ĐỊNH DANH và KHẢO sát đặc TÍNH SINH học của CHỦNG nấm TRẮNG BEAUVERIA gây BỆNH côn TRÙNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã chấp nhận luận văn đính kèm với đề tài: “Định danh và khảo sát đặc tính sinh học của ch

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

TRƯƠNG THANH XUÂN LIÊN

ĐỊNH DANH VÀ KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH SINH

HỌC CỦA CHỦNG NẤM TRẮNG

BEAUVERIA GÂY BỆNH CÔN TRÙNG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BẢO VỆ THỰC VẬT

Cần Thơ – 2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

ĐỊNH DANH VÀ KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH SINH

HỌC CỦA CHỦNG NẤM TRẮNG

BEAUVERIA GÂY BỆNH CÔN TRÙNG

Cần Thơ – 2012

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Chứng nhận đã chấp thuận luận văn tốt nghiệp đính kèm với đề tài:

“Định danh và khảo sát đặc tính sinh học của chủng nấm trắng

Beauveria gây bệnh côn trùng”

Do sinh viên TRƯƠNG THANH XUÂN LIÊN thực hiện và đề nạp

Kính trình hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp

Cần Thơ, ngày tháng năm

Cán bộ hướng dẫn

PGS.TS TRẦN VĂN HAI

ThS TRỊNH THỊ XUÂN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã chấp nhận luận văn đính kèm với đề tài:

“Định danh và khảo sát đặc tính sinh học của chủng nấm trắng Beauveria gây bệnh côn trùng” Do sinh viên TRƯƠNG THANH XUÂN LIÊN thực hiện và bảo vệ trước hội đồng ngày tháng năm

Luận văn đã được hội đồng đánh giá ở mức

Ý kiến hội đồng:

CHỦ NHIỆM KHOA NN & SHƯD

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn tốt nghiệp là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình luận văn nào trước đây

LƯỢC SỬ CÁ NHÂN

- o O o -

Họ tên sinh viên: TRƯƠNG THANH XUÂN LIÊN

Sinh ngày 06 tháng 04 năm 1990, Tỉnh An Giang

Con ông TRƯƠNG THANH NHÀN và bà LÝ THỊ NGỌC ĐIỆP

Đã tốt nghiệp phổ thông trung học năm 2008, tại Trường PTTH Chu Văn

LỜI CẢM TẠ

Kính dâng!

Cha, Mẹ đã hết lòng nuôi con khôn lớn nên người

Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến!

Tất cả mọi người trong gia đình đã động viên và chăm lo cho em

Thành kính biết ơn!

PGS TS Trần Văn Hai, Ths Trịnh Thị Xuân và Ks Huỳnh Hữu Đức đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy, gợi ý và cho những lời khuyên hết sức bổ ích trong việc nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Đặc biệt biết ơn!

Ks Nguyễn Chí Long, Ks Nguyễn Thị Diệu Hương, Ks Văng Thị Tuyết Loan

đã tận tình giúp đỡ và chỉ bảo em trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Các thầy cô Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ đã hết lòng truyền đạt những kiến thức quý báu cho em trong suốt bốn năm

học

Chân thành cám ơn!

Các bạn lớp Bảo Vệ Thực Vật khóa 34, các bạn, các anh chị cùng phòng thí nghiệm đã động viên và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình làm luận văn tốt nghiệp

Trương Thanh Xuân Liên

MỤC LỤC

1.1 Đặc điểm phân loại và hình thái học của nấm trắng

Beauveria bassiana

3

1.5 Cơ chế tác động của nấm Beauveria bassiana lên côn

trùng

5

1.7 Một số kết quả nghiên cứu về đặc điểm sinh học của nấm

Beauveria bassiana

8

1.8 Một số thành tựu về ứng dụng nấm trắng Beauveria bassiana

12

2.2.1 Thí nghiệm 1: Thu thập và định danh nấm trắng

Beauveria bassiana thông qua phương pháp

2.2.3 Thí nghiệm 3 Khảo sát khả năng hình thành bào

tử của nấm Beauveria bassiana

16

2.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nguồn

dinh dưỡng đến sự phát triển của các chủng nấm

Beauveria bassiana

16

3.1 Thu thập và định danh nấm trắng Beauveria bassiana

thông qua phương pháp truyền thống

3.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến

sự phát triển của nấm Beauveria bassiana

22

PHỤ CHƯƠNG

DANH SÁCH HÌNH

3.1 Cấu trúc cành sinh bào tử nấm Beauveria bassiana được

quan sát dưới kính hiển vi tương phản pha

19

3.2 Bào tử nấm Beauveria bassiana nảy mầm trên môi

trường SDAY3 quan sát dưới kính hiển vi tương phản

pha (x 100 lần); A) tại thời điểm 8 GSKC; B) tại thời

điểm 20 GSKC

21

3.3 Tốc độ phát triển trung bình của năm chủng nấm trên

bốn loại môi trường dinh dưỡng (giá trị TB ± SD, nhiệt

độ 290C, (12 giờ sáng/12 giờ tối)

27

3.3 Tỷ lệ (%) nảy mầm của các chủng nấm Beauveria

bassiana ở các thời gian khác nhau

20 3.4 Mật số bào tử của các chủng nấm Beauveria bassiana

sau 10 NSKC trên môi trường SDAY3

Trương Thanh Xuân Liên, 2012: “Định danh và khảo sát đặc tính sinh học

của chủng nấm trắng Beauveria gây bệnh côn trùng” Luận văn tốt nghiệp kỹ

sư ngành Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ

TÓM LƯỢC

Đề tài được thực hiện từ tháng 12 năm 2011 đến tháng 04 năm 2012 nhằm mục đích: (1) Thu thập và định danh nấm trắng thuộc giống Beauveria gây bệnh côn trùng; (2) khảo sát các đặc tính sinh học như xác định thời gian nảy mầm, khả năng hình thành bào tử và ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sự phát triển của các chủng nấm Beauveria thu thập được Kết quả cho thấy:

(1) Đã thu thập được năm mẫu nấm trắng trên các đối tượng côn trùng gây hại tại Cần Thơ và Hậu Giang như: rầy nâu Nilaparvata lugens Stal (Homoptera: Delphacidae), rệp sáp giả Planococcus sp (Homoptera: Pseudococcidae), sâu xếp lá đậu phộng Archips micacerana Walker, (Lepidoptera: Tortricidae), sùng đất Lepidiota cochinchinae Brenske (Coleoptera: Scarabaeidae) và bọ nhảy Phyllotreta striolata Fabricius (Coleoptera: Chrysomelidae) Qua quan sát, phân loại bằng hình thái học như hình dạng bào tử, cành bào đài, cơ quan sinh bào tử, kích thước bào tử cho thấy cả năm chủng nấm trắng đều thuộc giống Beauveria loài bassiana

(2) Sau khi cấy 24 giờ tất cả năm chủng nấm trắng Beauveria bassiana thu thập được đều có tỷ lệ nẩy mầm trên 90% và khả năng hình thành bào tử cao nhất là hai chủng nấm Bb 10 (SĐ-CT) và Bb 11 (BN-CT) Môi trường dinh dưỡng SDAY 3 cho tốc độ đường kính khuẩn lạc đạt cao nhất sau 31 ngày nuôi cấy (7,41cm) và tốc

độ phát triển trung bình/ngày của môi trường này đạt (1,3 cm/ngày)

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, do sử dụng quá nhiều thuốc hóa học trong việc phòng trị côn trùng gây hại đã làm tăng tính kháng của côn trùng bên cạnh đó còn vô tình ảnh hưởng đến các loài côn trùng có lợi trong nông nghiệp Lạm dụng thuốc hóa học dẫn đến mất cân bằng về hệ sinh thái đồng ruộng, ô nhiễm môi trường và gây hại cho sức khỏe của con người Vì những vấn đề trên mà sản xuất nông nghiệp theo hướng bền vững ngày càng được quan tâm trong đó phòng trừ sinh học tổng hợp đóng vai trò rất quan trọng trong điều chỉnh cân bằng sự cân bằng của quần thể Việc sử dụng các loại vi sinh vật có ích như nấm ký sinh,

vi khuẩn, virus và tuyến trùng để quản lý sâu hại được xem là một trong những biện pháp sinh học lý tưởng và phù hợp với mục tiêu bảo vệ môi trường và sức khỏe con người, hạn chế tác hại của thuốc hóa học

Nấm Beauveria là một trong những loại nấm ký sinh gây bệnh cho nhiều loại côn trùng trong tự nhiên Chế phẩm nấm Beauveria đã được nhiều nơi trên

thế giới nghiên cứu ứng dụng phòng trừ nhiều đối tượng côn trùng hại cây trồng bên cạnh đó việc sử dụng thuốc sinh học sẽ góp phần khắc phục những đặc điểm

có hại do thuốc hóa học gây ra Beauveria bassiana là loài nấm trắng được sử dụng phổ biến trong việc nghiên cứu phát triển và ứng dụng trong chi Beauveria Nấm Beauveria bassiana gây bệnh trên 700 loại côn trùng thuộc bộ cánh cứng

(Coleoptera), cánh nửa cứng (Hemiptera), cánh đều (Homoptera), cánh bằng (Isoptera), sâu non bộ cánh vẩy (Lepidoptera) (Võ Thị Thu Oanh, 2010)

Ở nước ta, Viện Bảo vệ Thực vật đã có một số nghiên cứu sử dụng nấm này để phòng trừ một số đối tượng sâu hại cây trồng như rầy nâu hại lúa, châu chấu hại bắp, sâu tơ hại rau cải, bọ cánh cứng ăn lá dừa non trong thời gian gần đây bước đầu đã thu được những kết quả nhất định (Phạm Thị Thuỳ, 2004) Hiện nay có nhiều loại chế phẩm để sử dụng trong việc phòng trừ sâu hại như Biovip (Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long), Biobauve 5DP (Trung tâm NC SX các chế phẩm sinh học), Muskardin (Công ty CP thuốc sát trùng Cần Thơ), Beauveria (Công ty TNHH TM – DV Thanh Sơn Hóa Nông) (danh mục thuốc bảo vệ thực vật 2011)

Tuy nhiên, việc sử dụng các chủng nấm này trong quá trình sản xuất cũng như phòng trừ tổng hợp còn nhiều hạn chế Từ đó, đưa đến yêu cầu cần phải tiến hành nghiên cứu bổ sung để tìm hiểu thêm khả năng phát triển của các chủng

nấm Beauveria bassiana, trên các môi trường nhân tạo, tiến tới nghiên cứu hoàn

thiện môi trường sản xuất thành chế phẩm sinh học có chất lượng ổn định và không có hiện tượng tạp nhiễm, để thử nghiệm và đưa ra ứng dụng đạt hiệu quả

cao Do đó đề tài “ Định danh và khảo sát đặc tính sinh học của chủng

nấm trắng Beauveria gây bệnh côn trùng” đã được thực hiện nhằm mục

tiêu:

- Thu thập và định danh các chủng nấm trắng thuộc chi Beauveria gây

bệnh côn trùng bằng phương pháp phân loại truyền thống

- Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của các chủng nấm trắng Beauveria basiana đã thu thập được

CHƯƠNG I LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm phân loại và hình thái học của nấm trắng Beauveria bassiana a) Lịch sử, phân loại và phân bố

 Lịch sử

Vào năm 1878 nhà bác học Snoi đã tiến hành một loạt thí nghiệm với nấm

trắng Beauveria globulifera nhằm xác định hiệu lực của nấm này đối với loài bọ xít hại lúa mì Blissus leucopterus Say Các nhà khoa học trường Đại học Tổng

hợp Kanzac cũng đã thiết lập một trạm tuyên truyền để phổ biến vai trò của nấm

Beauveria với việc lây bệnh trên côn trùng, họ đã gửi hơn 500 kiện nấm Beauveria đến các trang trại để phòng trừ sâu hại củ cải đường (Nguyễn Lân

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu sử dụng chế phẩm nấm Beauveria bassiana

đã được tiến hành từ năm 1979 và đến nay vẫn còn tỏ ra có tác dụng đối với sâu róm thông và một số loài sâu hại cây trồng (Trần Văn Mão, 2002)

 Phân loại

Xếp theo hệ thống phân loại nấm của Anisworth, 1966, 1970, 1971 (trích

dẫn bởi Phạm Thị Thùy, 2004) cho rằng nấm Beauveria bassiana thuộc ngành phụ lớp nấm bất toàn (Deuteromycetes), giống Beauveria Theo Macleod (1954) thì loài Beauveria bassiana là loài điển hình trong lớp nấm bạch cương Beauveria (trích bởi Lê Thị Thanh Thảo, 2006)

 Phân bố

Nấm Beauveria bassiana là nấm hại côn trùng phân bố trên khắp thế giới,

xuất hiện phổ biến trong tự nhiên, có thể phân lập dễ dàng từ xác côn trùng chết hay được phân lập từ trong đất (Tanada and Kaya, 1993)

Nấm Beauveria bassiana là loại nấm hại côn trùng phân bố khắp thế giới,

xuất hiện phổ biến trong tự nhiên, có thể phân lập dễ dàng từ xác côn trùng chết hay phân lập từ trong đất (Đỗ Thị Hồng, 2006)

Hiện nay, nấm Beauveria basssiana có trên 120 loài thuộc 45 họ 7 bộ côn

trùng, nếu kể cả sâu hại nông nghiệp, chúng có thể ký sinh gần 200 loài (Lê Thị

Tú Xinh, 2009)

b) Đặc điểm hình thái của nấm Beauveria bassiana

Các loài nấm trong chi Beauveria được phân biệt dựa trên hình dạng, kích thước bào tử Theo Vuillemin (1912) các loài trong chi nấm Beauveria sinh sản

bằng bào tử đính và chúng được phân loại theo đặc điểm hình thái học Đây là loài nấm quan trọng với các đặc tính giá bào tử trần là những bào tử lớn không vách ngăn, không màu, ở đỉnh hoặc các nhánh ngang của sợi nấm Tế bào sinh bào tử trần mọc rải rác hoặc thành từng cụm, phần gốc của tế bào hình bình, phần ngọn cuống hẹp, ngoằn ngoèo hình zigzắc không đều kích thước từ 1 x 5 -

20 µm Bào tử trần không vách ngăn, hình cầu hoặc gần cầu đôi khi hình elip có

kích thước 2 - 2,5 x 2,5 - 4,5 µm Màu sắc khuẩn lạc của nấm Beauveria màu

trắng hay vàng nhạt, bề mặt khuẩn lạc dạng bột có màu trắng ngà (Võ Thị Thu Oanh, 2010)

Nấm Beauveria bassiana có sợi nấm từ màu trắng đến màu kem có pha một

ít màu đỏ da cam, đôi khi pha một ít màu lục, có thể tiết vào môi trường sắc tố màu vàng, màu đỏ nhạt hoặc màu xanh da trời (Phạm Thị Thùy, 2004)

Theo Kirk và ctv (2001) trong quá trình nuôi cấy, nấm Beauveria sinh ra

các sợi nấm trắng và bào tử đính, khi bào tử già xuất hiện giọt dịch màu vàng

xuất hiện ở giữa đối với loài Beauveria amorpha và Beauveria velata Một số

loài khác xuất hiện các giọt dịch màu đỏ trên bề mặt khuẩn lạc khi nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng ( trích bởi Võ Thị Thu Oanh, 2010)

1.2 Đặc điểm sinh lý của nấm Beauveria bassiana

Theo Shimazu (2003) tốc độ mọc mầm và phát triển của nấm Beauveria bassiana khác nhau bởi nhiệt độ Tác giả tiến hành cấy bào tử nấm vào môi

trường thạch ở những nhiệt độ khác nhau và quan sát sự phát triển của chúng bằng cách đo chiều dài đường kính của khuẩn lạc Kết quả, ông xác định nhiệt độ cao nhất để nấm có thể phát triển tốt là 300C Theo ông, ở nhiệt độ từ 25-300C, hầu như 100% bào tử đều mọc mầm sau 20 giờ Còn ở nhiệt độ 340C, tốc độ mọc mầm của nấm rất thấp sau 24 giờ Tuy nhiên gần như 100% bào tử mọc mầm ở

34 giờ Ở nhiệt độ 350C chỉ 4,6% bào tử nấm nảy mầm còn ở nhiệt độ trên 360C

hầu như không quan sát được bào tử nào nảy mầm Ông khẳng định, để bào tử nấm mọc mầm và phát triển thì nhiệt độ phải thấp hơn 360C (Nguyễn Đức Toàn, 2009)

Theo Shipp và ctv (2003) khi nghiên cứu hiệu lực của nấm Beauveria bassiana đối với rầy mềm trên cây dưa chuột đã khẳng định ẩm độ tốt nhất cho

sự phát triển của nấm là 97,5% (độ hữu hiệu đạt 60 - 88,8%) trong khi ở ẩm độ 70% và 80% chỉ diệt được 15,3 - 43,9% số rầy mềm làm thí nghiệm (trích bởi Nguyễn Đức Toàn, 2009)

Theo Phạm Thị Thùy (2004) ẩm độ tốt nhất cho sự phát triển của nấm dao động trong khoảng từ 80 - 90%

1.3 Đặc điểm sinh học của nấm Beauveria bassiana

Beauveria bassiana là loại nấm ký sinh chuyên hóa rộng, do đó vẫn có khả

năng tồn tại khi thiếu vật chủ, và trong điều kiện không thuận lợi sẽ tồn tại dưới dạng hạch nấm Vì nấm có nhiều cách xâm nhiễm: qua tiếp xúc cơ học, qua lớp cutin, đường hô hấp và qua lỗ thở của thân kí chủ nên khả năng nhiễm của nấm với côn trùng khá cao (Võ thị Thu Oanh, 2010)

1.4 Khả năng sinh độc tố diệt côn trùng

Năm 1969, Hamill và ctv đã xác định được độc tố diệt côn trùng của nấm Beauveria bassiana và đặt tên cho độc tố này là Beauvericin Những nghiên cứu

về sau của Ovehinnokov và ctv (1971) đã tổng hợp lại độc tố này James và ctv

đã xác định bản chất của độc tố sinh ra trong quá trình trao đổi chất là vòng peptide có sắc tố màu vàng là tenelin và basianin, những sắc tố này có thể là do hydroxylat progesteron và những phần tách nhỏ ra từ testosteron (CB19BHB28BOB2B) sinh ra (trích dẫn bởi Phạm Thanh Hùng, 2007).Về mặt hóa học, Beauvericin có danh pháp là cyclo (N-metyl L-phenylalanin-D-α-hydroxy-izovaleryl)B3B Từ 1 lít môi trường nuôi cấy nấm Beauveria bassiana các nhà

khoa học Trung Quốc ở trường Đại học Tổng hợp Nam Khai (Thiên Tân) đã tách

ra được 1,5g độc tố Beauvericin và từ 1kg môi trường đặc tách ra được 3,8g Beauvericin (trính bởi Phạm Thị Thùy, 2004)

Theo Bidochka và Khachatourians thì sản phẩm của nấm Beauveria bassiana là 2 axit hữu cơ, đó là axit oxalic và axit citric, khi nuôi cấy trên môi

trường có chứa kitin Các tác giả đã chứng minh được chính hai axit trên đã tham gia vào trong quá trình hoà tan protein biểu bì của côn trùng (trích dẫn Phạm Thị Thuỳ, 2004)

Thành phần của môi trường sẽ gây ảnh hưởng đến sự sản sinh độc tố của

nấm Beauveria bassiana Theo Samsináková và Hrabétová (1969) sự hiện diện

của đường fructose trong môi trường nuôi cấy sẽ làm gia tăng đáng kể độc tố

Beauvericin của nấm Beauveria bassiana (Lê Thị Thanh Thảo, 2006)

1.5 Cơ chế tác động của nấm Beauveria bassiana lên côn trùng

Theo Trần Văn Mão (2002) nhờ gió và mưa, bào tử nấm lây lan đến sâu khỏe, gặp điều kiện ẩm độ và nhiệt độ thích hợp phình lên, nảy mầm thành ống mầm Ống mầm tiếp xúc với da côn trùng rồi hình thành vòi bám Vòi bám là một tế bào có kích thước gấp 2-3 lần bào tử, có dịch nhầy để bám vào da Vòi bám hình thành sợi nhỏ chọc thủng da Sau khi xuyên qua da sợi nấm phình to thành dạng bàn, mép bàn mọc sợi nấm rồi hình thành các sợi ngắn Sợi ngắn nhờ

áp lực đẩy vào bên trong cuối cùng đạt đến da thật Nếu côn trùng lột xác, sợi ngắn sẽ lại hình thành vòi bám mới để tiến hành tái xâm nhiễm Nấm thông qua

áp lực cơ giới để xâm nhập vào trong cơ thể côn trùng và nhờ tác dụng của enzyeme phân giải mà chọc thủng biểu bì Những enzyme phân giải là protease, lipoase và kitinase Muốn da phân giải hết trước hết là nhờ protease rồi lipase, cuối cùng mới có tác dụng của kitinase

Đối với nấm trắng Beauveria bassiana, khi bào tử của nấm tiếp xúc với da

côn trùng, gặp điều kiện nhiệt độ và ẩm độ thích hợp, bào tử sẽ nảy mầm ngay lập tức phát triển thành dạng sợi nấm Sợi nấm đâm xuyên qua lớp da bên ngoài của côn trùng bằng cách tiết ra enzyme làm tan lớp kitin, nhanh chóng đâm xuyên qua lớp da và phát triển vào bên trong cơ thể côn trùng, sợi nấm sẽ tiết ra độc tố gọi là Beauvericin làm hệ thống miễn dịch của cơ thể côn trùng bị yếu đi

và sau đó côn trùng chết Sau khi côn trùng chết một kháng sinh được sản xuất để đối kháng với vi khuẩn trong đường ruột của côn trùng Cuối cùng, toàn bộ những lổ hỏng trên cơ thể côn trùng sẽ được làm đầy bởi những khối nấm Khi điều kiện thuận lợi, nấm sẽ phát triển khắp những bộ phận mềm trên cơ thể côn

trùng và triệu chứng đặc trưng về côn trùng bị nấm Beauveria bassiana ký sinh

sẽ xuất hiện (Nguyễn Đức Toàn, 2009)

Theo Phạm Thị Thùy (2004) nguyên nhân gây bệnh chủ yếu là lây lan từ con ốm sang con khỏe thông qua tiếp xúc trực tiếp với nhau Bên cạnh đó, bệnh

vi nấm rất dễ lan truyền bằng va chạm đơn giản mà ở một số bệnh vi sinh vật khác hầu như không xảy ra Khi lây bệnh, chúng thường lây lan nhờ gió, mưa, chim, thú, và các bệnh do nấm tạo thành những ổ bệnh kéo dài theo chiều gió thổi-con đường truyền bệnh thông qua các loại độc tố của nấm côn trùng

Khi bào tử nấm dính vào côn trùng gặp điều kiện thích hợp sẽ nảy mầm và mọc thành sợi nấm đâm xuyên qua lớp vỏ kitin Chúng phát triển ngay trong cơ thể côn trùng cho đến khi xuất hiện những tế bào nấm đầu tiên (có dạng chuỗi ngắn như nấm men), côn trùng phải huy động hết các tế bào bạch huyết để chống

đỡ nhưng nấm bạch cương đã sử dụng những vũ khí hóa học rất lợi hại là độc tố Beauvericin, protease và một số chất khác làm cho tế bào bạch huyết của côn trùng không chống đỡ nổi nên lần lượt bị tiêu diệt (Phạm Thị Thùy, 2004)

Bào tử nấm Beauveria bassiana phát tán trong không khí tiếp xúc và xâm

nhiễm vào côn trùng qua lớp vỏ kitin bên ngoài, gặp điều kiên thuận lợi sẽ phát triển thành sợi nấm đâm xuyên qua lớp kitin, phát triển bên trong cơ thể côn trùng cho đến khi hình thành bào tử đầu tiên sẽ tiết độc tố beauvericin, bassianolide, oporein và một số chất khác hủy diệt tế bào bạch huyết, làm tê liệt hoặc gây ức chế miễn dịch côn trùng Khi tiêu diệt hết tế bào bạch huyết côn trùng sẽ bị chết, cơ thể côn trùng bị khô và cứng do các sợi nấm đan xen nhau mọc phủ bên ngoài cơ thể (Võ Thị Thu Oanh, 2010)

1.6 Triệu chứng sâu hại bị bệnh vi nấm côn trùng

Cá thể côn trùng bệnh thường khác với côn trùng khỏe qua các triệu chứng

bên ngoài Đó là do côn trùng có những thay đổi về sinh lý và bệnh lý của các mô trong cơ thể của côn trùng Những thay đổi thể hiện ở bên ngoài có thể quan sát được gọi là triệu chứng bệnh

Theo Phạm Thị Thùy (2004) triệu chứng đặt trưng nhất là sự thay đổi cách

di chuyển của côn trùng Khi bị bệnh thì các mô côn trùng dần bị phá hủy, ban đầu là di chuyển yếu về sau sẽ ngừng và bất động

Khi bị bệnh nấm, côn trùng ngừng vận động từ 2-3 ngày, thậm chí một tuần trước khi nấm phát triển dày đặc trong toàn bộ thân

Côn trùng bị bệnh do nấm bất toàn Deuteromycetes ký sinh, đặc biệt do

nấm trắng Beauveria bassiana thì ở chổ bào tử bám vào, nấm phát triển bên

trong thân của sâu non tạo nên một vệt đen, không có hình thù nhất định

Côn trùng bị bệnh nấm khi chết thường có màu sắc nhất định, đối với nấm

Beauveria bassiana thì cơ thể côn trùng khi bị chết sẽ có màu trắng

Sự thay đổi về kích thước và độ lớn của cơ thể côn trùng cũng là đặc trưng của các bệnh mãn tính hoặc các bệnh xâm nhập vào chậm Trong trường hợp do

nấm trắng Beauveria bassiana thì thân cơ thể côn trùng bị ngắn lại hoặc bị khô

đét do hệ thống tiêu hóa bị tổn thương hoặc do thiếu thức ăn Các vi sinh vật gây

bệnh trên côn trùng thường tác động đến những loại mô nhất định Khi côn trùng

bị bệnh nấm thì tuyến mỡ và các mô khác bị hòa tan là do lipase và protease của nấm tiết ra Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể xác định được côn trùng bị bệnh là do động vật nguyên sinh hay do nấm bậc thấp (Coelomycidinum, Entomophthora, ) gây ra Hiện tượng chết hoại gắn liền với hiện tượng tiêu hủy

mô là đặc trưng của bệnh nấm, quá trình này tiến triển qua hai giai đoạn:

- Hiện tượng chấn thương: các mô tổn thương bị phá hoại là do nấm từ bên ngoài gây ra, trong trường hợp này các lympho máu đọng lại và mô tái sinh được tạo nên trên bề mặt phần thân côn trùng bị chấn thương

- Hiện tượng nhiễm trùng máu của côn trùng khi bị bệnh nấm là do lympho chứa đầy sợi nấm hoặc những giai đoạn phát triển khác nhau của nấm Hiện tượng thực bào là quá trình các tế bào bao vây và nuốt một phần tiểu thể nhất

định Khi côn trùng bị bệnh do nấm Beauveria bassiana thì những hợp bào này

và các loại tế bào khổng lồ được hình thành và ký sinh trên côn trùng làm cho côn trùng chết

1.7 Một số kết quả nghiêm cứu về đặc điểm sinh học của nấm Beauveria

bassiana

+ Môi trường dinh dưỡng và phương pháp nuôi cấy nấm côn trùng

Môi trường nuôi cấy là yếu tố quan trọng cho nấm côn trùng sinh trưởng và phát triển Nếu môi trường không tốt sẽ ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm vì trong quá trình nảy mầm để hình thành bào tử nấm cần các nguồn C, N, các nguyên tố vi lượng C++, Zn++, K++, Mg++ để phát triển và duy trì độ pH (Võ Thị

Thu Oanh, 2010) Kết quả nghiêm cứu Phạm Thị Thùy và ctv (1995) đã xác định

môi trường Sabouraud bổ sung thêm khoáng chất là môi trường nhân giống nấm côn trùng tốt nhất

Theo Nguyễn Thị Lộc (2009) môi trường PDA là môi trường sơ cấp thích hợp để nhân giống cấp 2, môi trường có thành phần 80% cám, 20% trấu và 59%

nước là môi trường thích hợp để sản xuất sinh khối nấm Beauveria bassiana đạt 1,87 x 109 bt/gram

Nhiều nghiên cứu đã tập trung vào việc lựa chọn môi trường phù hợp để

phân lập nấm Chase và ctv dùng môi trường bột yến mạch để phân lập Beauveria bassiana và Metrahizium anisopliae Tại Thụy Điển, Baath và ctv sử

dụng môi trường chứa Cu2+ để phân lập nấm gây bệnh côn trùng sống trong đất (trích dẫn bởi Phạm Thị Thùy, 2004)

Trong điều kiện phòng thí nghiệm, khả năng hình thành bào tử sau 14 ngày của

Beauveria bassiana tốt nhất trên môi trường PDA ở độ sâu 2 mm, trong khi nấm Verticillium lecanii hình thành bào tử tốt nhất trên môi trường YPDA và độ sâu

môi trường ảnh hưởng không đáng kể (Cnase and Osborne,1986; Ferguson, 1986) Nấm được nuôi trên môi trường có thêm urea, acid - aminoacetic, asparagine, NaNO3 và NH4Cl sẽ có độc tính cao và để kích thích sự phát triển

của Beauveria bassiana cần phải sử dụng các nguyên tố vi lượng như MnSO4, FeSO4, ZnSO4, CaCl2, Na2B4O4 ( trích dẫn bởi Võ Thị Thu Oanh, 2010)

Theo Jenkins và ctv (1993) bào tử được tạo ra trên môi trường có hàm

lượng pepton và dịch trích nấm men là 10-12gr/lít cho khả năng gây bệnh cao

nhất Sự tích trữ bên trong của bào tử chồi Beauveria từ môi trường có lượng

carbon và nitrogen bị giới hạn nhưng khả năng tồn tại sẽ lâu hơn khi sử dụng môi

trường cơ bản Vogel Khi nuôi trên môi trường rắn và bán rắn nấm Beauveria tạo

thành 3 loại bào tử là bào tử chồi (blastospore), bào tử đính (aerial) và bào tử chìm trong môi trường Tùy theo loại môi trường mà tạo ra loại bào tử, bào tử chồi sẽ được tạo ra nhiều hơn bào tử đính trong môi trường giàu dinh dưỡng (pepton - dextrose broth) (Võ Thị Thu Oanh, 2010)

Theo Kamp và ctv (2002) có sự khác biệt về tốc độ phát triển của sợi nấm

và tỷ lệ của bào tử nảy mầm theo thời gian nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng

Sự khác biệt này phụ thuộc vào thành phần dinh dưỡng của môi trường theo thời

gian nuôi cấy ngắn hoặc dài Tuy nhiên, Veen và ctv.(1986) bào tử nảy mầm của bào tử nấm Beauveria bassiana có tỷ lệ nảy mầm giống nhau và không phụ thuộc

vào loại môi trường nuôi cấy (trích bởi Võ Thị Thu Oanh, 2010)

+ Phương pháp nuôi cấy nấm côn trùng

Đối với phương pháp nuôi cấy, khi sử dụng phương pháp lên men chìm để sản xuất nấm côn trùng sẽ cho kết quả tốt, vì người ta xác định được khả năng

sinh bào tử chồi và lượng sinh khối sinh ra từ hai chủng nấm Beauveria bassiana

là rất cao (PhạmThị Thùy, 2004)

Hiện nay, ở nước ta chủ yếu nhân sinh khối bán thủ công ở qui mô phòng thí nghiệm Viện Bảo Vệ Thực Vật sử dụng phương pháp lên men xốp để nhân sinh khối nấm ký sinh côn trùng Đây là phương pháp đơn giản, dễ thu sinh khối, thu được nhiều bào tử đính và khả năng diệt sâu hại đạt từ 70% trở lên sau 7 – 12 ngày phun Viện lúa đồng bằng Sông Cửu Long đã hoàn thiện 1 qui trình sản xuất

chế phẩm từ nấm Beauveria bassiana (Biovip) cho chất lượng cao, ổn định, giá

thành rẻ Hiệu lực chế phẩm cũng được kiểm chứng trên nhiều thí nghiệm ở qui

mô từ nhỏ tới lớn cho thấy hiệu lực của chế phẩm sinh học Biovip này khá cao đối với rầy nâu 65 - 73,5% và bọ cánh cứng hại dừa 67 - 79,8% kéo dài từ 21 -

28 ngày sau khi phun (Võ Thị Thu Oanh, 2010)

Sản xuất bào tử Beauveria bassiana trên môi trường nuôi cấy lỏng (20g

men bia, 30g sucrose, hấp khử trùng), nuôi trong 3 ngày ở nhiệt độ 250C, bào tử được làm khô với silicagel sẽ có sức chống chịu cao nhưng không quá 90 ngày (Võ Thị Thu Oanh, 2010)

+ Nhiệt độ và độ ẩm

Nhiệt độ và độ ẩm là 2 yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm, mỗi loại nấm chỉ có khả năng phát triển trong một giới hạn nhiệt độ nhất định Nhiệt độ và ẩm độ thích hợp cho nấm trong phạm vi 25 - 300C và 80 - 90% Nếu trên hoặc dưới ngưỡng đó thì nấm phát triển yếu.Khi nhiệt độ quá cao thì bào tử nấm dễ bị chết hoặc bào tử không hình thành (Phạm Thị Thùy, 2004) Hai tác giả Grajek và Sobczak đã làm thí nghiệm cho nước không đều vào môi trường Czapek – Dox và xác định điều kiện ẩm độ thích hợp là 80% cho sự

sinh trưởng phát triển và hình thành bào tử của nấm Beauveria bassiana (trích

dẫn bởi Phạm Thị Thùy, 2004)

Kết quả nghiên cứu của Viện Bảo Vệ Thực Vật (1996) và Viện Sinh Học

Nhiệt Đới (1997) đã xác định nhiệt độ thích hợp cho nấm Beauveria bassiana và Metarhizium anisopliae phát triển ở nhiệt độ 25 - 300C, phát triển kém ở 10 -

150C, ẩm độ thích hợp trong khảng 80 - 90%, trên hoặc dưới nhiệt độ này sẽ

không hình thành bào tử hoặc bào tử sẽ phát triển yếu (Võ Thị Thu Oanh và ctv.,

2008; Phạm Thị Thùy, 2004)

Một trong những ảnh hưởng quan trọng cho nấm sinh trưởng và hình thành bào tử là nhiệt độ và ẩm độ, phạm vi nhiệt độ của nấm trong khoảng 5 - 350C, thích hợp nhất là 20 - 300C Nếu nhiệt độ thấp, nấm sinh trưởng chậm và nhiệt độ cao nấm sinh trưởng nhanh nhưng chóng già yếu Nhiệt độ dưới 100C và trên

350C thì sự hình thành bào tử không thể xảy ra, nhiệt độ nảy mầm của bào tử nấm trong khoảng 25 - 300C và chết ở 490C trong vòng 10 phút (Võ Thị Thu

Oanh và ctv., 2008)

Theo Mattew và ctv.(1997), Thomas và ctv (1997) và Ekesia (1999) Nhiệt

độ thích hợp cho sự phát triển cho sợi nấm là 25,50C, hình thành bào tử ở 240C

Bào tử Beauveria bassiana thuộc nhóm bào tử khô và nghèo dinh dưỡng do đó

sự nảy mầm và phát triển bị ức chế ở nhiệt độ dưới 100C Nhiệt độ tối ưu của

nấm là 220C - 260C, ở 300C sẽ phát triển chậm và 350C sẽ không hình thành bào

tử (trích bởi Võ Thị Thu Oanh, 2010)

Hallsworth và ctv (1999) đã đưa kết luận về sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến

trọng lượng thảm nấm trong nhân sinh khối Đó là, nhiệt độ tối ưu cho tạo sinh

khối của nấm Beauveria bassiana là 250C (Võ Thị Thu Oanh, 2010)

Kết quả nghiên cứu của Jianzhong và ctv (2003) cho thấy khả năng hình thành bào tử có độc tính cao của Beauveria bassiana trên mối (Optotermes formosanus) được xác định có liên quan đến nhiệt độ Ở 350C làm giảm khả năng sinh sản và lan truyền bệnh của nấm Kết luận rằng, sự nảy mầm của nấm phụ thuộc vào nhiệt độ, thời gian cần thiết cho 50% bào tử nảy mầm 14 - 16,6 và 14,8

- 18 giờ lần lượt ở 15, 22 và 280C (trích bởi Võ Thị Thu Oanh, 2010)

Kết quả nghiên cứu in vitro của Gustavo và ctv (2006) cho thấy bào tử Beauveria bassiana nảy mầm ở 15 - 350C trong điều kiện ẩm độ bảo hòa Nhiệt

độ thấp hơn 150C và cao hơn 350C thì quá trình nảy mầm kéo dài nhưng tỉ lệ nảy mầm vẫn đạt trên 95% Thời gian bào tử nảy mầm kéo dài khi ẩm độ giảm từ 96% xuống 92%, nếu ẩm độ dưới 92% thì cho dù đến 72 giờ cũng không nảy mầm (trích bởi Võ Thị Thu Oanh, 2010)

+ Ánh sáng

Nấm côn trùng phát triển tốt trong điều kiện ánh sáng yếu Chỉ cần một lượng ánh sáng nhỏ trong thời gian từ 6 - 8 giờ cũng đủ làm cho nấm côn trùng phát triển (Phạm Thị Thùy, 2004)

Ánh sáng được xem là yếu tố quan trọng trong sinh vật và hầu hết các nấm

ký sinh, đặc biệt liên quan tới sợi nấm, sự phóng thích và sự sống sót của bào tử

Theo Nguyễn Ngọc Tú và ctv (1997) đối với nấm Beauveria bassiana điều kiện

sáng tối ảnh hưởng không đáng kể đến sự phát triển và tạo bào tử của nấm này

(Võ Thị Thu Oanh và ctv., 2008)

Ánh sáng đóng vai trò rất quan trọng cho sự phát triển và hình thành của

sợi nấm Beauveria bassiana, sự chiếu sáng thường xuyên sẽ kích thích sự tạo bào

tử và sự phát triển của sợi nấm thì trong điều kiện tối hoàn toàn (Võ Thị Thu Oanh, 2010)

Ánh sáng có tác dụng xúc tiến bào tử nảy mầm và hình thành bào tử, mặt khác ánh sáng cũng có tác dụng ức chế và diệt nấm Tia tử ngoại có thể giết chết bào tử Bào tử nấm bạch cương có tính thích nghi khá mạnh, chẳng hạn sau 91 giờ dưới nắng mới mất khả năng sống, cũng có thí nghiệm nhiệt độ 32oC ở dưới

nắng trong 5 giờ có thể mất sức sống (Trần Văn Mão, 2002) Ánh sáng tán xạ có tác dụng kích thích bào tử nảy mầm, tác dụng tới sinh trưởng của sợi nấm và hình thành bào tử (trích bởi Lê Thị Thanh Thảo, 2006)

Qua nhiều năm sản xuất nấm côn trùng, Viện Bảo Vệ Thực Vật xác định

nấm Beauveria bassiana phát triển tốt trong điều kiện ánh sáng yếu, chỉ cần một

lượng ánh sáng nhỏ trong ngày với thời gian 6 - 8 giờ cũng đủ cho nấm phát triển tốt Vì vậy, phòng nuôi cấy nấm cần phải che ánh sáng mặt trời để hạn chế tia tử ngoại (Phạm Thị Thùy, 2004)

Theo Milner và ctv (1991) trong 24 giờ nuôi cấy, ánh sáng ảnh hưởng nghịch với sự nảy mầm của bào tử nấm Beauveria bassiana Trong 11 nguồn

sáng có màu sắc khác nhau thì ánh sáng màu xanh lam, vàng, đỏ, xanh lá cây thì

có tác dụng kích thích sự hình thành bào tử của nấm Beauveria bassiana (trích

bởi Võ Thị Thu Oanh, 2010)

+ Độ pH của môi trường nuôi cấy

Phạm vi nấm côn trùng ưa sống ở độ pH từ 3,5 - 8,0, song nấm côn trùng

ưa môi trường axit và nấm phát triển tốt ở độ pH từ 5,5 - 6 (Phạm Thị Thùy, 2004)

Mỗi loại nấm đều có giới hạn pH môi trường thích hợp cho sự phát triển và tạo bào tử Phạm vi nấm côn trùng sống ở pH từ 4,0-8,0 nhưng ưa thích ở môi trường axit và thích hợp ở độ pH từ 5,5-6,0 Kết quả nghiên cứu của Viện Sinh Học Nhiệt đới (1997) cho biết trong giới hạn pH từ 4,0 - 10,0 không ảnh hưởng

nhiều đến sự phát triển của nấm Beauveria bassiana (Võ Thị Thu Oanh, 2010)

Theo Phạm Thị Thùy (2004) để duy trì tính ổn định của pH trong môi tường nuôi cấy nấm côn trùng cần phải bổ sung thêm một lượng khoáng chất cần thiết như

KH2PO4 và MgSO4.7H2O

Nói chung, nấm thích hợp với điều kiện hơi chua đến trung tính Nấm

Beauveria bassiana có tính thích nghi rộng, phạm vi nảy mầm là pH từ 3-9,4;

nảy mầm nhiều nhất là pH = 4,4 Sợi nấm sinh trưởng ở pH từ 4,5-5,0; hình thành bào tử tốt nhất ở pH = 6 Các nhà khoa học đã sử dụng hợp chất cacbon làm giảm pH, sử dụng protein làm tăng pH (Trần Văn Mão, 2002)

Nấm Beauveria bassiana ưa môi trường axit và phát triển thích hợp nhất ở

độ pH từ 5,5 - 6 Vì vậy, Phạm Thị Thùy đã bổ sung vào môi trường một lượng nhỏ KH2PO4 và MgSO4.7H2O, mục đích là để duy trì tính ổn định pH trong môi trường nuôi cấy (Phạm Thị Thùy, 2004)

Huber và ctv (1985) cho biết pH từ 3 - 9 không ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Beauveria bassiana Theo Gloral (1970) nấm Beauveria bassiana

có khả năng điều chỉnh môi trường và pH thích hợp cho sự phát triển từ 5,6 - 6,0

Lapp và Goralv(1980) thông báo pH tối ưu cho nấm Beauveria bassiana là 6,2 – 6,3 (Võ Thị Thu Oanh và ctv., 2007)

+ Thuốc hóa học

Theo Trần Văn Hai và ctv., 2008 cho thấy thuốc trừ bệnh có ảnh hưởng đến

sự phát triển và hình thành bào tử của nấm Beauveria bassiana là thuốc Score

250EC, Carban 50SC Hai loại thuốc này ảnh hưởng mạnh đến sự sinh trưởng và phát triển của các loại nấm ngay cả khi sử dụng ở nồng độ thấp Các loại thuốc như Ridomil Gold 68WP, Validan 3DD, Anvil 5SC, Tilt super 300EC, Kasumin 2L thì hầu hết không ảnh hưởng khi sử dụng ở nồng độ bằng hoặc thấp hơn khuyến cáo

Theo Moorehouse và ctv (1992) các loại alrin, cypermethrin, diazinon,

dichlorvos, hostathion, pirimicarb, nếu sử sụng theo đúng liều lượng khuyến cáo

sẽ không ảnh hưởng đến sự nảy mầm của bào tử nấm Beauveria bassiana Tuy

nhiên, nhóm thuốc trừ sâu monocrotophos, carbofuran, azinphos ethyl + BFMC với liều lượng 0,5kg a.i/ha làm giảm một cách có ý nghĩa sự nảy mầm của bào tử

Beauveria basssiana Sử dụng carbaryl ở các nồng độ 0,1 ; 1,0 ;10 ; 100 và 1000 ppm sẽ gây ức chế sự nảy mầm của bào tử Beauveria bassiana (Võ Thị Thu

Oanh,2010)

1.8 Một số thành tựu về ứng dụng nấm trắng Beauveria bassiana

Theo Milner (1991) nấm Beauveria bassiana đã được sử dụng ở rất nhiều

nước trên thế giới để phòng trừ nhiều đối tượng sâu hại cây trồng thuộc bộ cánh vẩy (Lepidoptera), bộ cánh cứng (Coleoptera), bộ cánh màng (Hymenoptera), bộ cánh nửa cứng (Hemiptera), bộ hai cánh (Diptera), bộ cánh thẳng (Orthoptera),… đạt kết quả tốt, đặc biệt là những loài sâu róm thông, bọ hại dừa, châu chấu hại tre, mía, mối đất hại cây ăn quả, sùng hại mía (Phạm Thị Thùy, 2004)

Theo Rao (1975) tỷ lệ chết của rầy Nephotettix virescens là 100% qua 3 ngày Họ thấy rằng nấm Beauveria bassiana có nhiều triển vọng trong đấu tranh

sinh học chống lại các loại rầy hại lúa, khi tiểu khí hậu trên đồng ruộng thuận lợi

cho sự phát triển của nấm Beauveria bassiana (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Thị

Cửu Hương Giang, 1997)

Nghiên cứu ra các phương pháp bảo quản 2 chi nấm Beauveria và Metarhizium trong điều kiện Việt Nam (Pham Thị Thùy, 2004)

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu sử dụng chế phẩm nấm Beauveria bassiana

đã được tiến hành từ năm 1979 và đến nay vẫn còn tỏ ra có tác dụng đối với sâu róm thông và một số loài sâu hại cây trồng khác (Trần Văn Mão, 2002)

Cho đến nay Việt Nam đã có 13 loại chế phẩm trừ sâu sinh học được sản

xuất từ nấm Beauveria bassiana như: Beauveria, Biobeauve 5DP, Biovip, đã

đăng kí vào danh mục thuốc bảo vệ thực vật được phép sử dụng 2010 (Võ Thị Thu Oanh, 2010)

Tại trường Đại học Cần Thơ hiện nay cũng đã có những nghiên cứu về hiệu

lực của nấm Beauveria bassiana trong điều kiện nhà lưới trên một số loại côn

trùng gây hại như rệp sáp, rầy nâu, sâu ăn tạp, sâu cuốn lá đậu phộng cho hiệu quả cao trên 80% sau 9 dến 14 ngày xử lý (Lê Thị Tú Xinh, 2009; Nguyễn Thị Hồng Diễm, 2009; Nguyễn Đức Toàn 2009)