3. SỰ BIỂU HIỆN GENE
3.5. Quá trình dịch mã tổng hợp protein [1]
3.5.2. Các bước tổng hợp protein
Tương tự như quá trình phiên mã, quá trình dịch mã có thể chia thành ba giai đoạn – khởi sự, kéo dài và kết thúc dịch mã. Cơ chế dịch mã về cơ bản đều giống nhau ở tất cả các dạng tế bào prokaryote và eukaryote. Dưới đây là quá trình dịch mã ở các tế bào eukaryote.
Codon AUG (Methionine) đóng vai trò là codon khởi sự ở đa số các mRNA.
Sự khởi đầu dịch mã để bắt đầu tổng hợp protein ở codon khởi đầu đóng vai trò chủ chốt để từ đó thiết lập nên khung đọc chính xác cho cả phân tử mRNA. Cả prokaryote lẫn eukaryote đều có hai tRNA methionine khác nhau: tRNAiMet khởi sự tổng hợp protein và tRNAMet gắn Methionine trên chuỗi protein đang tổng hợp. Cả hai tRNA này đều được gắn methionine bởi cùng một enzyme aminoacyl-tRNA synthetase (MetRS). Nhưng chỉ có Met-tRNAiMet (methionine hoạt hóa đã gắn vào tRNAiMet) là có thể gắn vào vị trí thích hợp trên tiểu phần nhỏ của ribosome, vị trí P, để bắt đầu tổng hợp chuỗi polypeptide. Còn Met-tRNAMetbình thường và tất cả các tRNA đã gắn amino acid khác đều chỉ gắn vào vị trí A của ribosome.
3.5.2.1. Khởi sự dịch mã
Khởi sự dịch mã thường xảy ra ở gần AUG ở gần phía đầu 5' nhất của mRNA.
Trong suốt giai đoạn đầu của dịch mã, ribosome tập hợp một mRNA và một tRNA khởi sự đã được hoạt hóa và được định vị chính xác tại codon khởi đầu. Các tiểu phần lớn và nhỏ của ribosome chưa tham gia vào dịch mã được giữ tách rời nhau bằng cách gắn vài hai nhân tố khởi sự eIF3 và eIF6 (ở eukaryote) (hình 12). Phức hợp tiền khởi sự dịch mã (preinitiation complex) hình thành khi phức hợp eIF3-tiểu phần 40S được gắn bởi eIF1A và một phức hợp bậc ba của Met-tRNAiMet, eIF2 và GTP (Hình 13-bước 1). Tế bào có thể điều hòa sự tổng hợp protein bằng cách phosphoryl hóa một serine trên eIF2 gắn vào GDP; phức hợp được phosphoryl hóa không có khả năng trao đổi GDP bằng GTP và không thể gắn vào Met-tRNAiMet, do đó ức chế sự tổng hợp protein.
Hình 12: Các tiểu phần ribosome trước dịch mã
Khi một ribosome phân tách ra vào cuối quá trình dịch mã, các tiểu phần 40S và 60S liên kết với các nhân tố khởi sự eIF3 và eIF6 tạo nên những phức hợp khởi sự cho một quá trình dịch mã mới.
Trong suốt quá trình khởi sự, đầu mũ chụp 5' của một mRNA được gắn bởi tiểu phần eIF4E của phức hợp gắn mũ chụp eIF4. Phức hợp mRNA-eIF4 sau đó tách khỏi phức hợp tiền khởi sự thông qua một tương tác của tiểu phần eIF4G và eIF3, tạo nên phức hợp khởi sự dịch mã (bước 2). Phức hợp khởi sự sau đó sẽ trượt dọc theo mRNA trong khi hoạt tính helicase của eIF4A sử dụng năng lượng từ sự thủy phân ATP để tháo gỡ cấu trúc bậc hai của RNA. Phức hợp dừng lại khi tRNAiMet anticodon nhận biết được codon khởi đầu – AUG đầu tiên phía hạ nguồn (bước 3). Sự nhận biết codon khởi đầu dẫn đến sự thủy phân GTP liên kết với eIF2, đây là một quá trình không đảo ngược nhằm ngăn chặn sự trượt xa hơn nữa của phức hợp khởi sự. Việc lựa chọn AUG khởi sự thuận tiện hơn nhờ các nucleotide đặc biệt xung quanh nó gọi là trình tự Kozak (được xác định bởi Marilyn Kozak):
(5')ACCAUGG (3'). Adenyl đứng trước AUG (gạch dưới) và Guanine ngay sau nó là hai nucleotide quan trọng nhất, ảnh hưởng đến hiệu quả của sự khởi đầu dịch mã.
Khi tiểu phần nhỏ của ribosome cùng với Met-tRNAiMet được định vị tại codon khởi đầu, sự kết hợp với tiểu phần lớn 60S của ribosome hoàn tất hình thành nên ribosome 80S. Quá trình này cần có hoạt động của một nhân tố khác – eIF5 và sự thủy phân một GTP liên kết với nó (bước 4). Việc kết nối những phản ứng gắn kết vào sự thủy phân GTP làm cho nó trở thành một quá trình không đảo ngược, từ đó các tiểu phần của ribosome không tách rời nhau cho đến khi toàn bộ mRNA được dịch mã và sự tổng hợp protein kết thúc. Sau quá trình này là quá trình kéo dài phiên mã: chuỗi polypeptide đang dài ra vẫn gắn vào tRNA tại vị trí P trên ribosome.
Ở eukaryote, ribosome – bộ máy tổng hợp protein – bắt đầu dịch mã trong vòng khoảng 100 nucleotide của đầu mũ chụp 5' của hầu như toàn bộ mRNA của tế bào. Tuy nhiên, một vài mRNA của tế bào có chứa một vị trí tiếp nhận ribosome bên trong (IRES) nằm ở vị trí xa hơn phía hạ nguồn. Ngoài ra, ở một vài mRNA virus thiếu mũ chụp 5', sự dịch mã được khởi đầu tại vị trí IRES bởi bộ máy dịch mã của tế bào chủ eukaryote bị nhiễm.
Hình 13: Khởi sự phiên mã ở eukaryote
Bước 1 và 2: Các thành phần khác gắn vào phức hợp tiểu phần 40S-eIF3 hình thành phức hợp khởi sự dịch mã. Bước 3: Phức hợp khởi sự trượt dọc mRNA và đặt tiểu phần nhỏ cùng với Met-tRNAiMet vào vị trí codon khởi đầu. Bước 4: Tiểu phần lớn 60S gắn vào hình thành ribosome 80S sẵn sàng cho dịch mã. Hai nhân tố khởi sự, eIF2 (bước 1) và eIF5 (bước 4) là những protein gắn GTP, và GTP này được thủy phân trong suốt quá trình khởi sự. [Hình sửa lại từ R. Mendez và J. D. Richter, 2001, Nature Rev. Mol. Cell Biol. 2 :521.]
3.5.2.2. Kéo dài dịch mã
Phức hợp 80S ribosome – Met-tRNAiMetnằm đúng vị trí bây giờ đã sẵn sàng cho sự thêm vào các aminoacid. Giống như trường hợp khởi sự, sự kéo dài chuỗi cũng cần một nhóm các protein đặc biệt gọi là các nhân tố kéo dài (EF). Những
bước chủ yếu trong quá trình kéo dài bao gồm sự đi vào của aminoacyl-tRNA, sự hình thành liên kết peptide và sự chuyển động của ribosome theo từng codon một dọc theo mRNA. Sau khi quá trình khởi sự hoàn thành, Met-tRNAiMetđược gắn vào vị trí P trên 80S ribosome. Vị trí này của ribosome được gọi là vị trí P bởi vì đây là vị trí tRNA gắn với chuỗi polypeptide đang dài ra. Aminoacyl-tRNA thứ hai ở dạng phức hợp bậc ba liên kết với EF1α∙GTP được đưa vào trong ribosome và gắn vào vị trí A - nơi gắn vào của tRNA đã được aminoacyl hóa (bước 1). Nếu anticodon của aminoacyl-tRNA kế tiếp (thứ hai) bắt cặp chính xác với codon thứ hai trên mRNA, GTP trong phức hợp EF1α∙GTP bị thủy phân. Sự thủy phân GTP xúc tiến thay đổi hình dạng của ribosome, dẫn đến việc gắn chặt của aminoacyl-tRNA vào vị trí A và giải phóng phức hợp EF1α∙GDP (bước 2). Sự thay đổi hình dạng này còn đặt đầu 3' đã được aminoacyl hóa của tRNA ở vị trí A gần với đầu 3' của Met-tRNAiMet ở vị trí P. Sự thủy phân GTP và sự gắn chặt sau đó sẽ không xảy ra nếu anticodon trên aminoacyl-tRNA kế tiếp không bắt cặp được với codon tại vị trí A. Trong trường hợp này, phức hợp bậc ba sẽ rời khỏi, để lại vị trí A trống có thể kết hợp với những phức hợp aminoacyl-tRNA–EF1α∙GTP khác cho đến khi có một tRNA thích hợp bắt cặp bổ sung gắn vào. Hiện tượng này đóng góp vào tính trung thực, chính xác của việc gắn aminoacyl-tRNA vào vị trí A.
Với Met-tRNAiMet khởi đầu ở vị trí P và aminoacyl-tRNA thứ hai gắn chặt vào vị trí A, nhóm α-animo của amino acid thứ hai phản ứng với methionie đã được hoạt hóa (liên kết ester) trên tRNA khởi đầu, tạo thành một liên kết peptide. Phản ứng peptidyltransferase được xúc tác bởi rRNA lớn, giúp định hướng những phân tử tương tác một cách chính xác.
Tiếp theo sự tổng hợp liên kết peptide, ribosome được dịch chuyển dọc theo mRNA một khoảng cách bằng một codon. Sự dịch chuyển này được xúc tiến bởi sự thủy phân của GTP trong phức hợp EF2∙GTP. Sự dịch chuyển này làm cho tRNAiMet, bây giờ đã không còn methionine nữa, được chuyển vào vị trí E (Exit) trên ribosome; đồng thời, tRNA thứ hai, bây giờ đã được gắn cộng hóa trị vào một dipeptide (một peptidyl-tRNA), được dịch chuyển vào vị trí P (bước 4). Từ đó sự dịch chuyển trả hình dạng ribosome về một trạng thái mà vị trí A được mở và có khả năng tiếp nhận một tRNA đã được aminoacyl hóa khác tạo phức hợp với EF1α∙GTP, bắt đầu một chu trình kéo dài chuỗi khác.
Sự lặp lại của chu trình kéo dài thêm các amino acid từng cái một vào đầu C của polypeptide đang kéo dài như được chỉ dẫn từ trình tự mRNA cho đến khi gặp codon kết thúc. Ở những chu trình tiếp theo, sự thay đổi hình dạng xảy ra ở bước hai đẩy tRNA không được acyl hóa ra khỏi vị trí E. Trong lúc chuỗi polypeptide trở nên dài hơn, nó len lỏi qua một rãnh ở tiểu phần lớn của ribosome và rời khỏi ở một vị trí đối diện với vị trí tương tác với tiểu phần nhỏ.
Hình 14: Chu trình kéo dài chuỗi peptidyl trong quá trình dịch mã ở eukaryote Khi ribosome 80S kết hợp với Met-tRNAiMet ở vị trí P của ribosome, một phức hợp bậc ba mang amino acid thứ 2 (aa2) gắn vào vị trí A (bước 1). Sự thủy phân GTP trong phức hợp EF1α∙GTP gây ra sự thay đổi hình dạng của ribosome (bước 2). Sau đó rRNA lớn xúc tác sự hình thành liên kết peptide giữa Meti và aa2 (bước 3). Sự thủy phân GTP trong phức hợp EF2∙GTP gây ra một biến đổi hình dạng khác của ribosome, dẫn đến sự dịch chuyển một codon dọc theo mRNA và chuyển tRNAiMetkhông còn acyl hóa vào vị trí E và tRNA với đoạn peptide vào vị trí P (bước 4). Chu trình có thể bắt đầu lại với việc gắn một phức hợp bậc ba mang aa3 vào vị trí A đang được mở. Trong chu trình thứ hai và những chu trình tiếp theo, tRNA tại vị trí E bị đẩy ra trong bước thứ 2 do sự biến đổi hình dạng gây ra bởi sự thủy phân GTP trong phức hợp EF1α∙GTP. [Hình sửa lại từ K. H.
Nierhausvà cs, 2000, trong R. A. Gerrettvà cs, eds., The Ribosome: Structure, Function,
3.5.2.3. Kết thúc dịch mã
Giai đoạn cuối cùng của quá trình dịch mã cũng cần những tín hiệu phân tử có tính đặc hiệu cao, quyết định số phận của phức hợp mRNA-ribosome-tRNA- peptidyl. Có hai dạng nhân tố giải phóng (RF) đặc hiệu đã được phát hiện. Ở eukaryote, eRF1 (có hình dạng tương tự tRNA) có vẻ hoạt động bằng cách gắn vào vị trí A của ribosome và nhận biết codon kết thúc một cách trực tiếp. Giống như một vài nhân tố khởi sự và kéo dài đã đề cập ở trên, nhân tố giải phóng thứ hai ở eukaryote, eRF3, là một protein gắn GTP. Phức hợp eRF3∙GTP hoạt động phối hợp với eRF1 để xúc tiến sự phân cắt peptidyl-tRNA, từ đó giải phóng chuỗi protein vừa hoàn thành. Ở vi khuẩn có hai nhân tố giải phóng (RF1 và RF2) cũng có chức năng tương tự như eRF1 và một nhân tố gắn GTP (RF3) tương tự như eRF3.
Hình 15: Sự kết thúc dịch mã ở eukaryote
Khi một ribosome mang một chuỗi protein mới được tổng hợp đi đến codon kết thúc (UAA, UGA, UAG), nhân tố giải phóng eRF1 đi vào phức hợp ribosome, có thể là tại vị trí A hoặc gần đó cùng với phức hợp eRF3∙GTP. Đi kèm với sự thủy phân GTP là sự phân cắt chuỗi peptide khỏi tRNA tại vị trí P và sự giải phóng các tRNA cùng với hai tiểu phần của ribosome.
Sau khi giải phóng khỏi ribosome, protein mới được tổng hợp sẽ gấp cuộn thành hình dạng không gian ba chiều nhờ những protein gọi là chaperone. Những nhân tố giải phóng khác sau đó sẽ xúc tiến sự tách ra của ribosome, giải phóng các tiểu phần, mRNA và tRNA kết thúc. Từ đó lại bắt đầu một vòng dịch mã mới.