BC HÓA SINH ĐỊNH TÍNH VÀ KHẢO SÁT PROTEIN

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA DƯỢC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG

KHOA DƯỢC

🙢✵🙠

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM

HÓA SINH BÀI 1 ĐỊNH TÍNH VÀ KHẢO SÁT PROTEIN

GVHD: TS Phạm Phước Điền Sinh viên: Nguyễn Quỳnh Như

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, THÁNG 08 NĂM 2021

BÀI 1 ĐỊNH TÍNH VÀ KHẢO SÁT PROTEIN

I PHẢN ỨNG BIURET

1 Nguyên tắc

 Phản ứng màu Biuret là phản ứng dùng để nhận biết sự có mặt của liên kết peptide trong cấu trúc hóa học của hợp chất hữu cơ Trong môi trường kiềm, các hợp chất

có chứa từ hai liên kết peptide trở lên có thể phản ứng với ion Cu2+ tạo thành phức

chất màu xanh tím, tím, tím đỏ hay đỏ Cường độ màu thay đổi tùy thuộc vào độ dài

mạch peptide

 Do các protein chứa các mạch peptide có chứa nhóm -CO-NH- (liên kết peptide) nên cũng có phản ứng Biuret Phản ứng này thường được ứng dụng để xác nhận các

liên kết peptide và định lượng protein

2 Cách tiến hành

 Ống nghiệm 1: Cho vào ống nghiệm khô một ít tinh thể urea, đun nhẹ Lúc đầu urea nóng chảy, đến khi bắt đầu cứng lại thì ngừng đun

 Ống nghiệm 2: Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch lòng trắng trứng và 0,5ml dung dịch NaOH 10% Nhỏ tiếp 3 giọt dung dịch CuSO4 1% Lắc đều

3 Hiện tượng và giải thích

3.1 Hiện tượng

Ống nghiệm 1: Sau khi cho dung dịch

NaOH 10% và CuSO4 1%, dung dịch

chuyển từ trắng trong sang màu đỏ tím

Ống nghiệm 2: Sau khi cho dung dịch

NaOH 10% và CuSO4 1%, dung dịch chuyển sang màu tím xanh

3.2 Giải thích

 Ống 1: Khi đun chảy các tinh thể urea sẽ tạo ra biuret, cianuric acid và amoniac

Trong môi trường kiềm (dung dịch NaOH 10%), nitrogen trong liên kết peptide của biuret sẽ phản ứng với ion Cu2+ của CuSO4, tạo phức màu đỏ tím Do số lượng liên kết peptide của biuret rất ít nên ống nghiệm 1 chỉ chuyển sang màu đỏ tím

 Ống 2: Trong môi trường kiềm, ion Cu2+ trong muối CuSO4 phản ứng với nitrogen trong liên kết peptide (-CO-NH-) của protein trứng và số liên kết peptide có trong protein trứng vô cùng nhiều nên tạo phức chất có màu tím xanh

II KẾT TỦA THUẬN NGHỊCH PROTEIN BẰNG MUỐI TRUNG TÍNH

1 Nguyên tắc

 Các muối của kim loại kiềm ((NH4)2SO4 , Na2SO4, NaCl) và kiềm thổ (MgSO4) có tác dụng gây kết tủa thuận nghịch protein Sau đó, nếu loại bỏ nhanh các yếu tố gây kết tủa protein sẽ trở về trạng thái dung dịch keo bền

 Các protein khác nhau có thể bị kết tủa với các nồng độ muối khác nhau Vì vậy có thể ứng dụng điều này để tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp của chúng

2 Cách tiến hành

3 Hiện tượng và giải thích

3.1 Hiện tượng

+ từ từ (NH4)2SO4 tinh thể cho đến khi không tan nữa

Tủa 1

3ml dung dịch protein trứng

Cho vào ống nghiệm 1 Lắc đều

Thu dịch lọc trong

Cho vào ống nghiệm 2 Lắc đều

Lọc + 3ml dung dịch (NH4)2SO4 bão hòa

Tủa 2

Ống nghiệm 1: Kết tủa 1 thu được khi

cho protein trứng tác dụng với dung dịch

muối trung tính (NH4)2SO4 và lắc đều

Ống nghiệm 2: Kết tủa 2 thu được khi

cho tinh thể muối (NH4)2SO4 vào dịch lọc trong, khi lắc lên thấy rõ các kết tủa li ti

Nhận xét: Kết tủa 1 là globulin và kết tủa 2 là albumin Đây là 2 loại protein chính có

trong lòng trắng trứng Hai protein này đã bị kết tủa khi cho lòng trắng trứng tác dụng với muối (NH4)2SO4

3.2 Giải thích

1 Tại sao khi cho protein tác dụng với muối trung tính thì lại xuất hiện kết tủa?

 Trong protein trứng có cả globulin và albumin, đây là những protein mang tính acid yếu Ở điều kiện bình thường, trong trạng thái dung dịch, phân tử protein tích điện âm, bên ngoài được bao bởi một lớp áo nước với đầu (+) quay vào và đầu (-)

quay ra, làm protein ‘lơ lửng’ trong nước

 Khi cho muối (NH4)2SO4 có nồng độ cao vào thì muối sẽ tạo ra các ion NH4+ và

SO42- Các ion này sẽ trung hòa các tiểu phân tử protein trứng và đồng thời lấy đi lớp áo ion âm bên ngoài → làm bất hoạt các gốc ưa nước của protein → làm chúng

kết tụ lại với nhau, tạo thành kết tủa

2 Tại sao kết tủa đầu tiên xuất hiện là globumin mà không phải là albumin?

 Vì globumin có trọng lượng phân tử lớn và lớp áo nước bên ngoài lớn hơn so với albumin Các ion NH4+ và SO42- dễ tác dụng vào lớp ion âm bao quanh globumin hơn, từ đó tạo ra kết tủa của globumin trước albumin

→ khi lọc ta được dung dịch bán bão hòa albumin

 Khi cho tinh thể (NH4)2SO4 vào dịch lọc sẽ làm cho dung dịch lọc ở trạng thái bão hòa, lúc này albumin có hiện tượng kết tủa

 Kết luận

 Phản ứng tủa protein bằng phương pháp muối kết chỉ thực hiện được trong môi trường acid yếu hoặc kiềm yếu

 Vì các muối kết protein không mất đi các tính chất vật lí, hóa học và sinh học đặc hiệu nên có thể dùng phản ứng tủa thuận nghịch này để chiết protein dưới dạng tinh khiết, điều chế những sản phẩm men, nội tiết tố

III KẾT TỦA KHÔNG THUẬN NGHỊCH PROTEIN

1 KẾT TỦA PROTEIN BẰNG ACID HỮU CƠ

1.1 Nguyên tắc

Sử dụng acid hữu cơ để làm tác nhân gây kết tủa không thuận nghịch ở protein

1.2 Cách tiến hành

1ml protein trứng

sunfolsalisilicacid 20%

Ống

1

Ống

2

1.3 Hiện tượng và giải thích

1.3.1 Hiện tượng

Ống nghiệm 1: Xuất hiện tủa đục Ống nghiệm 2: Xuất hiện kết tủa đục

nhưng với thời gian nhanh hơn và độ đục nhiều hơn so với ống 1

1.3.2 Giải thích

 Khi cho các acid hữu cơ vào dung dịch protein trứng sẽ tạo nên môi trường acid yếu, có khả năng gây tủa Vì sunfosalisilic acid có thể tủa protein, polypeptide và acid amin, còn trichloracetic acid chỉ có khả năng tủa protein → Sunfosalisilic acid

là acid mạnh hơn TCA nên ở ống nghiệm 2 có thời gian kết tủa nhanh hơn và độ đục nhiều hơn so với ống nghiệm 1

 Lưu ý: Sau khi tác dụng với acid hữu cơ, protein đã kết tủa, biến tính và không thể trở lại trạng thái ban đầu vì acid hữu cơ là tác nhân gây kết tủa không thuận nghịch

2 KẾT TỦA PROTEIN BẰNG MUỐI KIM LOẠI NẶNG

2.1 Nguyên tắc

 Sử dụng các ion kim loại nặng (hầu hết nằm trong nhóm chuyển tiếp) để tác dụng với protein gây kết tủa

 Thường những phản ứng này xảy ra cực kỳ nhanh chóng, vì thế có thể ứng dụng vào việc giải độc cho cơ thể khi nhiễm các kim loại nặng như chì (Pb), thủy ngân (Hg),… Protein sữa, trứng thường được dùng để giải độc

2.2 Cách tiến hành

hiện kết tủa

1

1ml lòng trắng trứng

Pb(CH3COO)2 2% Nhỏ 1 giọt theo thành

ống, chờ đến khi xuất hiện kết tủa

Cho lượng thừa để xem tủa tan

3

2.3 Hiện tượng và giải thích

2.3.1 Hiện tượng

4 ống nghiệm chứa lòng trắng trứng 4 ống nghiệm sau khi cho muối kim loại nặng

 Ống 1: Xuất hiện kết tủa màu trắng đục, khi cho dư muối Pb(CH3COO)2 2% thì tủa tan từ từ

 Ống 2: Xuất hiện tủa màu trắng đục, khi cho dư muối AgNO3 2% thì tủa không tan và tách lớp

 Ống 3: Xuất hiện kết tủa màu vàng nâu, khi cho một lượng dư muối FeCl3 0,5% thì tủa tan nhanh

 Ống 4: Xuất hiện kết tủa màu xanh nhạt, sau khi cho thêm muối CuSO4 2% thì kết tủa tan

Nhận xét: Các muối kim loại nặng tác dụng với protein tạo các phức chất không tan trong nước

nhưng tan trở lại khi có lượng muối dư tương ứng (trừ AgNO3)

2.3.2 Giải thích

 Các muối kim loại nặng khi tác dụng với protein sẽ tạo thành kết tủa do các ion kim loại nặng làm lộ các đầu kỵ nước của protein ra ngoài và biến tính protein sâu sắc, phá vỡ cấu trúc bậc 2, bậc 3 của protein

 Khi cho thêm một lượng dư muối tương ứng sẽ dẫn đến dư thừa các ion kim loại nặng → các phân tử keo hấp thụ các ion kim loại nặng trên bề mặt các tiểu phân tử protein làm chúng cùng tích điện dương (trở thành trạng thái tích điện) → kết tủa

bị tan ra Ion có hóa trị càng cao thì tủa càng dễ tan trở lại

3 KẾT TỦA PROTEIN BẰNG NHIỆT

3.1 Nguyên tắc

Sử dụng nhiệt độ và các chất cần thiết để tạo kết tủa từ protein, qua đó nhận thấy được nhiệt độ là một trong những nguyên nhân chính gây kết tủa

3.2 Cách tiến hành

Ống nghiệm Protein

trứng

CH 3 COOH 1%

CH 3 COOH 10%

NaOH 10%

NaCl bão hòa

Thứ tự xuất hiện kết tủa

1

2ml

Đun sôi

3

3.3 Hiện tượng và giải thích

3.3.1 Hiện tượng

5 ống nghiệm chỉ chứa lòng trắng trứng 5 ống nghiệm sau khi cho dung dịch và đun sôi

 Ống 1: Xuất hiện kết tủa màu trắng, khi ngừng đun thì không trở lại trạng thái ban đầu, thời gian xuất hiện kết tủa lâu hơn ống nghiệm 2 và 5

5

 Ống 2: Xuất hiện tủa trắng đục, thời gian xuất hiện tủa nhanh hơn ống 1

 Ống 3 và 4: Sau khi đun sôi không xuất hiện kết tủa

 Ống 5: Xuất hiện kết tủa trắng đục, thời gian xuất hiện sớm nhất, khi ngừng đun thì không thấy trở lại trạng thái ban đầu

Nhận xét: Nhiệt độ là tác nhân chính gây biến tính và gây kết tủa ở protein Vì nhiệt độ là tác

nhân gây kết tủa không thuận nghịch nên khi sử dụng tác nhân này nên cân nhắc kỹ Để tránh làm biến tính protein trong thực phẩm, chúng ta có thể sử dụng các biện pháp xác định nhiệt độ gây biến tính protein

3.3.2 Giải thích

 Ống 1: Dưới tác động của nhiệt độ, mạch protein bị giãn nở, các liên kết thứ cấp bị

phá vỡ, do đó protein bị vón cục không theo một quy luật nào tạo thành kết tủa

 Ống 2: Khi cho 1 giọt acetic acid 1% vào ống nghiệm sẽ tạo nên môi trường acid

yếu Nhóm (–COO)- bị ức chế sự phân ly nên tiểu phân tử protein mất điện tích, mất lớp áo nước bao quanh → kết tủa pH của môi trường đạt gần tới điểm đẳng điện

 Ống 3: Khi cho 5-8 giọt acetic acid 10% sẽ tạo nên môi trường acid mạnh Do tính

háo nước của acid và môi trường acid mạnh có nhiều ion H+ nên protein bị khử nước Các nhóm (–COO)- được trung hòa, còn các nhóm NH3+ không được trung hòa Phân tử protein vẫn còn tích điện dương, do đó không tạo kết tủa

 Ống 4: Khi thêm 2 giọt NaOH 10% sẽ tạo ra môi trường kiềm Nhóm NH3+ của protein được trung hòa bởi ion OH- Vì vậy khi đun sôi điện tử âm của tiểu phân tử protein vẫn còn Protein tích điện âm, do đó không tạo tủa

 Ống 5: Khi cho 5 giọt acetic acid 1% và 2 giọt NaCl bão hòa sẽ tạo nên môi trường

trung hòa về điện, từ đó tạo kết tủa

3.3.3 Kết luận

 Phần lớn protein bị đông tụ khi đun trong môi trường trung tính hay acid yếu

 Trong môi trường kiềm mạnh, acid mạnh, protein còn tích điện nên không tạo tủa

 Protein dễ dàng tạo tủa khi pH môi trường đạt điểm đẳng điện

 Nồng độ muối và pH môi trường đóng vai trò quan trọng trong tạo tủa của protein

IV XÁC ĐỊNH ĐIỂM ĐẲNG ĐIỆN CỦA PROTEIN

1 Nguyên tắc

Điểm đẳng điện của protein là ở đó protein bị kết tủa lại Từ đó, chúng ta có thể xác định

độ pH cần để gây kết tủa protein hoặc ngược lại Dựa trên 1 thước đo pH đã xác định từ trước, việc xác định điểm đẳng điện có thể giúp protein tránh kết tủa hoặc ngược lại

2 Cách tiến hành

Lấy 4 ống nghiệm sạch, khô Cho vào mỗi ống nghiệm dung dịch Na2HPO4 0,2M và citric acid 0,1M theo bảng sau Lắc đều rồi cho dung dịch albumin 1 % vào, thêm cồn, lắc nhẹ Để yên trong 5 phút và ghi nhận hiện tượng xuất hiện

Ống nghiệm Na 2 HPO 4

0,2M (ml)

Citric acid 0,1M (ml)

pH Albumin

1% (ml)

EtOH (ml) Độ đục⁕

⁕Thang độ đục: 1-trong nhất, 4-đục nhất

3 Hiện tượng và giải thích

3.1 Hiện tượng

3.2 Giải thích

 Khi độ pH đạt đến điểm đẳng điện, tức là tổng số điện tích âm và tổng số điện tích dương của phân tử protein bằng 0, lúc đó, protein sẽ không thể dễ dàng di chuyển

và kết tụ lại với nhau tạo kết tủa

 Điểm đẳng điện của protein gần nhất với 4,7 do ở pH = 4,7 thì mức độ kết tủa của protein đạt lớn nhất

V ĐÔNG TỤ SỮA BẰNG PROTEASE

1 Nguyên tắc

Xác định hoạt động đông tụ sữa dựa vào thời gian cần thiết để làm đông tụ một thể tích dung dịch sữa có nồng độ xác định

2 Cách tiến hành

 Pha dung dịch sữa gầy 10% trong CaCl2 0,01M

 Lấy dứa (thịt,vỏ,lõi) vắt lấy nước, lọc hoặc ly tâm thu nước trong là dịch enzyme

 Cho 5ml dung dịch sữa vào ống nhiệm, để vào bể điều nhiệt đến khi đạt 50oC

 Cho một lượng dịch enzyme (khoảng 0,1 – 0,5ml), lắc đều Tiếp tục giữ ở 50oC, ghi lại thời gian tạo thành kết tủa protein, tính từ lúc bắt đầu cho enzyme vào cho đến lúc vừa xuất hiện những hạt sữa mịn nhỏ, hiện rõ trên nền đỏ của nhiệt kế (dung dịch enzyme cần được chuẩn bị sao cho thời gian đông tụ sữa khoảng 1 – 5 phút)

3 Hiện tượng và giải thích

Kết tủa trắng xuất hiện khi cho dịch enzyme

vào dung dịch sữa và giữ ở 50oC

Hạt sữa nhỏ li ti trên nền đỏ nhiệt kế

Giải thích: Protease động tụ sữa là một dạng protease có khả năng tấn công vào vị trí

Phe(105)-Met(106) của kappa-casein làm lộ ra các đầu kỵ nước và dẫn tới hiện tượng động tụ

4 Tính toán

Công thức tính: E = 𝑽𝒔ữ𝒂(𝒎𝒍) 𝒙 𝑲

𝑻 (𝒔) 𝒙 𝑽𝒆𝒏𝒛𝒚𝒎𝒆(𝒎𝒍)

Protease được lấy từ thơm chứa enzym bromelin

VS = 5ml

T = 11

12 phút = 55 giây

VE = 0,5ml

K = 0,2

E = ? (ĐV/ml)

E = 𝑉𝑠ữ𝑎 𝑥 𝐾

𝑇 𝑥 𝑉𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚𝑒 = 5 𝑥 0,2

55 𝑥 0,5 = 2,1818 (ĐV/ml)