân lập hàng loạt các gen mã hóa protein dự trữ, biểu hiện chúng trong các hệ biểu hiện khác nhau, tỉnh sạch protein, nghiên cứu cấu trúc 3 chiều cho phép dự đoán khả năng dự trữ protein ở lượng lớn, tìm hiểu về cơ chế dự trữ và bảo vệ tế bào trong các điều kiện stress cũng như trong việc sử dụng công nghệ gen để cải tiến chất lượng hạt. Tuy vậy, cần lưư ý đến những khó khăn trong việc ứng dụng công nghệ gen trong lĩnh vực này:
protein dự trữ là sản phẩm đa gen, có chứa intron trong cấu trúc của gen, 73
hơn nữa, quá trình thuần thục đòi hỏi vi xử lý các tiền chất protein đều rất phức tạp. Kết quả nghiên cứu cải thiện chất luợng hạt bằng công nghệ gen còn hạn chế.
74