Nghiên cứu sự tăng trưởng của cây IN VITRO định tính và khảo sát khả năng kháng khuẩn của hợp chất QUINON trong lá cây RIVINA HUMILIS l

Một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến việc sản xuất các hợp chất thứ cấp từ tế bào thực vật là sự phân hóa hình thái.Nhiều hợp chất thứ cấp được sản xuất trong suốt quá trình p

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NÔNG NGHIỆP

GVHD: TS Đỗ Thường Kiệt

SVTH: Trần Đình Thiện MSSV: 1153010785 Khóa: 2011-2015

Tp Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2015

i

LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện cho em được học tập và rèn luyện trong môi trường tốt nhất

Em xin chân thành cảm ơn tất cả các quý thầy, cô giáo bộ môn của khoa Công nghệ sinh học đã tận tình giảng dạy và trang bị cho em những kiến thức cần thiết trong suốt thời gian học đại học

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy Đỗ Thường Kiệt và cô Nguyễn Trần Đông Phương đã trực tiếp hướng dẫn và truyền đạt cho em những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Chân thành cảm ơn các anh chị và các bạn trong phòng thí nghiệm Công nghệ

tế bào và phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh đã nhiệt tình giúp đỡ mình trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Cuối cùng, con xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình Cảm ơn những tình cảm mà ông bà, ba mẹ và anh chị đã dành cho con, sự ủng hộ và động viên của gia đình đã giúp con vững bước hơn trên con đường học tập và đường đời

Tp Hồ Chí Minh, ngày 05 tháng 5 năm 2015

Trần Đình Thiện

iii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng II.1: Cách bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ javel và

thời gian khử trùng đến khả năng khử trùng và nảy mầm của mẫu hạt Rivina humilis

L 33Bảng II.2: Cách bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của BA đến sự tăng

trưởng của cây con Rivina humilis L 34

Bảng II.3: Cách bố trí thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của kinetin đến sự

tăng trưởng của cây con Rivina humilis L 35

Bảng II.4: Cách bố trí thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của ND đến sự tăng

trưởng của cây con Rivina humilis L 36

Bảng III.1: Tỉ lệ mẫu vô trùng và thời gian nảy mầm của hạt khi được khử trùng bởi javel ở các nồng độ và thời gian khử trùng khác nhau 42

Bảng III.2: Chiều cao cây, số lá/cây và đặc điểm cây Rivina humilis L trên

môi trường có chứa BA với các nồng độ khác nhau 44

Bảng III.3: Chiều cao cây, số lá/cây và đặc điểm cây Rivina humilis L trên

môi trường có chứa kinetin với các nồng độ khác nhau 46

Bảng III.4: Chiều cao cây, số lá/cây và đặc điểm cây Rivina humilis L trên

môi trường có chứa ND với các nồng độ khác nhau 48Bảng III.5: Kết quả phản ứng Borntraeger 51

Bảng III.6: Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết lá cây Rivina humilis L 53

iv

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình I.1: Cây Rivina humilis L 4

Hình I.2: Các con đường tổng hợp nên hợp chất thứ cấp 14

Hình I.3: Benzoquinon 19

Hình I.4: Naphthoquinon 20

Hình I.5: Bình sắc ký lớp mỏng 24

Hình II.1: Sơ đồ nhuộm hai màu 37

Hình II.2: Bản sắc ký 38

Hình III.1 Hạt cây Rivina humilis L nảy mầm trên môi trường MS (sau 30 ngày nuôi cấy) 43

Hình III.2: Cây con in vitro (đã loại bỏ rễ) tại thời điểm 6 tuần nuôi cấy trên môi trường có bổ sung BA ở các nồng độ khác nhau 45

Hình III.3: Cây con in vitro (đã loại bỏ rễ) tại thời điểm 6 tuần nuôi cấy trên môi trường có bổ sung kinetin ở các nồng độ khác nhau 47

Hình III.4:Cây con in vitro (đã loại bỏ rễ) tại thời điểm 6 tuần nuôi cấy trên môi trường có bổ sung ND ở các nồng độ khác nhau 49

Hình III.5: Cấu tạo giải phẫu thân cây Rivina humilis L 50

Hình III.6: Cấu tạo giải phẫu lá cây Rivina humilis L 50

Hình III.7: Sắc ký bản mỏng dịch trích quinon trong lá Rivina humilis L 52

Hình III.10: Vòng kháng khuẩn đối với Pseudomonas aeruginosa 54

Hình III.9: Vòng kháng khuẩn đối với Escherichia coli 54

Hình III.8: Vòng kháng khuẩn đối với Staphylococus aureus 54

Hình III.11: Vòng kháng khuẩn đối với Bacillus aureus 55

v

MỤC LỤC

I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

I.1 Giới thiệu đặc tính sinh học cây Rivina humilis L 3

I.1.1 Họ Thương lục (Phytolaccaceae) 3

I.1.2 Mô tả cây Rivina humilis L 4

I.1.3 Phân bố và sinh thái 5

I.1.4 Thành phần hóa học 5

I.1.5 Tác dụng dược lý 5

I.1.6 Các nghiên cứu đã thực hiện 6

I.2 Nuôi cấy mô 6

I.2.1 Vai trò của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 6

I.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô 7

I.2.3 Sự phát sinh hình thái chồi bất định 9

I.3 Sự thu nhận hợp chất thứ cấp 10

I.3.1 Giới thiệu 10

I.3.2 Phân loại 11

I.3.3 Nuôi cấy mô tế bào thực vật sản xuất hợp chất thứ cấp 14

I.3.4 Quinon và phương pháp chiết tách 18

I.3.5 Phương pháp chiết tách 23

I.3.6 Định tính quinon 23

I.3.7 Sắc ký lớp mỏng 24

I.4 Vi khuẩn gây bệnh thường gặp 25

I.4.1 Staphylococus 25

I.4.2 Escherichia coli 28

vi

I.4.3 Pseudomonas aeruginosa 28

I.4.4 Bacillus cereus 29

II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 32

II.1 Vật liệu 32

II.2 Phương pháp nghiên cứu 32

II.2.1 Nuôi cấy cây con in vitro từ hạt Rivina humilis L 32

II.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của BA đến sự tăng trưởng của cây con Rivina humilis L in vitro 34

II.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của kinetin đến sự tăng trưởng của cây con Rivina humilis L in vitro 35

II.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của ND đến sự tăng trưởng của cây con Rivina humilis L in vitro 36

II.2.5 Quan sát hình thái giải phẫu cây 37

II.2.6 Định tính quinon 37

II.2.7.Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết lá cây Rivina humilis L 39

II.2.8 Xử lý thống kê 40

III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42

III.1 Sự tạo cây con từ hạt Rivina humilis L 42

III.2 Ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự tăng trưởng của cây con in vitro 44

III.3 Ảnh hưởng của nồng độ kinetin đến sự tăng trưởng của cây con in vitro 46

III.4 Ảnh hưởng của nồng độ ND đến sự tăng trưởng của cây con in vitro 48

III.5 Nhuộm quinon trong lát mỏng tế bào 50

III.6 Phản ứng Borntraeger 51

vii

III.7 Sắc ký lớp mỏng 52

III.8 Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết lá cây Rivina humilis L 53

IV Kết luận và đề nghị 58

IV.1 Kết luận 58

IV.2 Đề nghị 58

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Rivina humilis L là một loài thực vật có hoa thuộc họ Phytolaccaceae, là một

cây thân thảo lâu năm, chiều cao có thể lên đến khoảng 1 m Sự phân bố tự nhiên ban đầu bị hạn chế ở châu Mỹ, kéo dài từ Argentina lên tới miền nam nước Mỹ

Rivina humilis L chủ yếu sống ở vùng nhiệt đới ẩm, nhưng chỉ đòi hỏi một lượng ít

ánh sáng và có thể chịu được tất cả các ánh sáng màu Rivina humilis L có thể sống

trên loại đất có hàm lượng muối cao, có thể chịu đựng được nhiệt độ thấp [37] Tất cả các bộ phận của cây đều độc, đặc biệt rễ và lá có chứa lượng chất độc lớn hơn so với những phần còn lại của cây [25] Tuy nhiên, các loài chim có thể ăn

quả mà không bị ngộ độc Khan et al (2011) đã thử nghiệm chất chiết xuất từ quả

không độc hại đối với chuột nhưng phần nào lại độc hại đối với con người [28] Quả

được sử dụng để nhuộm màu vải tại Cape Verde [16] Khan et al (2012) xác định

mười sắc tố betalain trong quả, bao gồm cả betaxanthins và betacyanins; xác nhận các hoạt động chống oxy hóa quan trọng trong cả hai cũng như khả năng gây độc từ

betaxanthins.Rivina humilis L đã được sử dụng như một loại thuốc dân gian để điều

trị cảm lạnh, tiêu chảy, đi tiểu khó, đầy hơi, bệnh lậu, bệnh vàng da và đau buồng trứng [25]

Trong dịch chiết lá của Rivina humilis L có rất nhiều các hợp chất thứ cấp

như: flavonoids, alkaloids, terpenoids, coumarins, steroids, phytosteroids và đặc biệt là quinon chiếm phần lớn [23] Quinon có tác dụng trong sinh học và dược, chống khối u, ức chế sinh tổng hợp PGE2, phòng chống bệnh tim mạch, có thể được

sử dụng như một thuốc thử hóa học và đặc biệt là khả năng kháng khuẩn [22] Vì

vậy chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu sự tăng trưởng cây in vitro, định tính

và khảo sát khả năng kháng khuẩn của hợp chất quinon trong lá cây Rivina

humilis L.”nhằm bước đầu xây dựng quy trình nhân giống, xác định hoạt tính của

hợp chất trong cây và tạo tiền đề phát huy lợi ích của quinon đặc biệt khả năng kháng khuẩn

2

3

I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I.1 Giới thiệu đặc tính sinh học cây Rivina humilisL

I.1.1 Họ Thương lục (Phytolaccaceae)

Họ Thương lục có danh pháp khoa học là phytolaccaeae, là một họ trong thực vật có hoa, có hai lá mầm chứa khoảng 14 chi với tổng cộng 45 loài có nguồn gốc

từ châu Mỹ Ở nước ta có 4 loài được du nhập để trồng làm kiểng và bây giờ cũng trở thành cây hoang dại

Về phân loại, họ Thương lục được chia làm 3 phân họ:

 Phân họ Phytolaccoideae bao gồm 4 chi với đặc trưng rễ củ mập, chùm hoa đối diện với lá song không gắn trước lá, 5 lá đài Có ít nhất 5 lá noãn trong bầu noãn, hoa có năm cánh

 Phân họ Rivinioideae bao gồm 9 chi, chỉ có một lá noãn trong bầu noãn, thường chỉ có 4 cánh hoa

 Phân họ Agdestidoideae chỉ có một chi tập trung chủ yếu ở vùng Trung Mỹ

Họ Thương lục bao gồm những cây thân thảo hoặc thân bụi sống nhiều năm cao từ 1 tới 3m Thân thường hình trụ, màu xanh có thể có màu tím, ít phân nhánh

Lá mọc so le hoặc đối xứng, gốc lá tù, đầu lá nhọn Hoa thường có màu trắng, mọc thành chùm đối diện với lá nhưng không gắn trước lá Quả mọng, thường có hình cầu, khi chín có màu sắc sặc sỡ, dễ thu hút sự chú ý của con người và các loài chim

ăn quả, hạt màu đen, hình thận hoặc hình tròn

Hầu hết cây thuộc họ Thương lục đều có công dụng trong y học trong đó nổi

bật như: Thương lục, Rivina humilis L., Mohlana, Flueckigera, Villamillia

Loài: Rivina humilis L.

Rivina humilis L là một cây thân thảo lâu năm chiều cao có thể lên đến

khoảng 1 m Thân thẳng, có phân nhánh, cành có góc cạnh, nhẵn hoặc có lông tại các nhánh Lá hình trứng đến elip, có thể dài đến 12 cm, cuống dài, chóp lá nhọn, có phủ lông mịn ở cả hai mặt, đặc biệt là dọc theo gân lá Lá có mùi khó chịu khi bị nghiền nát Cụm hoa có thể mọc ở ngọn hoặc nách lá, dài đến 15 cm, mọc thẳng hoặc cong, mảnh mai Hoa nhỏ, lưỡng tính, cuống hoa dài lên đến 5 mm, phía dưới

có lá bắc rất nhỏ, dài khoảng 2-3 mm, màu xanh lá cây, màu trắng hoặc màu hồng, liên tục; nhị 4 túi phấn, hình trứng, 1 ô Vòi nhụy hơi cong, nướm nhụy tròn Quả có màu đỏ hoặc màu da cam, 3-4 mm, quả có một hạt, đường kính 3 mm Bộ lượng nhiễm sắc thể của cây 2n=126 [39] [40]

Rivina humilis L chủ yếu sống ở vùng nhiệt đới ẩm, nhưng chỉ đòi hỏi một

lượng ít ánh sáng và có thể chịu được tất cả các ánh sáng màu Rivina humilis L có

thể sống trên loại đất có hàm lượng muối cao, có thể chịu đựng được nhiệt độ thấp [37] Hạt có thể nảy mầm mà không cần thông qua các giai đoạn tiền xử lý, hoa có thể trổ tất cả các mùa trong năm tạo điều kiện thuận lợi cho việc lưu trữ giống [34]

Hình I.1: Cây Rivina humilis L

5

I.1.3 Phân bố và sinh thái

Sự phân bố tự nhiên ban đầu bị hạn chế trong châu Mỹ, kéo dài từ Argentina lên tới miền nam nước Mỹ Hiện nay, nó đã phân bố rộng rãi đến các nước khác và

đã trở thành cây xâm hại ở nhiều nơi trên Thái Bình Dương và một số ít các nước ở châu Phi và châu Á

Rivina humilis L chủ yếu sống ở vùng nhiệt đới ẩm, nhưng nó đòi hỏi một

lượng ít ánh sáng và có thể chịu được tất cả các ánh sáng màu Nó có thể sống trên loại đất có hàm lượng muối cao, có thể chịu đựng được nhiệt độ thấp [37] Hạt có thể nảy mầm mà không cần thông qua các giai đoạn tiền xử lý, hoa có thể trổ tất cả các mùa trong năm tạo điều kiện thuận lợi cho việc lưu trữ giống [34]

I.1.4 Thành phần hóa học

Thành phần chính trong lá Rivina humilis L là carbohydrate và quinon Ngoài

ra còn có các hợp chất khác như tannin, saponin, flavonoid, alkaloid, cardiac glycoside, terpenoid, coumarin, steroid nhưng chỉ có hàm lượng thấp [23]

Trong lá Rivina humilis L có hàm lượng quinon rất lớn, quinon có tác dụng

trong sinh học và dược học, chống khối u, ức chế sinh tổng hợp PGE2, phòng chống bệnh tim mạch, có thể được sử dụng như một thuốc thử hóa học và đặc biệt là khả năng kháng khuẩn [22]

I.1.5 Tác dụng dược lý

Rivina humilis L đã được sử dụng như một loại thuốc dân gian để điều trị cảm

lạnh, tiêu chảy, đi tiểu khó, đầy hơi, bệnh lậu, bệnh vàng da và đau buồng trứng [25]

Mặc dù các loài chim có thể ăn trái mà không bị ngộ độc Khan et al (2011)

đã thử nghiệm chất chiết xuất từ trái không độc hại đối với chuột Tuy nhiên, khi

người ăn phải trái cây Rivina humilis L sẽ bị tê miệng, trong vòng 2 giờ đầu sẽ cảm

thấy cảm giác ấm áp trong cổ họng và dạ dày Tiếp theo là ho, khát nước, mệt mỏi, ngáp kèm theo nôn mửa và tiêu chảy (đôi khi có máu) Rễ và lá có chứa lượng chất độc lớn hơn so với những phần còn lại của cây [25]

6

Quả mọng có chứa một sắc tố gọi là rivianin hoặc rivinianin, rất giống với

betanin, sắc tố được tìm thấy trong củ cải đường (Beta vulgaris) [24] Ngoài ra trong trái cây còn chứa betaxanthin humilixanthin [14] Rivina humilis L cũng đã được chứng minh là có hoạt động tương tự hormone chống lại loài muỗi vằn (Culex

quinquefasciatus) [26]

I.1.6 Các nghiên cứu đã thực hiện

Năm 2012, Mujeera Fathima và Florida Tilton đã nghiên cứu phân tích thành

phần các hợp chất có trong lá cây Rivina humilis L

Năm 1997, Nellis, David W đã nghiên cứu nhân giống in vitro cây Rivina

humilis L từ đoạn thân mang chồi bên và chồi ngọn từ cây ngoài tự nhiên

I.2 Nuôi cấy mô

I.2.1 Vai trò của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật

I.2.1.1 Auxin

Auxin rất cần thiết cho sự phân chia và tăng trưởng của tế bào nên có vai trò quan trọng trong sự phát sinh hình thái thực vật Auxin được tổng hợp trong ngọn thân, trong mô phân sinh (ngọn và lóng) và lá non (tức là nơi có sự phân chia tế bào nhanh) Sau đó, auxin di chuyển tới rễ và tích tụ trong rễ [11] [31]

Auxin có tác động mạnh mẽ lên sự tăng trưởng tế bào, sự acid hóa vách tế bào, cảm ứng sự phân chia tế bào, kích thích sự hình thành mô sẹo, sự phát triển rễ và kích thích sự phân hóa mô dẫn [11]

Auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ nhưng cản sự tăng trưởng của các sơ khởi rễ này [9] Auxin được vận chuyển hướng gốc, tích lũy ở phần gốc của khúc cắt trụ hạ diệp của cà chua và cảm ứng sự hình thành rễ bất định [21] Trong sự tạo rễ, auxin cần phối hợp với các vitamin (như thianin mà rễ không tổng hợp được), acid amin (như arginin), nhất là các hợp chất orthor-diphenolic (như acid cafeic, acid chlorogenic) [11]

Trong số các loại auxin được sử dụng trong nuôi cấy in vitro, 2,4-D được xem

là một auxin mạnh, có tác động hình thành mô sẹo Tuy nhiên, nếu sử dụng ở nồng

7

độ quá cao, auxin này sẽ gây độc cho tế bào, thậm chí gây biến đổi di truyền Trong

sự hình thành sơ khởi rễ bất định, sử dụng NAA, IAA hay IBA thường đạt hiệu quả cao hơn so với 2,4-D Tuy nhiên, tác động của auxin ngoại sinh trong sự phát sinh

cơ quan còn tùy thuộc vào trạng thái sinh lý cũng như hàm lượng chất điều hòa nội sinh trong nuôi cấy Trong suốt quá trình tạo rễ bất định, hàm lượng IAA nội sinh

tích lũy tăng cao Điều này được giải thích là do auxin ngoại sinh ức chế hoạt động

của enzyme IAA oxidase và IBA có khả năng chuyển đổi thành IAA do đó cũng làm tăng nhanh lượng IAA nội sinh, kích thích sự hình thành rễ bất định

I.2.1.2 Cytokinin

Mô phân sinh ngọn rễ là nơi tổng hợp chủ yếu các cytokynin tự do cho cả cơ thể thực vật Ở rễ, cytokinin cản sự kéo dài nhưng kích thích tăng rộng tế bào (sự tăng trưởng củ) Cytokinin ngăn cản sự lão hóa, thúc đẩy sự trưởng thành của diệp lạp và là nhân tố chính điều khiển quá trình tái sinh mạch giúp cho sự tạo chồi [31] Trong sự hình thành chồi, cytokinin có thể được xử lý riêng rẽ hay phối hợp các loại

để làm tăng khả năng hình thành và chất lượng chồi

Ở nồng độ cytokinin cao sẽ đưa đến kết quả là tạo thành các cụm chồi Số lượng chồi hình thành tùy thuộc vào nồng độ cytokinin Tuy nhiên, cũng có những bất lợi nhất định trong việc điều chỉnh nồng độ để cảm ứng tạo nhiều chồi Cytokinin ở nồng độ thấp kích thích sự phát triển chồi nách, nồng độ cao hơn sẽ cảm ứng hình thành chồi bất định nhưng chồi rất khó ra rễ

Ở một số loài thực vật, mặc dù sự hình thành chồi được cảm ứng bởi cytokinin nhưng chồi không xuất hiện cho đến khi khúc cắt được chuyển sang môi trường giảm hoặc không có cytokinin Cytokinin cần cho giai đoạn cảm ứng tạo chồi nhưng kìm hãm sự kéo dài của chồi Những vấn đề này có thể khắc phục bằng cách giảm nồng độ chất điều hòa sau một hoặc vài lần cấy chuyền để chồi được phát triển tốt nhất

I.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô

 Ánh sáng

8

Ánh sáng có tác động đến sự tăng trưởng và khả năng phát sinh hình thái của

tế bào trong nuôi cấy in vitro Mỗi loài thực vật khác nhau có những đáp ứng khác

nhau với từng loại ánh sáng, cường độ và thời gian chiếu sáng khác nhau

Cường độ chiếu sáng cao làm tăng sự thoát hơi nước, môi trường nuôi cấy bị khô và nước trong tế bào sẽ giảm xuống gây ảnh hưởng đến sự phân chia và tăng trưởng của chúng

Cường độ chiếu sáng yếu làm ảnh hưởng đến sự dự trữ chất dinh dưỡng của cây vì sự quang hợp kém hơn sự hô hấp

 Nhiệt đô

Nhiệt độ trong khoảng 17-250C thường được áp dụng để cảm ứng sự tạo mô sẹo và tăng trưởng của tế bào nuôi cấy Nhưng mỗi loài thực vật sẽ thích hợp với

một nhiệt độ khác nhau Toivonen et al (1992) nhận thấy khi giảm nhiệt độ trong

quá trình nuôi cấy sẽ làm tăng lượng acid béo tổng số trong mỗi tế bào (tính theo trọng lượng khô) [3]

 pH

Độ pH của môi trường ảnh hưởng đến sự hòa tan các muối khoáng cần thiết cho cây Người ta thường chỉnh pH khoảng 5.7-5.8, đây là mức tốt để cây có thể hấp thụ muối khoáng

 Sự thoáng khí

Quá trình quang tự dưỡng diễn ra một cách tự nhiên nhờ sự hiện diện của khí

CO2 trong không khí như một nguồn cung cấp carbon Trong nuôi cấy in vitro

truyền thống, nồng độ CO2 trong bình nuôi cấy giảm trong quá trình quang hợp làm giảm khả năng quang tự dưỡng.Thông thoáng khí giúp cây trong nuôi cấy mô hô hấp và quang hợp tốt [5]

 Muối khoáng

Nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với nhu cầu của cây ngoài tự nhiên Vì vậy, việc bổ sung đầy đủ các khoáng đa lượng và vi lượng là điều cần thiết

9

 Nguồn Carbon

Chủ yếu cho mô nuôi cấy là đường Mô tế bào nuôi cấy có sự quang hợp giới hạn, vì vậy người ta cần thêm glucid cần thiết cho sự tăng trưởng của mô vào môi trường nuôi cấy

 Vitamin

Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau, các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamin HCl (vitamin B1), pyridoxin HCl (vitamin B6), acid nicotinic, myo-inositol [5]

 Agar

Agar là một polyosid có trọng lượng phân tử cao, được chiết ra từ rong biển loại gelidium Có tác dụng làm giá thể giúp mô nuôi cấy không bị ngập trong môi trường gây chết mô do thiếu oxi

I.2.3 Sự phát sinh hình thái chồi bất định

Sự phát sinh hình thái ở thực vật là sự phát triển của tế bào, mô hay cơ quan ở thực vật Sự phát sinh hình thái ở thực vật phụ thuộc vào hai quá trình căn bản: sự điều hòa hướng kéo dài tế bào và sự kiểm soát vị trí và hướng phân chia của tế bào Chồi bất định xuất hiện không chỉ liên hệ với mô chóp mà còn xuất hiện gần vết thương, gần chỗ vết cắt, gần cùng phát sinh libe-mộc hoặc ngoài biểu bì, vì vậy chồi có thể có nguồn gốc nội sinh hoặc ngoại sinh do một sự khử phân hóa các tế bào trưởng thành Chúng cũng khởi sự bằng những phân chia tế bào và sắp xếp tế bào giống như sinh mô chóp và có mạch gắn liền với mạch của thân [9]

Chồi phân sinh ngọn có thể từ các tế bào biều bì, mô hàng rào, mô khuyết hay

mô bao quanh mạch của mô cấy Trước khi phân hóa để hình thành tầng phát sinh của chồi được tạo mới, tế bào đã phân hóa phải trải qua quá trình tái hoạt động Sự tái hoạt động này có thể được cảm ứng trên cây nguyên bằng cách đàn áp các hiệu ứng cản tương quan (gỡ ưu tính ngọn bằng cách cắt bỏ chồi ngọn) hay trên mô cấy nhờ các môi trường nuôi cấy có bổ sung chất điều hòa thích hợp Theo Buvat, có

Sau đó là bước chuyển tiếp từ tế bào ở trạng thái mô phân sinh thứ cấp sang trạng thái mô phân sinh sơ cấp có khả năng sinh cơ quan Có sự phân chia không bào thành những không bào nhỏ Tế bào có thể tích nhỏ dần, vách mỏng, tế bào chất đậm đặc, nhân và hạch nhân rất to [15]

Tiếp theo là giai đoạn tái phân hóa của mô phân sinh sơ cấp Tế bào trở lại trạng thái mô phân sinh thứ cấp Sự tái phân hóa cũng trải qua hai bước: bước một,

tế bào trở về trạng thái mô phân sinh hoạt động, các không bào trương nước và hợp thành không bào trung tâm, kích thước tế bào gia tăng, ti thể dần trở về hình dạng đặc trưng; bước hai, các lạp phân hóa, các chất sống căn bản (hạch nhân, tế bào chất…), chất dự trữ, các chất tiết (tannin, tinh dầu…) được tổng hợp Sau đó, các tế bào này có thể trở lại giai đoạn phân chia tế bào mới hay trực tiếp phân hóa mà không qua sự phân chia tế bào [11]

I.3 Sự thu nhận hợp chất thứ cấp

I.3.1 Giới thiệu

Ở thực vật có những chất đóng vai trò quan trọng trong việc cấu trúc nên cơ thể, những chất đó được gọi là những hợp chất sơ cấp Gồm các polysaccharide, đường, protein và chất béo Ngoài những chất đó ra, còn có những hợp chất khác có nồng độ ít hơn (M≤ 1500 amu) được gọi là các hợp chất thứ cấp, gồm có alkaloid, terpenoid, phenolic, steroid và flavonoid Các chất này rất đa dạng về cấu trúc và kích thước và được tìm thấy trong nhiều loài thực vật khác nhau, mỗi loài có một

Các hợp chất thứ cấp có thể được sản xuất trong những tế bào đặc biệt như tế bào tuyến tiết, lông tơ biểu mô nơi mà chúng được tiết ra có chức năng như các chất xua đuổi hay dẫn dụ Một trong các chức năng dể nhận thấy nhất ở các chất thứ cấp đó là có vai trò sinh vật hóa học trong cơ chế bảo vệ cơ thể chống lại các tác nhân gây bệnh và xâm hại

I.3.2 Phân loại

Các hợp chất thứ cấp bao gồm nhiều loại và được sắp xếp thành những nhóm khác nhau Việc phân loại các hợp chất thành một nhóm thường không phải bởi một định nghĩa duy nhất, cũng như ranh giới của một nhóm thường không rõ ràng

đỏ, một số khác không có màu cũng thuộc nhóm flavonoid Trong thực vật cũng có

I.3.2.3 Saponin

Saponin còn gọi là saponoid do chữ latinh sapo có nghĩa là xà phòng, là một nhóm glycoside lớn, gặp rộng rãi trong thực vật Người ta cũng phân lập được saponin trong động vật như hải sâm, cá sao

Saponin có một số tính chất đặc biệt như: làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước, có tác dụng nhũ tương hóa và làm sạch; làm vỡ hồng cầu ngay ở nồng độ rất loãng; độc với cá vì saponin làm tăng tính thấm của biểu mô đường hô hấp nên làm mất các chất điện giải cần thiết, ngoài ra còn có tác dụng diệt các loài thân mềm như giun sán, ốc sên; kích thích niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt

Có tác dụng long đờm, lợi tiểu, có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất β-hydroxysteroid khác

 Phần đường của glycoside: phần đường phổ biến là glucose, galactose, L-arabinose, L-rhamnose, D-xylose, acid glucuromic, acid galacturonic và một số đường khác

D-13

 Phần aglycon của glycoside: phần aglycon rất đa dạng và gồm tất cả các hợp chất tự nhiên như: monoterpen, diterpen Triterpen, steroid, iridoid, flavonoid, alkaloid, quinonoid, polyphenol…

I.3.2.5 Hợp chất phenol

Các hợp chất phenol dùng chỉ chung các hợp chất mà trong cấu trúc có vòng benzene mang một hoặc nhiều nhóm chức hydroxyl – OH Trong thiên nhiên, các hợp chất phenol là: flavonoid, xanthon, courmarin, quinon, các phenol đơn vòng, các polyphenol (ligin, tannin…)

Các hợp chất phenol dễ tan trong nước vì chúng thường hiện diện trong cây ở dạng glycoside Nhiều hợp chất phenol có màu sắc tự nhiên, nên có thể dựa vào đặc điểm này để theo dõi chúng trong quá trình chiết tách, cô lập chúng ra khỏi cây Các hợp chất phenol thường bị phân hủy do tác dụng của enzyme phenolase vốn luôn có trong cây vì thế nên sử dụng alcol nóng để chiết tách do alcol nóng giúp hạn chế tác dụng của enzyme này trong cây

Sinh tổng hợp các hợp chất đã được biết từ rất sớm, đi từ ba amino acid là phenylalanin, tyrosin, tryptophan Quá trình này xảy ra ngang một chuỗi các phản ứng phức tạp để cho phenylalanin, tyrosin, tryptophan và từ đó dẫn đến những hợp chất pheno L

I.3.2.6 Tinh dầu

Các tinh dầu chứa hỗn hợp terpenoid, được sử dụng như chất mùi, chất thơm

và dung môi Giống như những lipid khác, các terpenoid không tan trong nước Terpenoid được xây dựng từ những đơn vị 5 carbon và được thiết lập từ nhiều đơn

vị isoprene, ví dụ monoterpen chứa 2 đơn vị isoprene, sesquiterpen chứa 3 đơn vị isoprene, diterpene chứa 4 đơn vị isoprene

Các con đường tổng hợp nên hợp chất thứ cấp được trình bày trong sơ đồ sau:

14

I.3.3 Nuôi cấy mô tế bào thực vật sản xuất hợp chất thứ cấp

I.3.3.1 Khái niệm

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật tiêu biểu cho tiềm năng cải thiện các hợp chất có giá trị trong y dược, gia vị, hương liệu và màu nhuộm mà không thể sản xuất chúng từ các tế bào vi sinh vật hoặc tổng hợp bằng con đường hóa học Những

Hình I.2: Các con đường tổng hợp nên hợp chất thứ cấp

15

năm gần đây, sự phát triển của các hợp chất thứ cấp quan trọng trong thương mại là kết quả được mong đợi trong lĩnh vực nghiên cứu này Ưu thế về mặt nguyên lý kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật là có thể cung cấp liên tục nguồn nguyên liệu để tách chiết một tỉ lệ lượng hoạt chất từ tế bào thực vật nuôi cấy

Một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến việc sản xuất các hợp chất thứ cấp từ tế bào thực vật là sự phân hóa hình thái.Nhiều hợp chất thứ cấp được sản xuất trong suốt quá trình phân hóa tế bào, vì thế chúng được tìm thấy trong các mô

có khả năng phân hóa cao như rễ, lá và hoa Do sự phân hóa hình thái và sự trưởng thành không xuất hiện trong nuôi cấy tế bào nên các hợp chất thứ cấp có khuynh hướng ngưng tạo thành trong quá trình nuôi cấy Tuy nhiên, các tế bào không phân hóa trong nuôi cấy huyền phù thường tạo thành một khối vài trăm tế bào, các tế bào

ở giữa khối có sự tiếp xúc với môi trường khác với các tế bào ở bên ngoài nên sự phân hóa sẽ xuất hiện tới một mức độ nào đó trong khối tế bào để tạo thành các chất thứ cấp

I.3.3.2 Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật

Sự tiến bộ vượt bậc của công nghệ sinh học trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật giúp nhân giống các cây trồng có giá trị và tách chiết các hợp chất quý hiếm mang lại nhiều ý nghĩa về mặt thương mại Phương pháp này sẽ mở rộng và tăng khả năng thu hồi các chất giá trị có nguồn gốc thực vật, một sự thay thế từ quy mô nông nghiệp truyền thống lên quy mô công nghiệp trong sản xuất các hợp chất thứ cấp [12] Kỹ thuật nuôi cấy tế bào được khởi xướng từ cuối những năm 60 của thế

kỷ 20 như là một công cụ hữu ích để nghiên cứu và sản xuất hợp chất thứ cấp thực vật Kỹ thuật này được phát triển với mục tiêu cải thiện hiệu suất các sản phẩm có hoạt tính sinh học Ưu điểm của chúng là có thể cung cấp sản phẩm một cách liên tục và đáng tin cậy dựa trên những lí do sau:

 Tổng hợp các hợp chất thứ cấp có giá trị diễn ra dưới sự điều khiển các yếu tố môi trường nuôi cấy, độc lập với khí hậu và điều kiện thổ nhưỡng

16

 Phủ định sự ảnh hưởng sinh học đến các sản phẩm là hợp chất thứ cấp trong tự nhiên (vi sinh vật và côn trùng)

 Có thể chọn lọc các giống cây trồng cho nhiều loại hợp chất thứ cấp khác nhau

 Với việc tự động hóa điều khiển sự sinh trưởng của tế bào và điều hòa quá trình chuyển hóa, chi phí có thể giảm và lượng sản phẩm tăng lên Bên cạnh đó, những kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy nuôi cấy tế bào trong dung dịch huyền phù của thực vật cũng được

sử dụng để sản xuất các sản phẩm protein tái tổ hợp

Trong nuôi cấy tế bào, việc lựa chọn cẩn thận các tế bào có khả năng phát triển

và điều kiện nuôi cấy tối ưu sẽ giúp tăng khả năng tích lũy một vài sản phẩm ở mức cao hơn Để thu được hiệu suất cao cho khai thác thương mại, người ta đã sử dụng nhiều phương pháp khác nhau trong nổ lực tập trung vào việc kích thích hoạt động sinh tổng hợp của các tế bào nuôi cấy Tế bào nuôi cấy tích lũy một lượng lớn hợp chất thứ cấp chỉ khi ở những điều kiện đặc biệt như:

 Chọn lựa thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp: các thông số hóa học và vật lý như thành phần và pH môi trường, chất điều hòa sinh trưởng, nhiệt độ nuôi cấy, sự thông khí, sự lắc hoặc khuấy, và ánh sáng ảnh hưởng đến hàm lượng các hợp chất thứ cấp đã được nghiên cứu nhiều [17] Một vài sản phẩm tích lũy trong

tế bào ở mức cao hơn so với ở trong cây trồng tự nhiên khi được nuôi cấy ở điều kiện tối ưu Các thông số vật lý và yếu tố dinh dưỡng trong một mẻ có thể gần như là yếu tố cơ bản cho việc tối ưu hóa hiệu suất nuôi cấy

 Chọn lựa các dòng tế bào năng suất cao: các tế bào thực vật trong nuôi cấy là một tập hợp các đặc điểm sinh lý độc lập Chọn lọc tế bào dựa vào khả năng tổng hợp một vài hợp chất có giá trị cao trong nuôi cấy đã được Berlin và Susse công bố năm 1985, và sau đó phương thức này đã được ứng dụng rộng rãi Chẳng hạn, một dòng

17

tế bào của cây Bát tiên (Euphorbia milli) sau 24 lần chọn lọc đã tích

lũy gấp khoảng 7 lần lượng anthocyanin được sản xuất từ nuôi cấy

tế bào mẹ [36] Yamada và Sato (1982) đã chọn lọc được một dòng

tế bào của Coptis japonica có khả năng sinh trưởng gấp 6 lần sau 3

tuần nuôi cấy và hàm lượng biberin đạt tới 1,2g/ L

 Bổ sung tiền chất nuôi cấy: cung cấp tiền chất của quá trình sinh tổng hợp nội bào vào môi trường nuôi cấy cũng có thể tăng lượng sản phẩm mong muốn do một số hợp chất trung gian nhanh chóng bắt đầu sinh tổng hợp nên hợp chất thứ cấp và vì thế làm tăng cường sản phẩm cuối cùng Phương pháp này hữu ích khi dùng các tiền chất có giá thành rẻ Tăng cường kích thích hoặc bổ sung tiền chất hoặc các hợp chất tương tự mang lại hiệu quả trong nhiều trường hợp [29] Chẳng hạn, bổ sung phenylalaninkhi nuôi cấy tế bào trong

dung dịch huyền phù cây Salvia officinalis đã kích thích tạo ra

rosmarinic acid, cung cấp feluric acid trong môi trường nuôi cấy cây

Vanilla planifolia đã tăng tích lũy vanilin, hoặc bổ sung leucine dẫn

đến việc tăng các monoterpen dễ bay hơi trong nuôi cấy Perilla

frutiscens

 Cảm ứng sự phân hóa mô: dịch treo tế bào thường được sử dụng đểthu nhận các sản phẩm thứ cấp Tuy nhiên, gần đây nhiều nghiên cứu đã thành công trong việc nuôi cấy những mô đã phân hóa như nuôi cấy thân, chồi, hay rễ tơ… nhằm thu nhận hợp chất thứ cấp Các nghiên cứu chứng minh rằng có mối quan hệ mật thiết giữa sản xuất hợp chất thứ cấp với sự phân hóa tế bào và sự phát sinh hình thái của thực vật

 Cố định tế bào: trong lĩnh vực nuôi cấy tế bào thực vật để thu nhận các sản phẩm thứ cấp, việc cố định tế bào giúp kéo dài thời gian sử dụng, đặc biệt là trong các hệ thống phản ứng sinh học Mặt khác, những tế bào cố định ít bị tác động bởi điều kiện môi trường hơn so với tế bào tự do Tế bào cố định thường là những tế bào có khả năng

18

tiết các sản phẩm thứ cấp ra môi trường ngoài Tế bào ở trạng thái

cố định đôi khi tạo ra được các hợp chất thứ cấp có sản lượng cao hơn tế bào ở trạng thái lơ lửng tự do Các chất được sử dụng để cố định tế bào là agarose, carrageenan, alginate, agar, các sợi propylene… Sự cố định tế bào giúp tăng sản xuất các hợp chất thứ cấp cũng không loại trừ khả năng chính nhưng chất cố định lại là tác nhận kích thích sự sản xuất các hợp chất thứ cấp

I.3.3.3 Sự kích kháng bảo vệ thực vật

Chất kích kháng bảo vệ thực vật (elicitor) báo hiệu việc hình thành các hợp chất thứ cấp Thuật ngữ “elicitor” được sử dụng lần đầu tiên cho các tác nhân kích thích bất kỳ dạng phản ứng phòng vệ của cây đối với các bệnh lý xuất hiện trên đồng ruộng Sử dụng các elicitor của bộ máy bảo vệ cây, tức sự kích kháng bảo vệ thực vật, là phương thức để thu được các sản phẩm hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học một cách hiệu quả nhất Sử dụng các elicitor sinh học và phi sinh học (được phân loại dựa trên nguồn gốc của chúng) để kích thích hình thành các hợp chất thứ cấp trong quá trình nuôi cấy tế bào, có thể giúp rút ngắn thời gian và đạt hiệu suất cao [13] Thực vật sản xuất các hợp chất thứ cấp như là các chất kháng sinh biến dưỡng thứ cấp như các phytoalexin trong các phản ứng chống lại sự tấn công của vi sinh vật Do đó, các vi sinh vật (đặc biệt là nấm và các thành phần của chúng) đã được sử dụng rộng rãi để cảm ứng sản xuất hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy tế bào thực vật

I.3.4 Quinon và phương pháp chiết tách

I.3.4.1 Khái niệm quinon

Các hợp chất quinon (hay các quinolid) là những dẫn xuất của diketon liên hợp được tạo thành từ sự oxy hóa của orthor- hay para- dihydroxypheno L

Tùy theo số lượng và trật tự sắp xếp của các vòng thơm ngưng tụ mà ta có các cấu trúc benzoquinon, naphthoquinon, antharaquinon hay phenanthraquinon… Trong đó, antharaquinon là nhóm hợp chất lớn nhất và phổ biến nhất

19

Trong cùng một nhóm, các hợp chất quinon khác nhau bởi bản chất, số lượng

và vị trí của các nhóm thế trên khung cơ bản.Các nhóm thế thường gặp là hydroxyl, methoxy, methyl, hydroxymethyl, carboxyl hay các gốc alkyl dẫn xuất từ isoprene

I.3.4.2 Phân loại

 Benzoquinon

Các chất thuộc nhóm benzoquinon là dẫn xuất của benzoquinon Benzoquinon

có thể tồn tại dưới dạng parabenzoquinon và orthobenzoquinon nhưng trong thực tế thì chỉ có các p-benzoquinon là ổn định và thường gặp trong tự nhiên

Hình I.3: Benzoquinon Các dẫn xuất của benzoquinon trong tự nhiên thường tồn tại dưới dạng tự do, không thấy dưới dạng glycoside Tuy nhiên, dạng khử của chúng, các dihydroquinon có thể gặp ở dạng glycoside như arbutin, paramethoxyarbutin

Trong thiên nhiên, các benzoquinon thường được tìm thấy trong nấm và các loài thực vật bậc cao Họ Đơn nem (Myrsinaceae) là họ thực vật thường gặp nhóm hợp chất này, ngoài ra còn hay gặp trong các họ Mao lương (Ranulculaceae), họ Đậu (Leguminosae), họ Xoan (Mwliaceae), họ Thanh thất (Simarubaceae) …

Naphthoquinon là những chất có màu từ vàng đến đỏ, hay gặp trong các họ thực vật: bignoniaceae, boraginaceae và droseraceae Chúng thường tồn tại dưới dạng tự do, nhưng dẫn chất của chúng (dihydronaphthoquinon) có thể gặp ở dạng

glycoside như α-hydrojuglone glucosid gặp ở một số loài Juglans [2]

Các nhóm thế trên khung naphthoquinon thường là hydroxyl, methyl, methoxy, đôi khi gặp các hydrocarbon mạch dài hoặc các dị vòng ngưng tụ

Một số chất đại diện thường gặp trong thực vật là: Phylloquinon có trong

Medicago và nhiều thực vật khác, juglone trong Hồ đào – Juglans regia (Juglandaceae), lawson trong Tử vi – Lawsonia inermis (Lawsoniaceae), plumbagin

Hình I.4: Naphthoquinon

21

trong Bạch hoa xà – Plumbago zeylania (Plumbaginaceae), droserone trong cây Nắp bình – Drosera (Droseraceae), lapachol trong Gỗ tếch – Tectona grandis và eleuthrine, isoeleuthrine trong Sâm đại hành – Eleuthrina subaphylla (Liliaceae)

 Phenanthraquinon

Các phenanthraquinon có thể gặp dưới dạng ortho- hay paraquinonen Chúng

ít được biết đến trong tự nhiên, chỉ gặp một ít ở một số loài nấm và một vài thực

vật, đáng chú ý là chi Salvia họ Lamiaceae

Trong Đan sâm (Salvia miltorrhiza) có gần 30 dẫn chất phenanthraquinon như

tanshinon I, isotanshinon I… Tashinon được dùng để điều trị các bệnh của động mạch vành tim, chứng đau thắt ngực hay nặng ở vùng ngực Những chất này còn có tác dụng làm tăng độ bền của màng hồng cầu, bảo vệ gan và có tác dụng kháng khuẩn

Phenanthraquinon cũng gặp nhiều ở loài Chút chít (Rhumex chinensis) họ

Polygonaceae như delticulato L

 Antharaquinon

Các anthraquinon (hay anthraquinoid) là nhóm những hợp chất dẫn xuất từ 9,10-diketon-anthracene Đây là nhóm lớn nhất của các hợp chất quinon tự nhiên Đến nay đã có trên 170 anthraquinon được biết trong thực vật

Anthraquinon thường tồn tại dưới dạng glycoside trong đó khoảng ½ ở trong

vi nấm chủ yếu là Pennicilium và Aspergillus và khoảng ½ trong thực vật có hoa

Một vài anthraquinon tìm thấy trong Địa Y (Lichen) và một số côn trùng, nhưng rất

hiếm thấy trong nấm bậc cao Trong thực vật có hoa, anthraquinon gặp chủ yếu ở một số họ hai lá mầm, đặc biệt là các họ: Rubiaceae, Rhamnaceae, Polygonaceae,

Caesalpiniaceae (chi Cassia) Ngoài ra, còn gặp ở các họ: Ericaceae, Bignoniaceae,

Anacardiaceae, Saxifragaceae, Euphorbiaceae, Sonneratiaceae, Scrophulariaceae và

Verbenaceae Ở thực vật một lá mầm anthraquinon có ở chi Aloes (Liliaceae)

Các anthraquinon có thể tồn tại ở dạng monomer (đơn phân) hay dimer (nhị phân) như các dẫn chất dianthraquinon, dianthrone Các anthraquinon có thể gặp dưới các mức độ oxy hóa – khử khác nhau ở vị trí 9 và 10 (như anthraquinon-

22

antharol), các đồng phân hỗ biến (như antharol-anthrone) hay các đồng phân quang học của nhau như sennidin A và B… Các anthraquinon khác nhau bởi bản chất, số lượng và vị trí của nhóm thế trên khung 9,10-anthraquinon Các nhóm thế thường gặp trong anthraquinon là: hydroxyl, methoxy, methyl, hydroxymethyl, formyl, carboxylic hay các chuỗi hydrocarbon, vòng benzene…

Trong thiên nhiên, các anthraquinon có thể gặp dưới dạng tự do (aglycon) hoặc dạng kết hợp (glycoside) Dạng kết hợp thường được gọi là anthraglycosid Các đường thường gặp là glucose và rhamnose Phần đường gắn vào các anthraquinon có thể bằng dây nối o-glycosid hay c-glycosid

Có thể chia anthraquinon trong tự nhiên thành các nhóm nhỏ dựa vào cấu trúc chung hay một vài tính chất chung của chúng Có thể có nhiều cách phân nhóm khác nhau tùy theo quan điểm của các tác giả như phân nhóm theo mức độ trùng hợp hóa (monomer, dimer), mức độ oxy hóa- khử (anthraquinone, oxanthrone, anthrone…), theo công dụng hay nguồn gốc thực vật

Anthraquinon monomer: được xếp vào nhóm này là những anthraquinon dẫn xuất từ 1 đơn vị 9, 10-anthraquinone Dựa vào công dụng của chúng người ta chia thành 2 nhóm nhỏ: anthraquinon nhóm phẩm nhuộm và anthraquinon nhóm nhuận tẩy

 Anthraquinon nhóm phẩm nhuộm: thuộc về nhóm này là những anthraquinon thường được dùng để nhuộm vải sợi, nhóm này thường có cấu trúc 1,1 dihydroxyanthraquinon có màu đậm từ da cam đến đỏ tía Chúng thường gặp trong họ Rubiaceae và không hoặc có tính tẩy sổ yếu Đại diện nhóm này là các athraquinon

purpurin và alizarin của Rubia tinctoria (Rubiaceae) và carminic acid của loài sâu Coccus carti hay các acid laccaic của Cánh kiến

đỏ

 Anthraquinon nhóm nhuận tẩy: được xếp vào nhóm này là những dẫn xuất của 1,8-dihydroxy-anthraquinon với vị trí số 3 thường có nhóm thế như methyl, hydroxymethyl hay carboxy L Vì thế chúng còn được gọi là các oxymethyl-anthraquinon (OMA) Các

23

anthraquinon thuộc nhóm này có tác dụng tẩy xổ và thường có màu vàng nhạt hay gặp trong các họ Rhamnaceae, Polygonaceae, chi

Aloe thuộc họ Liliaceae, chi Cassia thuốc họ Caesalpiniaceae…

Chrysophanol (acid chysophanic), aloe-emodin, rhein, emodin và physcione là những đại diện thường gặp của nhóm này

Dianthraquinone: Dianthraquinone là dẫn xuất gồm hai đơn vị anthraquinone nối với nhau trực tiếp qua cầu nối C-C Các hợp chất này ít gặp hơn nhóm đầu và mới chỉ biết một vài đại diện trong tự nhiên ví dụ như siamenin và cassiamin trong

vài loài Cassia (Ceasalpiniaceae)

I.3.5 Phương pháp chiết tách

Cấu trúc hóa học của các hợp chất quinon cho thấy chúng có chứa một hoặc nhiều nhân benzene, mạch nhánh alcan ngắn, mang các nhóm chức hydroxyl… Nên nói chung các hợp chất quinon có tính phân cực từ trung bình đến mạnh Vì vậy muốn chiết tách các hợp chất này ra khỏi bột cây, cần sử dụng các dung môi có độ phân cực tăng dần như benzene, etyl eter, chloroform, etyl acetat, etanol, …

Hợp chất quinon có thể thăng hoa, có thể áp dụng kỹ thuật thăng hoa để thu lấy hợp chất Tuy nhiên, chỉ nên áp dụng kỹ thuật này khi hợp chất đó có tính bền với nhiệt độ cao và có hàm lượng lớn trong bột cây

I.3.6 Định tính quinon

 Phản ứng Borntraeger

Lấy một ít bột dược liệu cho vào bercher, thêm dung dịch H2SO4 25% đun nhẹ

để thuỷ phân glycoside (nếu có) ra dạng aglycon Để nguội lắc với chloroform, gạn lấy lớp chloroform ra một ống nghiệm khác rồi thêm ít dung dịch NaOH 10% Lớp kiềm sẽ hoá màu nâu đỏ chứng tỏ có quinon

 Phản ứng nhuộm quinon trong lát mỏng tế bào

Cắt một lát vi phẫu mỏng, không tẩy rửa, không nhuộm Đặt lát cắt vào trong hộp petri có chứa hơi ammoniac Sau một thời gian soi lát cắt dưới kính hiển vi Các tổ chức có chứa hợp chất quinon sẽ có màu nâu đỏ

Hình I.5: Bình sắc ký lớp mỏng

25

Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi:

Tụ cầu khuẩn được R Koch mô tả từ năm 1878 Sau đó, Pasteur (1880) và

Ogston (1881) gọi vi khuẩn này là tụ cầu và xếp vào loài Staphylococus Đến năm

1884, Rosenbach nghiên cứu chi tiết về khả năng gây bệnh và xếp vào loại tụ cầu

Tụ cầu có nhiều loại: có loại gây bệnh, thường gặp nhất là tụ cầu vàng

(Staphylococus aureus) và có loại bình thường sống trên da và niêm mạc, không

gây bệnh Tuy nhiên, trong một số điều kiện nhất định, loại không gây bệnh có thể trở nên gây bệnh Ngoài ra, còn có những tụ cầu kỵ khí đôi khi cũng gây bệnh

I.4.1.1 Đặc điểm sinh vật học

 Hình thể và tính chất bắt màu

Tụ cầu khuẩn có hình cầu, đường kính 0,8 – 1 μm, đứng tụ lại với nhau thành từng đám như chùm nho Có thể đứng lẻ tẻ hoặc thành từng đôi hay từng chuỗi ngắn tụ cầu thường không có vỏ, không có lông, không di động, không sinh nha bào Nhuộm bằng phương pháp Gram, vi khuẩn bắt màu Gram dương

 Các enzyme và độc tố

Các enzyme

 Men Coagulase: men này có khả năng làm đông huyết tương người

và thỏ Nó là một protein bền với nhiệt, tính chất kháng nguyên yếu,

 Men Desoxyribonuclease: là men có thể thủy phân DNA, có thể gây

A – F

 Độc tố bạch cầu (Leucocidin) gây đọc cho bạch cầu người và thỏ, bạch cầu của các loài động vật khác không bị gây hại Leucocidin bao gồm 2 mảnh F và S và có thể tách rời bằng sắc ký ion Nếu 2 mảnh này tách rời thì mất tác dụng gây độc

 Độc tố gây hội chứng shock nhiễm độc (Toxic shock syndrome toxin – TSST) thường gặp ở những phụ nữ có kinh dung bong băng dày bẩn hoặc những người bị nhiễm trùng vết thương TSST kích thích giải phóng TNF (Tumor necrosis factor, yếu tố hoại tử u) và các interleukin I, II

 Exfoliatin toxin hay epidermolytic toxin là một ngoại độc tố Gây nên hội chứng phỏng rộp và chốc lở da ở trẻ em

27

 Alpha toxin gây tan các bạch cầu có nhân đa hình và tiểu cầu, từ đó gây ra các ổ áp xe, gây hoại tử da và tan máu Alpha toxin gắn trên màng tế bào và thể hiện các thuộc tính hoạt động bề mặt

 Ngoại độc tố sinh mủ có tác dụng sinh mủ và phân bào lymphocyl, đồng thời nó làm tăng nhạy cảm về một số phương diện đối với nội đọc tố như gây shock và hoại tử gan và cơ tim

 Dung huyết tố: tụ cầu vàng sinh ra 4 loại dung huyết tố khác nhau α,

β, γ, δ

I.4.1.2 Khả năng gây bệnh

Các bệnh ngoài da: trên mặt da có những vết xây xát, tụ cầu xuống tổ chức

dưới da gây các bệnh mụn nhọt, viêm da, đầu đinh, đinh râu…

Nhiễm khuẩn huyết do tụ cầu: thường xảy ra ở những người có sức đề kháng yếu hoặc trẻ em Bệnh thường nặng, có thể gây chết người hoặc trở thành mãn tính

gây nên viêm xương, viêm khớp, viêm phổi, viêm cơ…

Nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp tính: bệnh xảy ra nhanh, trầm trọng với các dấu hiệu nôn mửa dữ dội

Viêm phổi: Viêm phổi do tụ cầu vàng ít gặp Nó chỉ xảy ra sau viêm đường hô hấp do virus (như cúm) hoặc sau nhiễm khuẩn huyết Tuy vậy cũng có viêm phổi tiên phát do tụ cầu vàng, ở trẻ em hoặc những người suy yếu Tỷ lệ tử vong của

bệnh này khá cao, vì thế nó được coi là bệnh nặng

I.4.1.3 Phòng bệnh và trị bệnh

 Phòng bệnh

Vacxin là giải độc tố hoặc vacxin là vi khuẩn ít khi có kết quả tốt Phương pháp phòng bệnh chủ yếu là giữ vệ sinh chung, vệ sinh cá nhân, vệ sinh ăn uống, vệ sinh nhà… Đối với các dụng cụ tiêm truyền, các dụng cụ dung trong sản khoa, ngoại khoa… phải đảm bảo vô trùng khi dung cho bệnh nhân Đặc biệt, trong bệnh

viện phải chú ý phòng cho tập thể, chống nhiễm khuẩn chéo

 Điều trị

28

Tụ cầu khuẩn bị tiêu diệt bởi nhiều loại kháng sinh như penicillin, tetracylin, oxaxilin, kanamyxin, gentamyxin… Tuy nhiên, do việc dung kháng sinh rỗng rãi và tùy tiện nên tụ cầu ngày càng kháng lại nhiều loại kháng sinh Tốt nhất là phải điều

trị théo kháng sinh đồ

I.4.2 Escherichia coli

I.4.2.1 Đặc điểm sinh vật học

Trực khuẩn hình que thẳng, kích thước dài ngắn khác nhau, trung bình từ 2 – 3

μm, rộng 0,5 μm, đôi khi trong môi trường nuôi cấy trực khuẩn dài 6 – 8 μm Trực khuẩn có thể có vỏ, có lông, di động (có thể một số chủng không di động), không

sinh nha bào, bắt màu Gram âm

I.4.2.2 Khả năng gây bệnh

E coli là vi khuẩn chiếm nhiều nhất trong số các vi khuẩn hiếu khí sống ở

đường tiêu hóa Tuy là vi khuẩn cộng sinh với người nhưng E coli có thể gây bệnh

cơ hội Chúng có thể gây viêm đường tiêu hóa, tiết niệu, sinh dục, đường mật, đường hô hấp và nhiễm khuẩn huyết Nhưng nhiễm khuẩn quan trọng nhất là viêm

dạ dày ruột ở trẻ em

I.4.3 Pseudomonas aeruginosa

I.4.3.1 Đặc điểm sinh vật học

Trực khuẩn thẳng, hai đầu tròn, dài 1 – 5 μm, rộng 0,5 – 1 μm Trực khuẩn ít khi có vỏ, có một lông ở một đầu, di động, không sinh nha bào, bắt màu Gram âm

29

I.4.3.2 Khả năng gây bệnh

Trực khuẩn mủ xanh có mặt ở mọi nơi trong các bệnh viện Chúng là loại vi khuẩn gây bệnh có điều kiện như khi cơ thể bị suy giảm miễn dịch, bị bệnh ác tính hoặc mãn tính, khi dung corticoid lâu dài, việc sử dụng kháng nguyên tùy tiện, việc

sử dụng các dụng cụ thăm khám hoặc các vết bỏng, các vết thương hở…

Tại chỗ, trực khuẩn gây viêm mủ (mủ có màu xanh) Khi có điều kiện thuận lợi, chúng gây bệnh toàn thân như nhiễm khuẩn huyết hoặc viêm phế quản, viêm tai giữa, viêm màng não, viêm tủy xương…

I.4.3.3 Phòng bệnh và trị bệnh

 Phòng bệnh

Giữ gìn vệ sinh chung, tránh nhiễm chéo trong bệnh viện, triệt để thực hiện các quy tắc khử trùng, vô khuẩn nếu có dịch xảy ra phải khẩn trương điều tra và xử lý dịch

 Điều trị

Trực khuẩn mủ xanh đã kháng lại nhiều kháng sinh thường dùng, hiện nay các kháng sinh còn tác dụng là: carbenicilin, ceftazidim thuộc họ β-lactam và amikacin, gentamyxin, tobramyxin thuộc họ amino glycosid

I.4.4 Bacillus cereus

I.4.4.1 Đặc điểm sinh vật học

Độc tố: vi khuẩn sản sinh 2 loại độc tố:

30

 Độc tố tiêu chảy (type 1): Diarrhoed toxin Vi khuẩn sản sinh độc tố trên thịt, rau quả, gia vị Bản chất là một loại protein gây hủy hoại biểu bì và niêm mạc ruột gây tiêu chảy có thể hiểm đến tính mạng

 Độc tố gây nôn mửa (type 2): emetic toxin Vi khuẩn nhiễm trong gạo, cơm nguội, đậu các loại bản chất độc tố là phospholipid có tính

ổn định cao không bị phân hủy ở nhiệt độ cao và dịch dạ dày

I.4.4.2 Khả năng gây bệnh

Bacillus cereus phân bố nhiều tự nhiên, nhiễm vào các loại thức ăn qua đêm

hay trữ lạnh lâu, thường gây ngộ độc thực phẩm

I.4.4.3 Phòng bệnh và trị bệnh

 Phòng bệnh

Cách phòng cơ bản để khỏi nhiễm loại vi khuẩn B cereus là cần thận

trọng khâu chế biến thực phẩm và nấu nướng

 Trị bệnh

Nên điều trị theo kháng sinh đồ vì hiện nay B cereus đã kháng lại nhiều

loại kháng sinh

31

32

II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

II.1 Vật liệu

Cây, hạt, lá Rivina humilis L trồng tại vườn thuốc nam trường Đại học Mở

Thành phố Hồ Chí Minh, cơ sở Bình Dương, 68 Lê Thị Trung, Phường Phú Lợi, Thành phố Thủ Dầu Một, Tỉnh Bình Dương

Lá và thân cây Rivina humilis L in vitro

Các loại vi khuẩn: Staphylococus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas

aeruginosa, Bacillus cereus được phân lập tại Phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh,

Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, cơ sở Bình Dương, 68 Lê Thị Trung, Phường Phú Lợi, Thành phố Thủ Dầu Một, Tỉnh Bình Dương

Thời gian: 10/2014 đến 5/2015

II.2 Phương pháp nghiên cứu

II.2.1 Nuôi cấy cây con in vitro từ hạt Rivina humilis L

Hạt được khử trùng lần lượt với ethanol 70% (3 phút) và javel (Sodium hypochloride 5%) ở các nồng độ và thời gian khác nhau rồi được rửa sạch và đặt vào môi trường MS có bổ sung 7,5 g/L agar và 30 g/L đường (mỗi nghiệm thức lặp lại 5 lần, 5 bình/lần, 20 hạt 1 bình) (bảng II.1)

Tỉ lệ mẫu sống được tính bằng (Số mẫu sống không nhiễm*100)/Tổng số mẫu cấy và hình thái của hạt được ghi nhận tại thời điểm 30 ngày sau nuôi cấy