PHÂN TÍCH CHỨC NĂNG BỘ GENE
Chương 6 Phân tích Microarray và ứng dụng phân loại khối u
1.1. Thu nhận, chuyển đổi tín hiệu và tái hiện lại thông tin
Kỹ thuật microarray sử dụng các mẫu dò chuyên biệt với gen để tái biểu hiện thông tin của hàng ngàn các gen riêng lẻ khác nhau. Các mẫu dò được gắn lên trên một bề mặt phẳng trơ, và sau đó tiến hành tái hiện lại thông tin của các gen trong mẫu sinh học thu nhận được (hình 1). RNA được tách chiết từ các khối u bệnh nhân và được tiến hành đánh dấu với các marker phát hiện như là các thuốc nhuộm huỳnh quang. Các mẫu mRNA được tiến hành lai với mẫu dò chuyên biệt với gen đó trên phiến array. Các hình ảnh sẽ được thu nhận lại bằng cách sử dụng các tia laser tiến hành quét trên phiến array. Cường độ phát huỳnh quang đối với từng mẫu dò được xem như là thông tin và thước đo để phát hiện ra có sự biểu hiện của gen đặc trưng.
Khi cường độ phát huỳnh quang càng cao thì mức độ biểu hiện các gen các mạnh.
Hình 1. Lai giữa các gen trong microarray
Trung tâm của phép phân tích microarray xem xét cho sự biểu hiện gen là việc tiến hành lai các RNA đã được đánh dấu bằng huỳnh quang với một đoạn cDNA mạch đơn được gắn trên bề mặt như là thủy tinh. Ái lực tự nhiên của hai mẫu DNA bổ sung acid nucleic với nhau có vai trò điều khiển cả phép lai. Các đoạn bổ sung được biểu hiện bằng màu. Ví dụ: các mẫu màu cam sẽ bổ sung với các đoạn màu cam đã được đánh dấu huỳnh quang. Tại vì vị trí và trình tự của mẫu dò đã được biết, phép lai sẽ được thực hiện giữa mẫu dò và các đoạn được đánh dấu cung cấp một assay biểu thị cho mức độ biểu hiện gen
Thông thường có hai phương thức được dùng để thu nhận các dữ liệu trong kỹ thuật microarray. Trong trường hợp two-color array, hai mẫu RNA được tiến hành đánh dấu bằng các thuộc nhuộm khác nhau và tiến hành lai đồng thời trên cùng một bản array (hình 2). Mẫu được quan tâm hay mẫu đang nghi vấn (ví dụ như là một mẫu bệnh phẩm ung thư vú) được tiến hành nhuộm bằng một thuốc nhuộm và mẫu đối chứng được tiến hành nhuộm bằng một thuốc nhuộm khác. Hai mẫu được
hành so sánh các mẫu với nhau, sự biểu hiện của các mẫu tuân theo hàm logarit giữa tỷ lệ các RNA trong mẫu nghi vấn đối với mẫu đối chứng. Trong trường hợp là single-color array, như Genechip (Affymetrix), mỗi mẫu sẽ được tiến hành nhuộm riêng biệt và tiến hành trên thực hiện trên một phiến array (hình 2). Sau đó tiến hành lai và rửa mẫu, sự biểu hiện của từng gen được thể hiện thông qua sự biểu hiện cường độ phát huỳnh quang, từ đó có thể đánh giá mức độ biểu hiện của gen.
Hình 2. Tổng quan về phép phân tích microarray
Trong phép phân tích “two-color” (hình A), mẫu RNA được thu nhận từ bệnh nhân và mẫu đối chứng được tiến hành nhuộm riêng biệt khác nhau và tiến hành lai với duy nhất 1 DNA chứa mẫu dò chuyên biệt với gen. Quan hệ về mức độ biểu hiện của gen trong hai mẫu được đánh giá dựa trên việc so sánh mức độ phát huỳnh quang của mỗi mẫu; một vector biểu hiện mẫu được dùng để kết luận mức độ biểu hiện của từng gen trong mẫu thu nhận từ bệnh nhân (tiến hành so sánh với mẫu đối chứng). Phép phân tích “single-color” (Hình B), được thực hiện với Genechip (Affymetrix), tiến hành lai các RNA được đánh dấu từ mỗi mẫu sinh phẩm trên từng array tiến hành lai với các mẫu dò chuyên biệt. Mức độ biểu hiện gen được đánh giá bằng cách so sánh cường độ lai của một loạt các mẫu dò đã bắt cặp hoàn hảo, backgrou sẽ được tiến hành đánh giá thông qua các mẫu dò không bắt cặp. Mức độ biểu hiện của gen của mỗi mẫu thu nhận từ bệnh nhân được báo cáo với như một vector biểu hiện mẫu mà kết luận dựa trên sự khác biệt giữa tín hiệu và background của từng gen.
Sau khi tiến hành thu nhận mẫu, các dữ liệu thường phải được tiêu chuẩn hóa để dễ dàng so sánh, tìm hiểu những điểm khác nhau giữa các thí nghiệm lai. Hiện nay, có rất nhiều phương pháp được sử dụng cho việc tiêu chuẩn hóa các dữ kiện, tuy nhiên sử dụng phương pháp nào phù hợp cho việc phân tích hoàn toàn phụ thuộc vào mục đích thí nghiệm, kết luận về các dự kiện. Thông thường các dữ kiện cũng phải được tiến hành chọn lọc dựa trên các tiêu chuẩn nhất định (ví dụ như là
các gen có sự khác biệt nhau nhỏ sẽ bị loại) hay là tiến hành phân tích thông kê để lựa chọn các gen có sự biểu hiện với một mức độ cao mà chúng có liên quan đến các nhóm của mẫu xét nghiệm. Việc tiêu chuẩn hóa và chọn lọc phải được ứng dụng một cách thật cẩn trọng, tại vì nó có thể mang đến một số hiệu quả không mong muốn trong kết quả. Sự khác biệt trong các phương pháp phân tích thống kê sẽ cung cấp các kết quả khác nhau trong các gen chuyên biệt (thường là kết quả các gen sẽ gối đầu nhau).
Những lưu ý này sẽ được thực hiện, chú trọng trong suốt quá trình tiến hành phân tích so sánh dữ liệu, các thông tin với nhau ở các phòng thí nghiệm khác nhau.
Có thể dẫn tới các kết quả ttrái ngược nhau, tại vì họ rất ít để ý những khác biệt trong các phương pháp so sánh, phân tích và thống kê các dữ liệu. Những so sánh này chuyển toàn bộ dữ liệu phân tích vào trong một kho dữ liệu, từ những thông tin đó, có thể tìm kiếm sự giống nhau giữa các dạng của microarray. Để tiến hành so sánh các dữ liệu một cách dễ dàng người ta phát triển một tiêu chuẩn chung cho phép phân tích các dữ liệu là “minimal information about a microarray experiment”
(MIAME). Các database của DNA được phát triển và lưu giữ trong ngân hàng DNA để sử dụng cho việc nghiên cứu sự biểu hiện gen. Đây được xem là nguồn dữ liệu quan trọng và có giá trị trong ứng dụng trong việc nghiên cứu biểu hiện gen: các nghiên cứu về cùng một bệnh được tiến hành độc lập với nhau sẽ cung cấp các dữ liệu khách quan và được tiến hành so sánh, đánh giá các kết quả thu nhận được. Khi nghiên cứu một lượng lớn cỡ mẫu có thể cung cấp các dữ liệu quan trọng cho việc nghiên cứu các mẫu bệnh chung, và nghiên cứu việc biểu hiện gen có liên quan đến bệnh hay hậu quả của bệnh.
Sau khi thu thập được các dữ liệu, các dữ liệu đã được tiến hành chọn lọc và tiêu chuẩn hóa, chúng được biểu hiện một cách điển hình trong một ma trận mà mỗi dòng biểu hiện cho một gen chuyên biệt và mỗi cột biểu hiện cho một mẫu sinh học đặc trưng (Hình 3). Mỗi dòng biểu thị cho một vector biệu hiện gen – các ô thể hiện các mức độ biểu hiện gen chuyên biệt trong tất cả các mẫu bệnh phẩm nghiên cứu.
Mỗi cột biểu thị cho một vector biểu hiện mẫu, ghi nhận sự biểu hiện tất cả các gen trong mẫu. Để hiểu một cách dễ dàng các kết quả thu nhận được từ phương pháp lai kết hợp, các yếu tố của dữ liệu trong ma trận thường được biểu hiện với màu đỏ ứng với mức độ biểu hiện gen trong từng mẫu (hình 3) và các vùng quan sát được trên ma trận biểu hiện cho các mẫu đang phân tích. Trong hầu hết các phương pháp, màu sử dụng cho các gen được dựa trên tỷ lệ logarit đối với từng mẫu khi được tiến hành so sánh với mẫu đối chứng; giá trị tỷ lệ log gần như bằng không sẽ được biểu hiện bằng màu đen, giá trị lớn hơn không được biểu hiện bằng màu đỏ (ứng với các điều hòa thượng nguồn), và các giá trị âm tính được biểu hiện bằng màu xanh (ứng với các gen điều hòa hạ nguồn), ngoài ra có thể có nhiều màu khác nhau được phép sử dụng cho trường hợp đối với những người bị mù màu đỏ - xanh (hình 3). Cường độ biểu hiện của các nhân tố được tiến hành so sánh sự biểu hiện các gen có quan hệ
với nhau, các nhân tố có màu sáng biểu hiện cho sự biểu hiện với một mức độ cao.
Chương trình được thực hiện theo các nhóm hàng ngang, hàng dọc hoặc là cả hai, từ đó, có thể xác định được mức độ biểu hiện của các gen khác nhau trong các mẫu bệnh phẩm khác nhau.
Hình 3. Phát triển một ma trận dùng để biểu hiện gen
Các dữ liệu của mọi gen trong từng mẫu được thu nhận, và những vector biểu hiện các mẫu này được ghi nhận lại trong từng ma trận biểu hiện. Mỗi cột là biểu hiện các mẫu riêng biệt và mức độ biểu hiện của nó (vector biểu hiện mẫu), và mỗi dòng biểu hiện cho từng gen với mức độ biểu hiện gen trong tất cả các mẫu (vector biểu hiện gen). Ma trận biểu hiện thường được ghi nhận dưới dạng ma trận màu (điển hình với các màu đỏ, xanh, hoặc là có sự kết hợp với các màu khác nhau). Trong ma trận màu, màu sắc và cường độ biểu hiện của nó được biểu hiện cho mối quan hệ trực tiếp và mức độ quan trọng của sự khác nhau trong sự biểu hiện của gen.