VÀ MỘT SỐ ỨNG DỤNG
Chương 10 NHẬN DIỆN ĐOẠN TĂNG CƯỜN BIỂU HIỆN GEN
2. Các trình tự không mã hóa trong phát triển và điều trị bệnh ở người
2.1. Mô đun điều chỉnh bởi các chất tăng cường phiên mã
Một tính năng đặc trưng của chất hỗ trợ là chế độ mô-đun bằng cách điều chỉnh biểu hiện gen. Một trong nhiều ví dụ sâu sắc đối với những vấn đề này có thể thu được bằng cách kiểm tra vị trí của apolipoprotein E (apoE- một protein liên kết với chất béo) ở người. Ít nhất phân biệt sáu yếu tố kiểm soát các khía cạnh khác nhau của apoE. Cụ thể, việc tăng cường các biểu hiện ở thận đã được cho là do các Promoter [6], trong khi các phần tử nằm ở hạ nguồn của gen bao gồm hai chất hỗ trợ ở gan [7,8], một ở da [6,9], và hai chất hỗ trợ nhiều mô chỉ đạo biểu hiện gen vào tế bào mỡ, các đại thực bào và tế bào hình sao não [9,10], và một brainspecific enhancer xa [11]. Cần lưu ý rằng mỗi một trong các yếu tố riêng biệt do thứ tự của hàng trăm basepairs và nằm rải rác trên 42 kb.
Một ví dụ thứ hai, nơi các mô đun điều chỉnh phiên mã đã được thử nghiệm nghiên cứu rất chi tiết là cardiac homeobox gen Nkx2-5 (Và csx). gen này cần thiết cho sự phát triển tim [12] và hàng loạt các thí nghiệm chuyển gen được sử dụng để chia cắt cả đầu gần và xa các khu vực điều hòa của nó [13-18]. Những nghiên cứu này cho thấy rằng ít nhất năm yếu tố khác biệt để biểu hiện gen Nkx2-5 và các tiểu vùng cụ thể của trung tâm phát triển cũng như các mô không tim với những quy định phức tạp đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển của nhiều khoang tim động vật có vú [19]. Như vậy, quy định kiểu mô-đun phiên mã dường như là một cơ chế chung quy định sự phức tạp của gen. Các ví dụ của apoE vàNkx2-5 cho thấy các kiểu tổ hợp phức tạp của các gen trên các mô thường xuyên phát sinh từ các hoạt động kết hợp của nhiều yếu tố.
2.2. Sự chính xác về không gian và thời gian của các chất tăng cường biểu hiện Một tính năng đáng chú ý của các chất hỗ trợ là sự chính xác về không gian và thời gian cao mà chúng điều chỉnh biểu hiện gen. Một ví dụ về những
trong sự phát triển phôi là vị trí Hoxd11. Loại bỏ điều hòa biểu hiệnHoxd11 ở chuột dẫn đến sự biểu hiện chậm trễ của cả hai Hoxd10 vàHoxd11 trongđộng vật có xương sống, nhưng ở các giai đoạn sau này thường biểu hiện của Hoxd10 và Hoxd11được phục hồi [20]. Từ đó đưa ra giả thuyết rằng gen này là một phần biểu hiện qua trung gian của các yếu tố bổ sung quy định hiện nay trong khu vực này. Kể cả khu vực không có biểu hiện Hoxd11 tạm thời, kết quả này cho thấy gen điều hòa được loại trong khuôn dẫn tới dị tật các đặc điểm biểu hiện nhưng mức độ ít hơn loại bỏ hoàn toàn genHoxd11.
Các vi tríHoxd11 thể hiện như thế nào là do một trình tự điều hòa duy nhất là một điều tương đối khó thấy, nhưng chức năngquan trọngvề không gian và thời gian của mô hình biểu hiện của một gen ở động vật có xương là chìa khóa cho sự phát triển gen. Những hình ảnh nói chung từ nghiên cứu tương tự các gen trung tâm có độ chính xác cao và là trình tự điều hòa duy nhất - kết hợp với chế độ mô-đun của chúng về hoạt động - đã cho phép các mẫu biểu hiện gen phức tạp được phát triển. Điều này đặc biệt đối với trường hợp cho nhiều gen quan trọng, có biểu mẫu xuất hiện cho thấykết quả thường xuyên của sự phối hợp hoạt động của các chất hỗ trợ khác nhau với các mẫu hoạt động riêng biệtvề không gian và thời gian. Quan trọng hơn, những yếu tố duy nhất có xu hướng hạn chế đặc thù mô của chúng so với các mẫu biểu hiện mRNA mà chúng đóng góp, từ đó cung cấp cho các nhà nghiên cứu các thuốc thử cho mô cụ thể nhằm mục tiêu biểu hiện gen.
2.3. Chất hỗ trợ cần thiết cho sự phát triển vật có xương sống
Giống như đột biến trong protein của các gen mã hóa, loại bỏ hoặc gây đột biến các yếu tố điều hòa có thể dẫn đến phát triển các khuyết tật, chẳng hạn như trong các vị tríHoxd11 (xem Phần 2.2). Một ví dụ khác từ các gia đình gen Hox là 200bp "đầu enhancer" (EE) của gen Hoxc8. Loại bỏenhancer này kết quả dẫn đến sự biểu hiện bị trì hoãn của các protein Hoxc8 và trong các khuyết tật xương do khía cạnh của Hoxc8-/- [21], chứng minh rằng yếu tố này quy định là cần thiết để tạo phôi bình thường. Như một ví dụ thứ ba, loại bỏ ba enhancers não cụ thể của Otx2[22,23] cho thấy rằng chúngcần thiết để duy trì mức độ biểu hiện bình thường củaOtx2 trong phát triểnnão. Trong khi loại bỏ các chất hỗ trợ đã không cho kết quả kiểu hình rõ ràng, phôi thai dị hợp tử hợp chất trong đó một Otx2là vô allen và allen khác thì loại bỏ enhancer Otx2 hiển thị khiếm khuyết trong sự phát triển não. Những kết quả cung cấp một trong các yếu tố không phải là hoàn toàn cần thiết cho khả năng tồn tại,chúng đóng một vai trò quan trọng trong phát triển phôi thai thông qua tác động của chúng phối hợp và định lượng về biểu hiện gen.
Đáng chú ý, lỗi phát sinh từ việc loại bỏ hoặc gây đột biến của các yếu tố mặc định thường được giới hạn cho các mô trong đó sự biểu hiện này có thể được khai thác để nghiên cứu chức năng gen được để đánh giá thực nghiệm. Ví dụ, vai trò của Hand2 phát triển sọ mặt có thể không được nghiên
chết vì tim bất thường trước khi sự khác biệt về tính năng sọ mặt. Tuy nhiên, việc xoá một enhancer thuộc về arch-specificHand2 cụ thể ở những con chuột kết quả là các khuyết tật sọ mặt bao gồm hở hàm ếch và hypoplasia hàm dưới, thể hiện một vai trò cả cho enhancer và gen Hand2 phát triển sọ mặt [24].
Những nghiên cứu này đã quy định vị trícấu trúc thông qua các đánh giá riêng các vai trò của gene này trong sự phát triển tim và sọ mặt. Một khả năng quan trọng phát sinh từ việc xác định các chất hỗ trợ mô-cụ thể là khả năng sử dụng chúng vào sự biểu hiện của Cre recombinase. Cấu trúc như vậy có thể được sử dụng để Knockouts mô đặc biệt bằng cách giới thiệu LoxP với các gen quan tâm [25]. Ví dụ, Cre / Lox trung gian loại bỏMef2c sử dụng một bộ tăng cường cơ tim, cụ thể đã được sử dụng để kiểm tra vai trò củaMef2cngoài giai đoạn phát triển mà ở đó những con chuột với sự loại bỏ hoàn toàn củaMef2c gây chết vì dị tật tim mạch [26]. Vì vậy, ngay cả trong trường hợp xóa enhancer là không đủ để xóa bỏ biểu hiện gen trong một mô đặc biệt, tăng cường khả năng có thể được sử dụng để nghiên cứu chức năng của gen tương ứng một mô cụ thể.
Thật vậy, nhiều chất hỗ trợ không gây ra một kiểu hình ngoài những thay đổi trong mức độ biểu hiện của gen mục tiêu khi thực nghiệm đã bị xóa ở chuột. Ví dụ như mô hay loại tế bào hoặc các loại chất hỗ trợ cụ thể cho Engrailed2 [27], Fgf4 [28], Gata1 [29] hay MyoD [30]. Một lời giải thích rõ ràng cho sự vắng mặt thường xuyên trong các thí nghiệm kiểu hình xóa enhancer thường chỉ là một khía cạnh của một mô hình phức tạp nội sinh làm cho biểu hiện mRNA bị ảnh hưởng, trong khi các biểu hiện của gen trong các mô khác hoặc ở các giai đoạn khác được duy trì. Sự hạn chế này cao hơn về không gian, thời gian do đó sẽ gây tác dụng nói chung nhẹ hơn so với việc xoá toàn bộ gen. Một lời giải thích thứ hai là chức năng dự phòng, trong đó có thể là phổ biến hơn là trong số các gen mã hóa protein. Trong khi để biểu hiện trong thử nghiệm nhiều chất hỗ trợ có thể được bỏ cho sự phát triển bình thường và sinh lý học bởi vì chức năng của chúng được bổ sung bởi các yếu tố khác với đặc trưng mô tương tự. Như vậy dự phòng của các yếu tố pháp lý đã có, ví dụ, được trực tiếp hiển thị cho các vị trí TCR, nơi mà được xóa của hai kết quả chất hỗ trợ trong việc giảm nghiêm trọng thymocytes, trong khi một phần tử bị loại bỏ không gây ra một kiểu hình có miễn dịch lớn[31] . Chức năng dự phòng không có nghĩa là các chất hỗ trợ có chức năng ít quan trọng và loại bỏ chúng không có nghĩa làm giảm sức khỏe sinh sản. Thay vào đó nó cho thấy rằng nhiều chất hỗ trợ tham gia vào biểu hiện gen tinh chỉnh.
Những phát hiện này cũng nâng cao khả năng dư thừa chức năng là một yếu tố trong các nghiên cứu so sánh mô tả dưới đây, vì chúng có thể dẫn đến bảo tồn tiến hóa giảm các yếu tố đó.
2.4. Chất hỗ trợ đóng góp cho người bệnh
Theo kết quả của kiến thức giới hạn cho tác giả về vị trí của hầu hết các chất hỗ trợ trong hệ gen, sự đóng góp của các đột biến xa diễn raở bệnh nhân
cho đến nay vẫn chưa được khai thác trên quy mô lớn. Một trong những ví dụ được biết đến là cụ thể ZRS enhancer củaSonic hedgehog (SHH). Yếu tố này nằm ở khoảng cách của một megabase từ gen đó quy định, cư trú tại các Intron của một gen lân cận. Tổn thương di truyền ảnh hưởng đến yếu tố này gây ra Polydactyly cả về con người và trong chủng chuột đột biến, thể hiện vai trò quan trọng của chất hỗ trợ trong quá trình phát triển động vật có vú [32]. Xoá bỏ các khu vực bảo tồn, trong đó intronic enhancer này được kết quả trong sự cắt cụt chân tay ở chuột, hỗ trợ mạnh mẽ các nghiên cứu bệnh của con người [33]. Ngay cả các đột biến điểm, yếu tố này quy định gây học trước trục Polydactyly cho con người [34], cung cấp một lời giải thích tại sao nhiều chất hỗ trợ rất hạn chế và do đó thường được bảo tồn qua quãng đường dài tiến hóa. Trong khi hàng trăm đột biến quy định đóng góp cho bệnh nhân đã được báo cáo [35], hầu hết trong số đó có ảnh hưởng đến vùng promoter chính xác vị trí được biết đến với nhiều gen của con người. Người ta cho rằng với phát triển số lượng xác định chất hỗ trợ con người, nó sẽ trở thành có thể để nhắm mục tiêu ngày càng có hệ thống cho các đột biến quy định trong hoạt động do các yếu tố gene quy định.
2.5. Những thách thức
Các ví dụ đã chọn ở trên làm nổi bật vai trò quan trọng của chất hỗ trợ trong phát triển và bệnh tật. Tuy nhiên, nó được nhấn mạnh rằng đa số các điều hòa xa trong trình tự quy định trong hệ gen của động vật có vú cho đến nay chưa được thực nghiệm đặc trưng, hoặc trong ống nghiệm hoặc trong cơ thể và đóng góp chung của chúng với bệnh nhân vẫn chưa rõ ràng. Hai thách thức lớn có công nghiên cứu quy mô lớn của các chất hỗ trợ phát triển khó khăn.Trước tiên, sự vắng mặt của các phương pháp dự báo phù hợp tiếp tục cho thấy một trở ngại lớn cho việc xác định vị trí của các yếu tố này, đặc biệt là cho hoạt động trên một khoảng cách dài.Thứ hai, số lượng hạn chế được biết đến chủ yếu là chất hỗ trợ phát triển đã ngăn chặn dự đoán bằng phân tích tính toán vì không phù hợp với các chất tăng cường đặc trưng bởi các phương pháp tiêu chuẩn hóa thực nghiệm.Nói chung, sự hiểu biết của chúng ta về trình tự các tính năng liên quan đến chức năng tăng cường khả năng còn hạn chế để nghiên cứu gen là trung tâm và các yếu tố duy nhất. Trong các phần tiếp theo, tác giả sẽ mô tả những nỗ lực gần đây để giải quyết cả hai vấn đề.
Cụ thể, gần đây đã phát triển phương pháp và các công cụ tính toán cho hệ gen học so sánh đã cải thiện đáng kể khả năng để xác định vị trí của chất hỗ trợ giả định trong hệ gen của con người và cung cấp một điểm khởi đầu cho những đặc tính thực nghiệm quy mô lớn của các chất hỗ trợ.