Chương 2 TỔNG QUAN VỀ MICROARRAY
3. Nguyên tắc hoạt động của DNA microarray như thế nào?
3.4. Sử dụng DNA microarray phân tích sự biểu hiện của gen
Để phân tích sự biểu hiện của gen, các nucleic acids mà kết hợp tương thích với các mRNA để định lượng được thể hiện trên bề mặt các array. Nói chung, nó không hữu ích trong trường hợp lai trực tiếp mRNS từ các mô phẩm cần khảo sát, cũng như hệ thống phát hiện không hiệu quả trong các trường hợp mà các acid nucleic chưa được tiến hành đánh dấu. Do vậy, các mRNA thông thường được chuyển đổi thành cDNA nhờ phản ứng reverse transcriptase. Bên cạnh đó, bởi hiệu quả chuyển đổi thành cDNA không cao và lượng nguyên liệu mRNA ban đầu lại không đủ lượng lớn để tiến hành (ví dụ như là các mRNA của các mẫu bệnh phẩm sinh thiết, hay là các mẫu phẩm máu), lượng các cDNA thu nhận được sẽ tiến hành khuếch đại chúng. Tuy nhiên, việc này khá quan trọng và trong việc lựa chọn một phương pháp sao cho có thể tránh khỏi tỷ lệ các mẫu acid nucleic bị thay đổi. Trong trường hợp này, hai kỹ thuật được sử dụng một cách rộng rãi là phương pháp PCR với số chu kỳ thấp hay là việc phiên mã in vitro. Trong trường hợp phiên mã in vitro, một promotor cho RNA polymerase được gắn chèn vào chuỗi cDNA thông qua quá trình chuyển đổi reverse transcriptase từ mẫu mRNA của mẫu bệnh phẩm hay mẫu thí nghiệm. Sau đó, cDNA được tiến hành khuếch đại bởi một yếu tố bởi RNA polymerase. Thông suốt quá trình phiên mãin vitro, các phân tử RNA thông thường đều được tiến hành đánh dấu huỳnh quang. Tuy nhiên, nếu lượng RNA không bị hạn chế trong thí nghiệm, các cDNA đã được đánh dấu có thể được sử dụng trực tiếp cho phép lai phân tử trên phiến microarray. Một vài các quy trình biến đổi cho việc khuếch đại của các mẫu RNA hay là cho việc làm gia tăng cường độ tín hiệu biểu hiện đã được miêu tả (Ivashuta và cs, 2002; Karsten và cs, 2002; Mahadevappa
& Warrington,1999; Nallur và cs, 2001; Pabón và cs, 2001; Phillips & Eberwine, 1996; Stears và cs, 2000; Wang và cs, 2000a; Zhumabayeva và cs, 2001).
Hai quy trình biểu hiện thông thường mà có giá trị trong việc đánh giá sự biểu hiện các gen và trong việc đánh giá sự khác nhau trong sự biểu hiện của gen giữa các mẫu (hình 4.1A và 4.1B). Trong quy trình đầu tiên, các nucleic acid đã được đánh dấu thu nhận từ hai nguồn mẫu khác nhau để so sánh được tiến hành lai trên hai phiến array khác biệt nhau. Trong trường hợp để tiêu chuẩn hóa các cường độ tín hiệu của các tín hiệu gen riêng lẻ thì các phương pháp tiêu chuẩn hóa và phương pháp phân tích thống kê được sử dụng một cách rộng rãi để giải quyết.
Thông thường các gen giữ nhà có một tỷ lệ biểu hiện ổn định có thể ứng dụng làm tiêu chuẩn (đối với các trường hợp liên quan đến các vấn đề của việc sử dụng các gen
giữ nhà, xem lại chương 1). Thay vào đó, giá trị cường độ tín hiệu của sự biểu hiện được đánh giá và sử dụng cho việc tiêu chuẩn hóa tín hiệu sau này. Một vài các phương pháp đã được phát triển cho việc tiêu chuẩn hóa, định chuẩn dụng cụ, tính phương sai, định lượng, và phân tích thông kê. (Alter và cs, 2000; Baldi & Long, 2001; Beissbarth và cs, 2000; Brazma và cs, 2001; Brown và cs, 2001; Chudin và cs, 2002; Claverie, 1999; Draghici và cs, 2001; Eickhoff và cs, 1999; Herwig và cs, 2001;
Hill và cs, 2001; Ideker và cs, 2000; Kadota và cs, 2001; Kerr & Churchill, 2001; Kerr và cs, 2000; Lee và cs, 2000; Li & Wong, 2001; Long và cs, 2001; Manduchi và cs, 2000; Mutch và cs, 2001; Naef và cs, 2002; Newton và cs, 2001; Quackenbush, 2001;
Rifkin và cs, 2000; Rocke & Durbin, 2001; Schadt và cs, 2000 and 2001;
Schuchhardt và cs, 2000; Thomas và cs, 2001; Troyanskaya và cs, 2001; Tseng và cs, 2001; Tsodikov và cs, 2002; Tusher et al; 2001; Wang và cs, 2001a; Yang và cs, 2001 and 2002; Yuen và cs, 2002; Zhang & Zhao, 2000; Zien và cs, 2001).
Quy trình thứ hai cho việc so sánh sự biểu hiện các gen liên đòi hỏi thiết lập trên một phiến array cho cả hai mẫu thí nghiệm. Trong trường hợp này, cả hai mẫu được đánh dấu bởi các chất khác nhau, thông thường là hai chất huỳnh quang khác nhau, ví dụ như chất Cy3 (IUPAC name of the water-soluble cyanine dye: 2- [(1E,3E)-5-(1-{6-[2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl)oxy]-6-oxohexyl}-3,3-dimethyl-5-sulfo- 1,3-hihydro-2H-indol-2-ylidene)-1,3-propadienyl]-1-ethyl-3,3-dimethyl-3H-
indolium-5-sulphonate) với bước sóng hấp thụ là 552 nanomet và bước sóng phản xạ là 568 nm, và chất huỳnh quang thứ hai là Cy5 (IUPAC name of the water- soluble cyanine dye: 2-[(1E,3E)-5-(1-{6-[2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl)oxy]-6- oxohexyl}-3,3-dimethyl-5-sulfo-1,3-dihydro-2H-indol-2-ylidene)-1,3-pentadienyl]- 1-ethyl-3,3-dimethyl-3H-indolium-5-sulphonate) với bước sóng hấp thụ là 650 nanomet và bước sóng phản xạ là 667 nm. Quá trình lai trên microarray được tiến hành với một tỷ lệ các mẫu acid nucleic đã được đánh dấu với tỷ lệ 1:1. Các gen với các mức độ biểu hiện được xác định bởi các màu khác nhau, trong khi đó các gen được biểu hiện với một tỷ lệ khác nhau với sự biểu hiện của chất huỳnh quang này khác mạnh hơn so với chất huỳnh quang còn lại.
Quy trình được miêu tả trên được thực hiện thông dụng nhất cho các microarray bao gồm các sản phẩm PCR hay các plasmid, quá trình tiến hành đơn giản là một lợi thế của phương pháp này. Tuy nhiên, tính không đồng nhất của động học phép lai trong hỗn hợp chứa một sự khác biệt giữa các phân tử nucleic khác nhau sẽ gây nhiều khó khăn trong việc lai, các lý do có thể gây khó khăn trong việc lai như là nhiệt độ phòng và nồng độ các muối là một vấn đề khá quan trọng đối với các phân tử. Kết quả là sự không đặc hiệu hoặc lai không hoàn toàn có thể xảy ra dẫn đến kết quả không chính xác. Ngoài ra, các nucleic acid được gắn kết trong chất nền với một nồng độ tự do, có thể dẫn đến ảnh hưởng kết quả lai với các mẫu DNA.
Một trong những giải pháp cho việc sử dụng các olionucleic microarray bao gồm các mẫu dò nucleic acid trong khoảng phạm vi từ 15 đến 25 bases (thông
thường có thể 60 bases). Công ty Affymetrix (Santa Clara,San Diego, USA) đã phát triển giải pháp ưu việt. Trong khoảng giai đoạn này, các microarray sử dụng 11 đến 25-mer oligonucleotides cho mỗi mRNA. Các oligonucleotides trên microarray bổ sung chính xác các đoạn khác nhau với vùng 3’ không mã hóa của mRNA và do đó được gọi là các oligomucleotides kết hợp hoàn hảo (hình 4.2). Từ nhiệt độ nóng chảy của việc lai các oligonucleotide trên microarray mẫu DNA có thể xác định được dựa trên các đoạn cơ bản, các đoạn oligonucleotide với các đặc điểm lai tốt nhất có thể được chọn lọc dựa trên các đoạn mRNA của gen mà sự biểu hiện được nghiên cứu. Do đó, ngay cả việc lai các oligonucleotide kém hay không hiệu quả, những vẫn đủ cho việc phân tích kết quả một cách chính xác. Trong mẫu đối chứng âm để có sự kết hợp bổ sung các oligonucleotide, công ty Affymetrix thiết kế microarray cũng chứa đựng các một lượng các mismatch của oligonucleotide như nhau khác biệt so với các chuỗi kết hợp hoàn hảo bởi sự hiện diện của một mismatch base trong vùng trung tâm của oligonucleotide. Lý tưởng hơn, ở đây không xảy ra hiện tượng lai dưới những điều kiện bình thường đối với các mismatch oligonucleotide do đó các tín hiệu được thu nhận từ các phép lai không chuyên biệt. Những sự khác biệt trong các cường độ tín hiệu giữa các match hoàn hảo và mismatch của các oligonucleotide cho phép đánh giá sự kết hợp không chuyên biệt. Một thuật toán được ứng dụng cho việc tính toán cường độ chính xác cho các match oligonucleotide được tiến hành so sánh với cường độ biểu hiện trong phiến array thứ hai khác với những mẫu dò khác. Sự khác cuối cuối cùng trong một lượng các lớn mRNA giữa kết quả của hai mẫu từ sự tích hợp các kết quả của việc so sánh tất cả các điểm match của oligonucleotide biểu hiện (Hình 4.3). Kỹ thuật được ứng dụng cho việc sản xuất các microarray nêu trên được miêu tả ở phần dưới.
Trước một công nghệ kỹ thuật hữu ích, đọc giả cần thiết phải nhận thức được những điểm khó khăn của microarray trong việc thiết kế phân tích sự biểu hiện của gen.
Hình 4.1 Hai ví dụ cho việc phân tích sử biểu hiện gen dựa trên việc sử dụng DNA microarray.
Hình A. DNA microarray sử dụng hệ thống phát hiện hai màu. Hai mẫu RNA (được đánh dấu hoặc là Cy3TMhay Cy5TM) được trộn lẫn với nhau và tiến hành lai
cung cấp bởi TS. Patrick O. Brown (Trường Đại học Stanford, California, USA).
Hình B, Human Genome U95A array (Affymetrix, Inc., Santa Clara, San Diego, UAS) được tiến hành lai với cRNA được đánh dấu bằng biotin (phát hiện sau khi tiến hành ủ hai lần với streptavidin-bound phycoerythrin) thu nhận từ dòng tế bào
monocyte của người THP-1. Phiến array chứa đựng hơn 12,000 mẫu dò dùng để ứng dụng biểu hiện gen người.
Hình 4.2 Phân tích biểu hiện với một cường cao bằng oligonucleotide array (Affymetrix, Inc., Santa Clara, California, USA) sử dụng hệ thống perfect match/
mismatch. Một vài vùng của mRNA được biểu hiện trên bề mặt của array như 25 mers (mẫu perfect match). Mismatch oligonucleotides khác với perfect oligonucleotide bởi các thay đổi của các base trong trung tâm của oligonucleotide. So sánh cường độ tín hiệu giữa các mẫu dò perfect match và mismatch được sử dụng có quyết định đến tính chuyên biệt của kết hợp. Vùng 1 cho thấy 1 ví dụ mà mẫu được tiến hành lai với perfect match và mismatch; vùng này được loại trừ khi tiến hành tính toán. Tương tử, vùng 3 không được đánh giá bởi vì các mẫu lai với perfect match và mismatch với một cường độ biểu hiện như nhau cho thấy không có tính chuyên biệt trong phép lai. Tất cả những vùng còn lại khác được tiến hành đánh giá cho thấy tính chuyên biệt trong phép lai phân tử và là đối tượng của phép phân tích.
Hình 4.3. Chi tiết hình ảnh của oligomicroarray được lai với các mẫu cRNA chuyển đổi từ các mRNA từ việc nuôi cấy nấm mem. Các tế bào nấm mem được tiến hành nuôi trong môi trường giàu dinh dưỡng và nghèo dinh dưỡng, ở nhiệt độ 30oC. Vùng được
đánh dấu [ ] cho thấy có sự xuất hiện của perfect match và mismatch oligonucleotide mà biểu hiện sự xuất hiện của các RNAs với các cường độ biểu hiện khác nhau trong hai môi trường nuôi cấy (Affymetrix, Inc., Santa Clara, California, USA).