VÀ MỘT SỐ ỨNG DỤNG
3. Một số virus đóng vai trò là vật mang RNAi
3.1.2. Đánh lừa đáp ứng miễn dịch của vật chủ đối với sự chuyển gen adenovirus in vivo
Mặc dầu các vectơ thế hệ thứ nhất tải nạp và biểu hiện gen chuyển với hiệu lực cao, nhưng trong nhiều trường hợp thời gian biểu hiện lại rất ngắn. Làm mất sự biểu hiện cùng với độc tính trực tiếp của vec tơ (Connelly và cs, 1996), sự nhiễm trùng và tác động của các tế bào miễn dịch (Yet và cs, 1994; Yang và cs, 1994, 1995) đều dẫn đến sự hủy hoại tế bào tải nạp. Đặc tính của các tế bào tải nạp với vectơ Av1 là biểu hiện của hầu hết các gen adenovirus giảm nhiều, mức protein virus được biểu hiện thấp (Mettereder và cs 1994; Yang và cs, 1994), những quan sát này đã chứng minh rằng có đáp ứng của lympho T gây độc tế bào (cytotoxyc T lymphocyte –CTL) trực tiếp kháng lại các tế bào biểu hiện các gen chủ chốt của virus, kết cục là loại đi các tế bào đã được công nghệ hóa (Yang và cs, 1994, 1995, 1996). Bởi vậy, giảm bớt hơn nữa sự biểu hiện gen virus có thể làm giảm đáp ứng miễn dịch (ĐUMD) của vật chủ đối với các tế bào tải nạp và làm tăng thời gian biểu hiện gen chuyển. Thật vây, việc phát triển vec tơ adenovirus thề hệ hai Av2 với một protein gắn DNA nhạy cảm với nhiệt 72 kDa mã hóa ở vùng E2a của bộ khung virus sẽ cho phép kéo dài sự biểu hiện ở gan chuột trưởng thành có ĐUMD tốt cũng như giảm đáp ứng CTL (Engelhardt và cs, 1994, Yang và cs, 1994; Ye và cs, 1996).
Tuy nhiên, các phân tích về vec tơ Av2 trong các chuối khác nhau của chuột và chó bị bệnh ưa chảy máu B đã chỉ rõ không có sự khác biệt về thời gian biểu hiện gen chuyển so với vec tơ Av1 (Fang và cs, 1996). Gần đây, người ta đã thiết lập được các vec tơ thế hệ thứ ba - Av3 mất các đoạn E1, E2a và E3 đã nâng cao tiềm năng sao chép DNA của vec tơ và sự biểu hiện của virusin vitromuộn hơn các vec tơ Av1 và Av2 (Gorziglia và cs, 1996). Hơn nữa, cũng đã có các vec tơ adenovirus loại trừ nhiều đoạn trong các vùng E1 và E2 (Armentano và cs, 1995;
Wang và cs, 1995; Gao và cs, 1996; Yeh và cs,1996). Các vec tơ adenovirus thề hệ kế tiếp sẽ có nhiều đoạn loại bỏ quan trọng. Không nghi ngờ gì nữa, trong tương lai sẽ phải phát triển các dòng tế bào bổ sung để cung cấp các sản phẩm gen mất dạng trans. Sau cùng là việc sử dụng các vec tơ adenovirus chỉ chứa các tín hiệu đóng gói adenovirus thiết yếu và hộp biểu hiện gen chuyển (Clemens và cs, 1996; Haecker và cs, 1996; Kochanect và cs 1996; Lieber và cs, 1996). Tuy nhiên, những vec tơ này được phát triển với sự có mặt của các virus trợ giúp.
Nhưng thật khó mà tạo được một dòng tế bào đóng gói với đầy đủ các chức năng bổ trợ virus, vì nếu được như vậy thì các sản phẩm của vec tơ sẽ không chứa các tạp chất từ virus trợ giúp. Những vec tơ virus “nhút nhát” sẽ có tiềm năng giảm thiểu độc tính tế bào và các ĐUMD tế bào cũng như thích ứng được với các đoạn DNA ngoại sinh lớn (trên 35 kb).
Phương pháp khác để làm giảm bớt ĐUMD tế bào đối với các tế bào tải nạp adenovirus nhưng vẫn duy trì biểu hiện gen chuyển là sử dụng các tác nhân kiềm chế miễn dịch như cyclosporin A (Fang và cs, 1995), FK506 (Lochmüller và cs 1995, 1996; Vilquin và cs, 1995) và cyclophosphamide (Joose và cs, 1996). Tuy nhiên, kéo dài việc sử dụng các chất kiềm chế miễn dịch có thể sẽ làm tăng cảm ứng các tác dụng phụ nghiêm trọng. Nhờ việc thay đổi các thuốc kiềm chế miễn dịch, các kháng thể đơn dòng kháng trực tiếp các protein trong tế bào T hoạt hóa nên đã làm giảm ĐUMD qua trung gian tế bào (Kay và cs, 1995; Guerette và cs, 1996;
Yang và cs, 1996). Vì thế, việc sử dụng các vec tơ adenovirus cải tiến với việc làm mất nhiều đoạn các gen chủ chốt của virus kết hợp với chế độ kiềm chế miễn dịch đã thiết kế được các khối tế bào mà tính miễn dịch qua trung gian tế bào đã cho phép kéo dài hơn sự biểu hiện gen chuyển.
Một hạn chế khác liên quan tới miễn dịch qua trung gian vật chủ đối với việc sử dụng các vectơ adenovirus là nếu các vec tơ được dùng lặp đi lặp lại thì sẽ không thu được kết quả vì có ĐUMD thể dịch đối với protein capsid của virus (Smith và cs, 1993; Kay và cs 1994; Kozasky và cs 1994; Yei và cs 1994). Nói chung, bản chất của sự biểu hiện gen chuyển qua trung gian vec tơ adenovirus đòi hỏi phải có nhiều vectơ đặc hiệu đối với các bệnh mãn tính như bênh xơ nang và bệnh ưa chảy máu – vì những bệnh này phải điều trị kéo dài. Các nghiên cứu của Smith và cs (1996) đã chứng minh rằng ĐUMD đối với vec tơ adenovirus còn phụ thuộc vào liều lượng và có thể được điều chỉnh ngay từ thời điểm khởi đầu bởi sự kiềm chế miễn dịch tức thời với cyclophosphamide hoặc deoxyspergualin (DSG) thì sẽ cho phép sử dụng lặp lại có hiệu quả với các vec tơ này.
Mới đây, người ta đã thành công trong việc trị liệu miễn dịch tổ hợp liều lượng thấp ít nhất với 3 vec tơ adenovirus (T.A.G. Smith). Hơn nữa, lặp lại sự chuyển giao vectơ cũng đã thu được kết quả thông qua chiến lược kiềm chế miễn dịch (Yang và cs, 1995.1996) và bằng cảm ứng dung nạp vec tơ ở chuột sơ sinh (Walter và cs, 1996). Cuối cùng là việc sử dụng các adenovirus từ các serotype khác nhau như adenovirus trung hòa kháng thể, đó là một serotype virus không có phản ứng chéo và ngăn ngừa được sự tải nạp với một adenovirus của một serotype thứ hai (Kass – Eisler, 1996; Mastrangeli và cs, 1996). Tuy nhiên, chiến lược này còn liên quan tới việc chế tạo và đặc tính của các đa vec tơ mã hóa cho các gen mà ta quan tâm.
3.2.Adeno kết hợp với vector virus
AAV (Adeno-associated virus) là một virus nhỏ lây nhiễm cho người và một số loại sinh trưởng khác. AAV có thể lây nhiễm cả tế bào phân chia và không phân chia và không thể kết hợp với bộ gen của tế bào chủ. Những tính năng này của AAV hấp dẫn việc tạo ra một vector cho liệu pháp gen. AVV thuộc họ Parvoviridae. Nó có một bộ gen mạch đơn (4.8kb). Bộ gen chỉ chứa 2 gen và có thể được thay thế bằng các gen ngoại, chỉ cần giữ lại ITRs và hai khung đọc mở để cho phép gen biểu hiện. Giới hạn 5kb của virus này vẫn có thể chứa ít nhất 8 đoạn
shRNA cần biểu hiện. Các trình tự ITR trên trình tự gen của virus có khả năng tạo thành một cấu trúc kẹp tóc, góp phần tạo mồi cho phép primase độc lập tổng hợp gen thứ hai. Các ITR cũng đóng vai trò quan trọng trong việc chèn bộ gen virus vào tế bào chủ. Tuyp 2 huyết thanh được nghiên cứu rộng rãi nhất cho đến nay. Nghiên cứu thấy rằng, AAV2 dường như có thể giết chế tế bào ung thư mà không làm tổn hại đến các tế bào lân cận. Kiểu hình hoang dại AAV có ái lực mạnh với một vùng đặc biệt trên nhiễm sắc thể 19, hiện nay AAV tái tổ hợp được thiết kế để vô hiệu quả trong việc xâm nhập vì nó thiếu protein RepAAV.
Trái ngược với adenovirus, pseudotyping (là quá trình kết hợp virus với vỏ protein khác giúp virus dễ xâm nhập vào tế bào chủ) của AAV cho phép quá trình xâm nhập dễ xảy ra. Do đó, nó mang các shRNA vào các mô hoặc tế bào chuyên biệt rất dễ dàng. Hơn nữa, AAV vector chỉ gây ra một đáp ứng miễn dịch thấp.
Đến nay, một số báo cáo đã mô tả sự phát triển của AAV vector vật mang và sự biểu hiện các gen kháng khối u trong những mô hình động vật nhỏ. Một nghiên cứu khác khám phá sự biểu hiện của AAV mang shRNA chống lại Hec1 (một loại protein xuất hiện cao trong ung thư). Lặp đi lặp lại quá trình còn thấy nó có khả năng làm tế bào ung thư không thể tăng sinh và xuất hiện những thể apoptotic trong khối u. Một nghiên cứu gần đây liên quan đến shRNA trung gian có sự điều hòa nghịch thụ thể androgen, chống lại ung thư tuyến tiền liệt ở chuột nude.
Cả hai loại virus adenovirus (ADV) và virus kết hợp (AVV) đều không kết hợp vào bộ gen vật chủ, do đó giảm được rủi ro tối thiểu của các đột biến. Đồng thời, điều này có thể đại diện cho một khía cạnh tiêu cực khi thông tin di truyền ít bảo tồn ổn định và có thể bị mất trong quá trình phân bào. Vì vậy, mặc dù những vector này có thể chuyển gen vào cả tế bào phân chia và không phân chia tạo hiệu quả cao trong điều trị nhưng không thể sử dụng chúng để điều trị lâu dài.
3.3.Vector Retrovirus
Việc sử dụng các vector chuyển gen dựa trên retrovirus đã được giới thiệu trong những năm 1980 bởi Mann và cs Virus này có bộ gen là mạch đơn thuộc họ Retroviridae và có thể sao chép qua một mạch DNA đôi trung gian. Chúng chèn bộ gen của mình vào bộ gen của vật chủ, do đó có thể sao chép mãi mãi cùng với tế bào vật chủ. Retroviridae có nhiều phân họ khác nhau từ đơn giản như Gammaretrovirus (ví dụ như MLV) đến phức tạp như Lentivirus (ví dụ như HIV).
Bộ gen của virus này khoảng 10kb có ít nhất 3 gen: gag (mã hóa cho protein lõi), pol (mã hóa sao chép ngược) và env (mã hóa cho protein vỏ virus). Phức hợp retrovirus mã hóa một số protein phụ có liên quan trong việc điều hòa quá trình tăng sinh của virus hoặc tế bào vật chủ phản ứng với virus. Ở mỗi đầu của bộ gen, có một trình tự lặp lại (LTRs) chứa các vùng promotor enhancer và trình tự liên quan đến quá trình xâm nhập. Ngoài ra còn có các trình tự cần thiết để đóng gói các RNA virus (psi Ψ+).
Retrovirus xâm nhập và chèn bộ gen của mình vào bộ gen vật chủ mà không cần tổng hợp protein của virus. Vì thế, tất cả các gen của virus trong vector có thể được thay thế bởi các trình tự khác. Vector được sản xuất bằng cách đóng gói các dòng tế bào cung cấp protein virus. Những tế bào này phóng thích vector bộ gen thành những hạt dễ xâm nhập và hoàn toàn tự do từ dạng virus xâm nhiễm và sao chép virus tái tổ hợp. Do đó, không có protein của virus được sản xuất sau khi chuyển gen, tránh bị ảnh hưởng của virus cũng như làm giảm đáp ứng miễn dịch đào thải các vector và ngăn chặn các bệnh lây lan từ virus.
Khi thoát khỏi tế bào, retrovirus và vector của chúng được bao bọc bởi một lớp phospholipid kép có xuất xứ từ màng tế bào chủ. Protein Env được hình thành do sự hòa nhập giữa màng tế bào và màng virus, kết quả là trong phiên bản của hạt capsid của virus có chứa các vật liệu di truyền và đi vào tế bào chất. Điều này đóng vai trò trung tâm trong việc đưa virus xâm nhập vào tế bào đích.
Thay đổi gen Env hoặc những sản phẩm của nó là một trong những cách có thể thao tác nhiều tế bào đích và gia tăng tính an toàn cho vector. Phương pháp tiếp cận thành công nhất trong kỹ thuật điều trị khối u là kích hoạt protease. Trong hệ thống này virus vẫn không truyền ra cho tới khi Env được kích hoạt thông qua sự phân cắt bởi một protease tiết hoặc protease giới hạn màng. Lựa chọn vật mang đi vào các tế bào khối u kết hợp với chuyển gen kháng gen sinh ung sh/mi/siRNA đang là một chiến lược mới trong điều trị ung thư.
Việc sử dụng vector retrovirus cho hiệu quả chuyển các băng mong muốn vào tế bào đích đã được khai thác nhiều năm nay. Sau đó người ta còn nghiên cứu trên Murine Leukemia Virus (MLV). Một nghiên cứu gần đây đã báo cáo sự ức chế kéo dài khả năng truyền nhiễm HIV-1 trong dòng tế bào T (Molt-4) bởi retroviral (MLV) mang shRNA là một trình tự nằm trong motif ức chế NF-kB của promoter HIV-1. Sự biểu hiện của HIV-1 được ức chế trong 1 năm.
3.4.Vector Lentivirus
Lentivirus (LV) thuộc nhóm retrovirus, bộ gen của nó cũng gồm hai bản sao của một bộ gen RNA chứa trong vỏ bọc capsid. Trong số các loài khác nhau trong chi lentivirinae, nổi bật nhất là virus HIV, loại virus gây suy giảm miễn dịch ở người.
Trái ngược với vector retrovirus đã đề cập trên, vector lentiviral có khả năng chuyển đổi tế bào phân chia và không phân chia (ví dụ như tế bào thần kinh), do đó chúng được ứng dụng nhiều hơn trên tế bào của hệ thần kinh. Vector Lentiviral có thể chứa một lượng lớn DNA (lên đến 7.5kb) và gây đáp ứng miễn dịch thấp hơn vector adenovirus, chúng được sử dụng trong hầu hết các liệu pháp genin vivo. Cấu trúc của vector này phức tạp hơn retrovirus vì nó có thêm 6 thành phần protein tat, rev, vpr, VPU, nef và VIF. Từ khi virus tự nhiên có thể gây ra các bệnh tử vong ở người, những virus không sao chép được sử dụng thường xuyên để chuyển gen. Các tế bào bao bên ngoài thường được chuyển với những plasmid mã hóa riêng biệt cho
một gen Env. Cấu tạo thường thấy của một plasmid thường là gen cần chuyển, virus mang gen và một đoạn gen điều hòa.
Những dạng tiên tiến nhất và an toàn nhất là những vector được thiết kế để tự bất hoạt (SIN). Tại đây, các vùng U3 của UTR này sẽ bị xóa và một promoter ngoại (như CMV) được chèn vào để đảm bảo cho sự phiên mã của toàn bộ vector mRNA.
Quá trình nghiên cứu này bao gồm cả việc không cho virus sao chép hoặc biến đổi trở lại kiểu hoang dại để gây bệnh như trước.
Cũng như các retrovirus, vector lentiviral cũng phải tuân theo những quy định về cấy ghép. Ví dụ, sự kết hợp của env với VSV-G mở rộng để nâng khả năng chịu nhiệt của vector như tế bào gốc tạo máu của người hay phôi thai.
Lentivirus thường được sử dụng như các vector cho việc chuyển giao các shRNA. Ngày nay, việc chuyển các shRNA vào tế bào đích thông qua vector lentiviral tỏ ra hiệu quả đến nỗi tất cả các công ty đều sản xuất để cung cấp cho việc thí nghiệm. Trong suốt 10 năm qua, có nhiều kỹ thuật mới đã xuất hiện để cải thiện các khuyết điểm của việc chuyển gen.
Một trong những ví dụ cho vector lentiviral là vector này được sử dụng thành công để điều tiết các gen mục tiêu trong não bộ sau khi tiêm tại chỗ. Trong một thử nghiệm lâm sàng, người ta sử dụng vector lấy từ máu của bệnh nhân nhiễm HIV, các tế bào tải nạp phải truyền tải vào những bệnh nhân này cho mục đích chữa bệnh.
Tuy nhiên một trong những nhược điểm của vector lentiviral là các gen này trở nên im lặng sau một thời gian nuôi cấy.
3.5. Baculovirus
Các baculovirus được đưa vào thử nghiệm rất sớm như là một vector có thể đưa shRNA vào cơ thể in vivo. Những vector dựa trên baculovirus có thể vận chuyển một lượng lớn dữ liệu di truyền do đó có thể dễ dàng kết hợp liệu pháp gen và vector im lặng. Hơn nữa, baculovirus không thể sao chép và biểu hiện protein virus trong tế bào động vật có vú, tạo tính an toàn trong liệu pháp chữa trị trong giai đoạn đầu. Baculovirus dựa trên biểu hiện shRNA hiện được sử dụng để nhắm vào các nhiễm virus khác nhau. Tuy nhiên hiệu quả không kéo dài được lâu khi hạn chế của vector này là thời gian giữ gen chuyển ngắn. Có nhiều cách để khắc phục điều này, ví dụ bằng cách chèn chuỗi virus Epstein-Barr vào các vector baculovirus để cải thiện thời gian biểu hiện. Hiện vẫn còn một chặng đường dài phía trước để nghiên cứu về lĩnh vực này.
3.6.Các virus sao chép
Tính hiệu quả của các liệu pháp gen cơ bản không chỉ đòi hỏi hiệu quả ngay lúc chuyển gen vào tế bào đích của động vật có vú mà còn đòi hỏi phải duy trì được sự biểu hiện gen đó. Hiện nay, các nhà nghiên cứu đã nhận ra rằng liệu pháp trị liệu thông thường chưa cung cấp đáng kể hiệu quả điều trị ung thư. Qua 25 năm nghiên cứu, việc sử dụng replicating virus đã bắt đầu được thổi bùng lên. Lợi thế lớn của replicting virus khắc phục các khuyết điểm của vector virus là chúng có thể lây lan