3.8.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của áp suất thâm thấu cao lên quá trình nẫy mầm của hạt đậu tương
Để nghiên cứu ảnh hưởng của áp suất thâm thấu cao lên protease trong qua trinh nay mầm, hat dugc ndy mam trong điều kiện thâm âm bằng dung dịch đường sucrose 10,8% (tương đương 9 at) trong 6 ngày, sau đó, rửa sạch và để nây mắm tiếp ở điều kiện bình thường. Áp suất thẩm thấu cao trong môi trường cạnh tranh nước với tế bào hạt, làm cho hạt không hút được nước, tạo ra sự thiếu nước trong tế bào. Hạt 7 ngày tuổi được sử dụng để tách chiết protease và protein. Phổ điện di hoạt tính protease hạt nảy mam 7 ngày tuổi (hình 3.10 A) cho thấy các vạch protease thuộc nhóm khối lượng phân tử trung bình và thấp (30-56 kDa) rất rõ, nhóm khối lượng phân tử cao nhận thấy yêu hơn. Áp suất thâm thấu cao trong môi trường ức chế mạnh hoạt động của các protease trong quá trình nây mầm nhất là đối với nhóm có khối lượng phân tử cao, hầu như ức chế hoàn toàn (hình 3.10 B).
Phổ SDS PAGE trên gel 12,5% của protein hạt nây mầm 7 ngày tuổi ở lô thí nghiệm có xử lý áp suất thẩm thấu cao so với đối chứng được trình bày trên hình 3.11. Sự phân hủy protein trong trường hợp này hầu như không xảy ra. Tất cả các vạch của các tiểu phần cua glycinin ya B-conglycinin khéng thay đổi. So với phô điện di của protein hạt tiềm sinh, sự phân hủy nhận thấy chủ yếu là sự xuất hiện các vạch nhỏ có 119
phân tử lượng 50-66 kDa và các vạch có khối lượng phân tử thấp (dưới 20 kDa). So với 3 giống MVI, M103, ĐT93; các giống Cúc Vàng, Trà
Lĩnh, VX92 có tốc độ thủy phân nhanh hơn.
A
C
Trà Lĩnh Cúc Vàng Z—x#—ơ
] 27 3 4 3 6
B
Khả năng hồi phục
TN
Hình 3.10: Phổ điện di hoạt tính protease tir hat nay mam 7 ngay ở điều kiện áp suất thâm thấu (Sat) TN (B); và đối chứng ĐC (A) của các giống đậu tương: I- VX92; +MVI, 3-M103; 4-Trà Lĩnh; 5-Cúc Vàng. C- Khả năng phục hồi sau 3 ngày về điều kiện bình thường (Trần Thị Phương Liên et al., 2003).
Nghiên cứu sự hồi phục của hạt được tiến hành với nhiều nồng độ sucrose khác nhau: 3%, 5%, 7%, 9%; 10% và thời gian tác động khác nhau: 3, 4, 5, 6 ngày. Khả năng hồi phục của các giống rất khác nhau.
Những giếng có khả năng hồi phục cao nhất là Trà Lĩnh và Cúc Vàng ở nồng độ sucrose 7-9%. Sau đó giống ĐT93 và VX92 khả năng hồi phục ở nồng độ sucrose 3%, giống, M103 va MVI kém nhất 3-5%, Những hạt hồi phục sau 3 ngày (ngày nây mầm thứ 10) của Cúc Vàng và Trà Lĩnh
120
được đưa ra nghiên cứu. Phổ điện di protease một số mẫu đặc trưng được trình bày trên hình 3.10 C. Trong đó mẫu số 4° phục hồi kém nhất: trên điện di chỉ có 1 vạch protease. Còn mẫu số 2” và 6° phục hồi tốt nhất.
Trong các nhóm enzyme, nhóm enzyme có khối lượng phân tử trung bình được phục hôi tốt nhất.
A kDa
94 67 43 30 20 14,4
Hình 3.11: Phổ điện di protein hạt đậu tương trên SDS PAGE 12,5%: A. Phd
điện di protein hat nay mắm 7 ngày tuổi ở điều kiện áp suất thắm thấu cao. B.
Phổ điện di protein hạt nây mầm 7 ngày tuổi trong điều kiện bình thường của các giống đậu tương: 1-VX92; 2-MVI; 3-M103; 4-PT93; 5-Tra Linh; 6-Cuc Vang (Tran Thi Phuong Lién er al., 2003).
Ap suat thẩm thấu cao trong môi trường có ảnh hưởng rất rõ lên hoạt tính và thành phần protease. Điều kiện này ức chế rất mạnh hoạt độ
ca cdc enzyme. Nước là môi trường để tất cả các phản ứng trao đổi chất của tế bào có thể thực hiện được. Sự thấm 4m hat lúc ban đầu bat đầu hoạt hóa các quá trình sống chuyển hạt từ trạng thái ngủ nghỉ sang nây mim. Nhung sự thiếu nước đã đình trệ tất cả các quá trình. Một số
enzyme ở dạng tiền chất được hoạt hóa tạo nên phổ điện đi rất yếu của lá mầm. Đó cũng chính là cơ sở ban đầu tạo nên khả năng hồi phục sau này.
Một phần các enzyme khác ở dạng tiền chất chưa kịp hoạt hóa, vẫn ở trong dạng phức hệ với các chất ức chế, các chất bảo vệ, vẫn bảo toàn
121
được khả năng hồi phục. Cần. phải nhắn mạnh rằng sự hoạt hóa các protease và thủy phân protein trong quá trình nây mầm chỉ là một khía cạnh trong hoạt động sống của tế bào. Khi hạt đã hỗồi phục và có khả năng tạo rễ dai 2-3 cm thì mọi quá trình sống được hỏi phục lại. Trong đó, bao gồm sự sinh tổng hợp các chất mang thông tin di truyền, các chất hormon sinh trưởng, các protein tạo khung tế bào, màng và thành tế bào... đảm bảo cho sự phân bào ôn định đúng nhịp độ sống của quá trình nay mam.
Như vậy, áp suất thẩm thấu cao trong môi trường có ảnh hưởng lên hoạt độ và thành phần protease cũng như khả năng phân hủy protein dự trữ của chúng trong quá trình nẫy mầm của hạt các giống đậu tương với khả năng chịu hạn khác nhau. Xử lý áp suất thẩm thấu cao trong 7 ngày đã ức chế tất cả các loại protese, nhất là nhóm có khối lượng phân tử cao, nhưng không nhận thấy rõ sự khác biệt về mức độ giữa các giống. Sự phục hồi khả năng nây mầm ở các giống Cúc Vàng và Trà Lĩnh chứng tỏ khả năng chống chịu thiếu nước của các giống này. Sự hồi phục khả năng nay mam trong diéu kiện á áp suất thẩm thấu cao được một số tác giả đã sử dụng để sơ bộ chọn giống chịu hạn. Trong quá trình trên, các chất đặc hiệu bảo vệ tế bào giữ vai trò quan trọng. Đó là các nhóm protein môi giới phân tứ, Hsp, protein LEA...
Qua kết quả nhận được có thê sơ bộ kết luận như sau:
- Áp suất thâm thấu cao ảnh hưởng rõ rệt tới thành phần và hoạt độ
protease, kìm hãm sự thủy phân protein dự trữ. Sự hồi phục khả năng nây mầm của hạt các giống Cúc Vàng, Trà Lĩnh, chứng tỏ khả năng chống chịu mất nước của chúng.
- Khả năng phục hồi của giống Cúc Vàng và Trà Lĩnh do tác động tổng thể của nhiều yếu tố. Trong số đó cho "phép chúng ta dự đoán về chức năng của các chất bảo vệ tế bào, tạo và ôn định cầu trúc không gian đúng cho protein. Đó là các protein môi giới phân tử, Hsp và protein LEA.
122
3.8.2. Nghiên cứu tính đa đạng sinh học gen dehydrin đậu tương Đehydrin là một họ bao gồm nhiều loại protein được biểu hiện trong những điều kiện nóng, lạnh, hạn và muối cao. Dehydrin còn được gọi là protein D11-thuộc nhóm protein LEA - protein tông hợp với số lượng lớn trong cuối quá trình hình thành phôi. Khi có hiện tượng mất nước trong hạt, mRNA của chúng xuất hiện với lượng lớn. Mức độ phiên mã của gen LEA được điều khiển bởi ABA, độ mắt nước của tế bào và áp suất thâm thấu trong tế bào. Dựa vào các điều kiện để phát hiện ra các dehydrin khác nhau, chúng được gọi là dehydrin - DHN (mất nước) hay RAB.
Nhìn chung, dehydrin đặc trưng bởi hàm lượng glycine cao và một số vùng bảo thủ như Y, K, §. Vùng K — chứa trình tự 15 amino acid giàu lysine EKKGIMDKIKEKLPG va cé kha nang tạo xoắn œ. Ngoài ra, còn có đoạn Y (DEYGNP) ở đầu C, đoạn S gắn với gốc phosphoryl và đoạn
® giàu amino acid phân cực. Dehydrin được phân thành 5 nhóm theo các dạng cầu trúc phân tử protein: YaSK;, Kạ, SK¡, Kạ§S và YK. Dehydrin được dự đoán có chức năng bảo vệ các phức đại phân tử trong tế bào.
3.8.2.1. Tách chiết DNA từ một số loài thực vật
Trong nghiên cứu phân lập gen từ thực vật, một trong những điều kiện tiên quyết là chất lượng DNA. DNA còn nguyên vẹn, không bi gay đứt. DNA sạch không có các tạp chất như protein, lipid, polysaccharide, các hợp chất có chứa nhân phenol và các hợp chất thứ cấp khác... . Nhiều phương pháp tách chiết DNA từ thực vật được tiễn hành nghiên cứu và hoàn thiện trên các đối tượng thực vật khác nhau (Muray & Thompson, 1980, Keim et al., 1988, Stewart & Vie, 1993, Becker ef al., 1995, Angelaes et al., 2005, Zuccarello et al., 2006) str dung proteinase K, SDS, CTAB, PEG, PVP..
Phương pháp
Phương pháp tách chiết DNA tổng số sử dụng proteinase K va SDS theo Becker và cộng sự (1995). Mam hai ngay tuổi các giống đậu tương được tách riêng, n nghiền trong nitơ lỏng. Dé chiét DNA genome, 0,5 g mam được xử lý bằng 5 ml dung dịch đệm có chứa Tris HCI (pH 8) 10 123
mM, EDTA (pH 8) 10 mM, NaCl 100 mM và 2,1% SDS, sau đó, cho thêm 50 ul proteinase K (25 mg/ml) va ủ ở 56°C trong 1 gid. Tiếp theo, cho thém vao 1 ml NaCl 6M để 15 phút ở nhiệt độ phòng và ly tâm 12 000 vòng/ phút. Dịch ly tâm được tách ra tủa bằng một phần mười thể tích Na-acetate 3M và ba thể tích ethanol & —20°C trong 2 giờ. Sau đó,
rita lai 2 lan bang ethanol 70% . Cặn thu được làm khô ở điều kiện chân
không và hòa vào 200 ml TE.
Phương pháp tách chiết DNA tổng số sử dụng CTAB tiến hành theo
Keim e¿ a., 1988. Lá non hoặc mầm các giống đậu tương được nghiền trong nitơ lỏng. Khoảng 0,5 g mẫu thực vật được chiết trong 3 mÌ dung dich dém co chtra Tris-HCl 50 mM (pH 8); NaCl 0,7 mM; EDTA 50 mM; 0.1% B-mercaptoethanol and 1% CTAB va t 6 60°C-65°C _ trong it