nghiên cứu khả năng tạo rễ bất định của cà gai leo (solanum hainanense hance) in vitro, định tính và khảo sát khả năng chống oxi hóa của cao chiết từ rễ cây

Khảo sát sự hình thành rễ bất định từ lá Cà gai leo in vitro trong môi trường có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật IAA và NAA .... 32 III.1.1: Khảo sát sự hình thành rễ bất định

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO RỄ BẤT ĐỊNH CỦA CÀ GAI

LEO (Solanum hainanense Hance) IN VITRO, ĐỊNH TÍNH VÀ

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CHỐNG OXI HÓA CỦA CAO CHIẾT

TỪ RỄ CÂY

Mã số: T2015.3.182

Chủ nhiệm đề tài: ThS Nguyễn Trần Đông Phương

TP HCM, 8/2016

MỤC LỤC

DANH MỤC VIẾT TẮT i

DANH MỤC HÌNH ii

DANH MỤC BẢNG iii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

I.1 Sơ lược về họ Cà Solanaceae 3

I.2 Sơ lược về cây Cà gai leo Solanum hainanense Hance 3

I.2.1 Vị trí phân loại 3

I.2.3 Đặc điểm hình thái 4

I.2.4 Thu hái và chế biến 4

I.2.5 Thành phần hợp chất có trong cây 5

I.3 Nuôi cấy mô, tế bào thực vật 9

I.3.1 Khái niệm 9

I.3.2 Cơ sở và ứng dụng 9

I.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng 10

I.3.4 Sự phát sinh rễ bất định trong nuôi cấy mô 15

I.3.5 Sự kháng oxy hóa 16

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 21

II.1: Vật liệu 21

II.1.1: Địa điểm thực hiện 21

II.1.2: Đối tượng nghiên cứu 21

II.1.3: Thiết bị và dụng cụ 21

II.1.4: Môi trường nuôi cấy 22

II.1.5: Điều kiện nuôi cấy 22

II.1.6: Hoá chất dùng trong nuôi cấy mô 22

II.1.7: Hóa chất khảo sát khả năng kháng oxy hóa 23

II.2: Phương pháp nghiên cứu 23

II.2.1: Tạo rễ bất định cây Cà gai leo Solanum hainanense Hance 23

II.2.2: Cách thu nhận các chỉ tiêu đánh giá 28

II.2.3: Định tính alkaloid 28

II.2.4: Xác định solasodine trong rễ bất định Cà gai leo 28

II.2.5: Sắc ký bản mỏng TLC 29

II.2.6: Khảo sát khả năng chống oxy hóa của dịch chiết cao thô từ rễ cây Cà gai leo 29

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

III.1 Khảo sát sự hình thành rễ bất định từ lá Cà gai leo in vitro trong môi trường có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật IAA và NAA 32

III.1.1: Khảo sát sự hình thành rễ bất định từ lá trong môi trường bổ sung IAA32 III.1.2: Khảo sát sự hình thành rễ bất định từ lá trong môi trường bổ sung NAA34 III.2: Khảo sát sự hình thành rễ bất định từ đoạn thân Cà gai leo in vitro trong môi trường có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật IAA, NAA và dịch chiết hoa mười giờ 36

III.2.1: Khảo sát sự hình thành rễ bất định từ đoạn thân trong môi trường bổ sung IAA 36

III.2.2: Khảo sát sự hình thành rễ bất định từ đoạn thân trong môi trường bổ sung NAA 38

III.2.3: Kết quả khảo sát sự hình thành rễ bất định từ đoạn thân Cà gai leo in vitro trong môi trường có bổ sung dịch chiết Hoa mười giờ 39

III.3: Định tính alkaloid 42

III.4: Sắc lý bản mỏng TLC 43

III.5: Khảo sát khả năng chống oxy hóa của cao chiết từ rễ cây Cà gai leo 44

III.6 Thảo luận 46

PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49

IV.1 Kết luận 49

IV.2 Đề nghị 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

PHỤ LỤC 56

NAA 1-Naphthalene acetic acid

IAA 3-Indolacetic acid

2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

EDTA Ethylene diamine tetra acetate

16-DPA 16- dehydropregnenolone acetate

HMG Hoa mười giờ

TLC Thin layer chromatography

HPLC High performance liquid chromatography

DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazy

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 1: Cà gai leo 3

Hình 1.2: Sự hình thành và phát triển rễ 16

Hình 1.3: Phản ứng trung hòa DPPH 20

Hình 2.1: Chồi Cà gai leo in vitro sau 4 tuần nuôi cấy 24

Hình 3.1: Rễ bất định hình thành từ lá Cà gai leo in vitro sau 8 tuần tuổi ……… 33

Hình 3 2: Rễ bất định hình thành từ lá Cà gai leo in vitro sau 8 tuần tuổi 35

Hình 3 3: Rễ bất định hình thành từ thân Cà gai leo in vitro sau 8 tuần tuổi 37

Hình 3 4: Rễ bất định hình thành từ đoạn thân Cà gai leo in vitro sau 8 tuần tuổi 39

Hình 3 5: Ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết Hoa mười giờ đến sự phát sinh rễ bất định từ đoạn thân sau 8 tuần nuôi cấy 41

Hình 3 6: Định tính alkaloid dịch chiết rễ bất định Cà gai leo 42

Hình 3 7: Sản phẩm ly trích trong hệ dung môi sắc ký là chloroform : methanol (19:1) với chất chuẩn là solasodine 44

Hình 3 8: Bộ Soxhlet và dịch cao chiết 46

Bảng 2 5: Ảnh hưởng của dịch chiết hoa mười giờ trong quá trình tạo rễ bất định từ

đoạn thân Cà gai leo in vitro 27 Bảng 3 1: Ảnh hưởng nồng độ IAA lên sự hình thành rễ bất định từ lá Cà gai leo in

vitro .32

Bảng 3 2: Ảnh hưởng nồng độ NAA lên sự hình thành rễ bất định từ lá Cà gai leo

in vitro 34

Bảng 3 3: Ảnh hưởng nồng độ IAA lên sự hình thành rễ bất định từ đoạn thân Cà

gai leo in vitro 36

Bảng 3 4: Ảnh hưởng nồng độ NAA lên sự hình thành rễ bất định từ đoạn thân Cà

gai leo in vitro 38

Bảng 3 5: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết Hoa mười giờ đến sự phát sinh rễ bất định từ đoạn thân 40

Bảng 3 6: Kết quả hoạt tính kháng oxi hóa của cao chiết rễ cây Cà gai leo in vitro

45

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cà gai leo (Solanum hainanense Hance) hay Solanum procumben Lour là một

cây thuốc có giá trị được tìm thấy trong nhiều khu vực của Trung Quốc và Việt Nam, được sử dụng như một chất chống viêm, chống histaminemia và trị rắn cắn[36] Thành phần chính của cà gai leo là alkaloid (chủ yếu là solasodine)[43], có hoạt chất kháng viêm và bảo vệ gan quan trọng do có tác dụng ức chế sinh tổng hợp collagen

và hạn chế sự tạo thành xơ ở một số tổ chức mô liên kết Ngoài ra, alkaloid còn có tác dụng hạn chế sự phát triển khối u, làm bất hoạt các virus gây bệnh mụn giộp ở

người như Herpes simplex, Herpes zoster và Herpes genitalis, bảo vệ chuột chống lại sự xâm nhiễm của vi khuẩn Salmonella typhimurium, giảm lượng cholesterol

trong máu Rễ cây Cà gai leo là nơi tích lũy chủ yếu alkaloid, vì vậy vấn đề đặt ra là nếu thu hái trong tự nhiên, để thu được rễ phải nhổ cây, như vậy sẽ rất hao phí và tốn thời gian tái tạo lại nguồn nguyên liệu[1]

Ứng dụng nuôi cấy mô có thể tạo nguồn rễ bất định cây Cà gai leo với số lượng lớn cung cấp dược liệu đồng nhất theo nhu cầu sử dụng Ngoài ra, dùng auxin tự nhiên thay thế cho IAA để tạo rễ là cần thiết Vì IAA là hormone tăng trưởng kích thích sự phát triển của thực vật, có tác dụng đến các quá trình sinh trưởng của tế bào như hiện tượng ưu thế ngọn, tính định hướng của thực vật, sự sinh trưởng của quả

và tạo ra quả không hạt, hoạt động của tầng phát sinh và sự hình thành rễ bất định Tuy nhiên, IAA được sử dụng trong các thí nghiệm thường sử dụng hợp chất tổng hợp hóa học nên sẽ có ảnh hưởng đến các chất có hoạt tính sinh học mà cây tổng hợp trong quá trình sinh trưởng Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng dịch chiết Hoa

mười giờ Portulaca grandiflora Hook chứa hàm lượng IAA tự nhiên[25] có lợi cho mục đích tạo rễ cho thí nghiệm, góp phần tạo nguồn nguyên liệu an toàn, tăng hiệu quả trong dược phẩm, giảm chi phí và thân thiện với môi trường[27]

Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng tạo rễ bất định của Cà

gai leo (Solanum hainanense Hance) in vitro và khảo sát khả năng chống oxy hóa của cao chiết từ rễ cây” nhằm tạo số lượng lớn rễ bất định Cà gai leo in vitro an toàn

để ly trích chất solasodine

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I.1 Sơ lược về họ Cà Solanaceae

Họ Cà Solanaceae bao gồm khoảng 90 chi và trên 2.600 loài phân bố tập trung

ở các vùng nhiệt đới Ở Việt Nam có khoảng 70 loài gồm các cây thân thảo hoặc

cây nhỏ Một số loài cây được trồng với mục đích công nghiệp (thuốc lá -Nicotiana

tabacum), làm thuốc (cây cà dược -Atropa belladonna, cà gai leo -Solanum hainanense), làm cảnh (cây dã yên thảo -Petunia hybrida) và đặc biệt là cây trồng,

trong đó có ý nghĩa toàn cầu như khoai tây, cà chua, ớt, cà tím và ý nghĩa địa

phương như dưa chuột trái cây (Pepino ait), Solanum betaceum, Cyphomandra

Cây thường là thân thảo, mặc dù có cây bụi và cây gỗ nhỏ Lá mọc cách, khác nhau về hình dạng và kích thước, thường không có lá kèm hay thay thế Hoa đều, lưỡng tính, mẫu 5 Quả mọng nước hoặc quả nang Một số loài có hợp chất alkaloid (atropine, nicotine, solanine, tomatine) mà trong một số trường hợp được sử dụng như thuốc chữa bệnh, nhưng có thể gây độc cho con người và động vật[45]

I.2 Sơ lược về cây Cà gai leo Solanum hainanense Hance

I.2.1 Vị trí phân loại

Loài: Solanum hainanense Hance

Tên đồng nghĩa: Solanum procumbens Lour

Tên gọi khác: Cà vạnh, cà cườm, cà quánh, cà quýnh, cà gai dây, cà lù, cà bò[2]

Cà gai leo là loại cây nhỏ sống nhiều năm, phân bố ở các tỉnh miền núi phía Bắc

Hình 1 1: Cà gai leo

(Bắc Giang, Phú Thọ), các tỉnh Trung Bộ (Thanh Hóa, Nghệ An, Khánh Hòa, Gia Lai) và một số vùng ở Nam Bộ Các tỉnh Hòa Bình, Nam Định, Quảng Trị, Nghệ An, Thanh Hóa có nhiều Cà gai leo

Cà gai leo là cây ưa ẩm, ưa sáng và có thể hơi chịu bóng, thường mọc tập trung nhiều cá thể, lẩn trong các lùm bụi thưa ở quanh làng, bãi hoang, kể cả các bụi tre gai Cây mọc ở chỗ nhiều ánh sáng, sinh trưởng và phát triển tốt, ra nhiều hoa quả,

Cà gai leo có khả năng tái sinh bằng hạt hoặc từ các phần thân và các gốc còn lại sau khi chặt Ngoài ra, từ các đoạn thân và cành trồng vào mùa xuân cũng có thể mọc thành cây mới, thường mọc ở vùng núi thấp đến trung du và đồng bằng ven biển Nguyên nhân chủ yếu do vấn đề thổ nhưỡng và khí hậu của vùng này phù hợp cho sự phát triển của cây Cà gai leo[2][18]

I.2.3 Đặc điểm hình thái

Cà gai leo thuộc họ leo nhỡ, dài hơn 1 m, phân nhiều cành; cành non tỏa rộng, phủ lông hình sao và có rất nhiều gai màu vàng, dài 2-5 mm Lá hình trứng, hình bầu dục, chóp tù hoặc nhọn, gốc nêm hoặc tròn, mép lá thường có 5 thùy lượn sóng,

ít khi nguyên, mặt trên màu xanh đậm có lông hình sao thưa, mặt dưới màu xanh nhạt có lông hình sao dày; cuống lá dài 0,4-0,5 cm, có gai nhỏ

Cụm hoa Cà gai leo dạng tán ở đỉnh cành, hiếm khi mọc ở nách lá; cuống chung dài 3-5 mm Hoa có cánh màu trắng, nhụy màu vàng, mẫu 4; cuống hoa dài 12-15

mm Đài hình chén, dài 3-4 mm; thùy đài hình tam giác, không đều, dài 1-2 mm, ở mặt dưới có lông măng hình sao Tràng màu trắng hoặc tím nhạt, dài 1 cm; thùy tràng hình mũi mác, dài 6-7 mm, ở mặt ngoài có lông hình sao Nhị 4; chỉ nhi dài 1 mm; bao phấn dài 6 mm Bầu nhẵn; vòi nhụy dài 7 mm, có lông ở gốc Quả mọng màu vàng, khi chín màu đỏ sáng, hình cầu, đường kính 5-7 mm Hạt màu vàng nhạt, dạng thận[2][18]

I.2.4 Thu hái và chế biến

Cây Cà gai leo ra hoa vào mùa hè, có quả vào mùa thu Thường người ta đào rễ

Solasodine là alkaloid steroid có chứa nitơ, thu được từ các bộ phận khác nhau

của chi Solanum thuộc họ Cà Solanaceae và có tác dụng điều trị khác nhau

Solasodine đã được sử dụng trong các ngành công nghiệp thuốc để tổng hợp 16-DPA, một tiền chất mới chống khả năng sinh sản và chống viêm[29] Solasodine

có hoạt tính sinh học như kháng nấm, ức chế sự tăng trưởng của côn trùng và có đặc tính như enzyme, phục hồi tổn thương da[30], ức chế sự tăng trưởng Trypanosoma

cruzi in vitro[31], ức chế sự sản sinh corticoids từ tuyến thượng thận của chuột và chứng tỏ khả năng chống xơ gan trên chuột Solasodine có tác dụng hạ cholesterol trong chuột[32][33], hạ huyết áp trên mèo và chống sinh tinh ở chó[35], kích thích tế bào lympho tăng sinh[34]

Solanidine là một alkaloid rất độc có trong các cây họ Cà Solanaceae Nó gây

ức chế thần kinh Tuy nhiên solanidine là một chất rất quan trọng trong sự tổng hợp của các hormone và một số dược chất

Solanine là một loại glycoalkaloid, có vị đắng và khá độc, có nguồn gốc từ mầm

khoai tây, cà chua và các cây khác trong họ Cà Solanaceae Solanine có tính gây mê

và trước đây được dùng để chữa chứng động kinh Solanine được tạo thành từ alkaloid solasodine và carbohydrate (glyco-) mạch nhánh[7][19]

I.2.5.2.Flavonoid

Flavonoid là thành phần hay gặp trong dược liệu có nguồn gốc thực vật Phần lớn có màu vàng Có tác dụng ngăn ngừa các nguy cơ như xơ vữa động mạch, tai biến mạch, oxy hóa, thoái hóa gan, tổn thương do bức xạ[7][19]

Saponin còn gọi là saponosid, là một nhóm glycosid lớn, gặp rộng rãi trong thực

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của α-solanine

vật Có đặc điểm là làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước, có tác dụng nhũ hoá và tẩy sạch, kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt, có tác dụng long đờm, lợi tiểu Nhóm chất này trong Cà gai leo có diosgenin là sapogenin quan trọng nhất có tác dụng là thành phần để bán tổng hợp các thuốc mang gốc steroid[7][19]

có tác dụng ức chế sinh tổng hợp colagen lại vừa có vai trò kích hoạt colagenase làm hoạt hóa enzym này phân giải colagen làm giảm xơ

Cà gai leo còn có tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan, làm giảm tổn thương do oxy hóa gây ra ở gan Kích thích sự tăng trưởng của các tế bào lympho T tác dụng lên hệ miễn dịch, ức chế một số dòng tế bào ung thư gan, ung thư cổ tử cung

Theo kinh nghiệm của dân gian Cà gai leo dùng chữa ngộ độc rượu rất tốt Cà gai leo có vị hơi the, tính ấm, hơi có độc Rễ và quả dùng trị mụn nhọt, lở ngứa Nước sắc của rễ uống chống say rượu Trong rễ có chứa solasodine dùng trị cảm cúm, ho gà, đau lưng, nhức xương, thấp khớp, sâu răng và rắn cắn[6][8][15][3][23]

I.2.7 Các nghiên cứu về Cà gai leo

Năm 1991, Nguyễn Thị Minh Khai phát hiện ra dịch chiết của cây Cà gai leo có tác dụng ngăn chặn sự phát triển xơ trên mô hình gây xơ gan thực nghiệm trên chuột

Năm 1998, Nguyễn Phúc Thái thực hiện đề tài: “Nghiên cứu lâm sàng, cận lâm sàng tổn thương gan do tiếp xúc nghề nghiệp với trinitrotoluen (TNT) và thăm dò tác dụng bảo vệ gan của Cà gai leo trên thực nghiệm” cho kết quả dịch chiết từ cây

Cà gai leo có tác dụng đáng kể trong việc bảo vệ gan dưới tác dụng độc của TNT trong nghiên cứu thực nghiệm kéo dài 6 tuần Những tác dụng thể hiện rõ thông qua việc hạn chế hủy hoại tế bào gan (giảm bớt việc tăng men gan so với lô chuột không uống Cà gai leo); hạn chế việc tăng trọng lượng gan do nhiễm độc TNT và giảm bớt các biểu hiện tổn thương gan trên tiêu bản vi thể (lô uống TNT có Cà gai leo không

bị mất cấu trúc nan hoa tiểu thùy gan và không có hiện tượng chảy máu nhu mô gan) Đây là những bằng chứng cụ thể về hiệu quả bảo vệ gan của dịch chiết cây Cà gai leo[28]

Năm 2000, Nguyễn Thị Minh Khai và cộng sự thực hiện đề tài: “Nghiên cứu thuốc từ Cà gai leo làm thuốc chống viêm và ức chế sự phát triển của xơ gan” - đã chứng minh tác dụng bảo vệ gan, ức chế sự phát triển xơ gan của dạng chiết toàn phần với hoạt chất chính là glycoalcaloid[15]

Năm 2001, Nguyễn Thị Minh Khai và cộng sự đã nghiên cứu điều trị hỗ trợ bệnh nhân viêm gan virus B mãn tính thể hoạt động (giai đoạn 3) bằng thuốc từ Cà gai leo, thử lâm sàng trên 50 bệnh nhân viêm gan B mãn tính thể hoạt động rút ra kết luận rằng 66,7% đã giảm các triệu chứng của bệnh viêm gan như vàng da, vàng mắt, đau hạ sườn, nước tiểu vàng, mệt mỏi Ngoài ra, thuốc còn không gây bất kỳ tác dụng phụ nào do thành phần chính là thảo dược tự nhiên[14]

Năm 2002, Nguyễn Thị Bích Thu thực hiện đề tài: “Nghiên cứu cây Cà gai leo làm thuốc chống viêm gan và ức chế xơ gan” - đã thử tác dụng của dạng chiết toàn phần Cà gai leo trên mô hình chống viêm mạn, trên colagenase, mô hình xơ gan thực nghiệm, tác dụng chống oxy hoá và đã xác định hoạt chất chính có tác dụng ức chế sự phát triển của xơ gan, chống viêm, bảo vệ gan trong cao toàn phần của Cà gai leo là glycoalkaloid và còn phát hiện những tác dụng dược lý mới của Cà gai leo như tác dụng trên hệ miễn dịch, trên tế bào ung thư[5][6][8]

Năm 2011, Nguyễn Hoàng Lộc và Huỳnh Văn Kiệt đã nghiên cứu phương pháp

nuôi cấy in vitro Cà gai leo, với công thức khử mẫu 1 phút trong cồn 70o, sau đó lắc trong HgCl2 0,1% trong 8 phút rồi rửa lại 3 lần với nước cất, cắm vào môi trường

MS chứa 3% Sucroza và 0,8% agar, bổ sung với 0,1 mg/L IBA, 1,8 mg/L kinetin và

để thu sinh khối, có máy lắc với tốc độ 150 rpm, thể tích là 20 mL Phân tích kết quả bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) cho thấy solasodine trong dịch treo tế bào sau 4 tuần tuổi (121,01 mg/g) là cao hơn so với rễ cũ 1 năm (20,52 mg/g) khoảng 6 lần[37]

I.3 Nuôi cấy mô, tế bào thực vật

Nuôi cấy mô thực vật là một trong những ứng dụng đạt được nhiều thành công nổi bật của công nghệ sinh học thực vật

I.3.1 Khái niệm

Thuật ngữ “nuôi cấy mô, tế bào thực vật” được dùng một cách rộng rãi để nói

về việc nuôi cấy tất cả các phần của thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong điều kiện vô trùng để tạo thành những khối tế bào hay cây hoàn chỉnh[9][16]

I.3.2 Cơ sở và ứng dụng

Tính toàn năng của tế bào: mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đầy đủ của cả cơ thể sinh vật đó Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành cây hoàn chỉnh

Sự phân chia, phân hóa, phản phân hóa của tế bào: cơ thể thực vật trưởng thành

là một thể thống nhất gồm nhiều cơ quan có chức năng khác nhau và bắt nguồn từ một tế bào hợp tử ban đầu Tế bào này phân chia thành một khối tế bào chưa chuyên hóa rồi biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc trưng cho từng mô và cơ quan chức năng khác nhau Đây là hiện tượng phân hóa tế bào Tuy nhiên, các tế bào

chuyên hóa đó không mất đi hoàn toàn sự biến đổi của mình Trong những điều kiện thích hợp, các tế bào chuyên hóa có thể trở thành các tế bào chưa chuyên hóa Đây

là hiện tượng phản phân hóa tế bào

Ứng dụng của nuôi cấy mô là nhân giống nhanh với số lượng lớn; tạo giống cây trồng sạch bệnh và đồng nhất về mặt di truyền; sản xuất giống cây trồng không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên; tế bào thực vật và các mô nuôi cấy cung cấp một phương tiện tiềm năng cho nghiên cứu sinh tổng hợp và tích lũy của chất chuyển hóa thứ cấp trong thực vật[9][16]

I.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng

I.3.3.1 Mẫu cấy

Mẫu cấy được tách ra từ cơ thể mẹ sạch bệnh và phát triển trong điều kiện dinh dưỡng tốt Tình trạng tuổi sinh lý của mẫu cấy không nên quá già hay quá non, sự hình thành rễ từ mô của những cây còn non dễ hơn là những cây đã trưởng thành; tử diệp có khả năng tái sinh cao hơn lá; cặp lá đầu tiên tái sinh tốt hơn các lá mọc sau Trong quá trình nuôi cấy thì vị trí lấy mẫu cũng ảnh hưởng rất nhiều, mặc dù mẫu cấy được lấy trên cùng một cơ quan nhưng khả năng tái sinh của mỗi mẫu khác nhau là do một cơ quan được cấu tạo bởi nhiều mô khác nhau và có độ tuổi khác nhau Khả năng tái sinh của mẫu cấy thay đổi theo tùy loài thực vật, cây thân thảo tái sinh dễ hơn nhiều so với cây bụi và cây thân gỗ do tổ chức giải phẫu thực vật

khác nhau; ở thực vật phân biệt giới tính (ví dụ như cây Kiwi- Actinidia chinensis)

thì cây cái dễ tái sinh hơn cây đực Mẫu cấy có kích thước lớn đôi khi dễ tái sinh hơn những mẫu có kích thước nhỏ, do mẫu lớn có nguồn dự trữ dinh dưỡng dồi dào hơn

Mẫu cấy sau khi lựa chọn được rửa sạch bằng xà phòng và khử trùng bề mặt bằng các chất khử trùng hóa học như calcium hypochloride, chlorur thủy ngân, sodium dichloroisocyanuarate[9][16]

I.3.3.2 Môi trường nuôi cấy

Trong nuôi cấy mô, môi trường nuôi cấy là một trong những yếu tố quan trọng nhất quyết định sự tăng trưởng và phát sinh hình thái tế bào Môi trường nuôi cấy thực vật tùy theo loại, bộ phận nuôi cấy, giai đoạn phân hóa của mẫu cấy Tuy vậy, tất cả môi trường nuôi cấy đều bao gồm năm thành phần: khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin, đường, các chất điều hòa sinh trưởng thực vật Ngoài ra, người ta còn bổ sung một số chất hữu cơ có thành phần xác định (amino acid, EDTA ) và một số chất có thành phần không xác định như nước dừa, dịch chiết nấm lên men

Một số công thức môi trường được sử dụng chủ yếu để nuôi cấy mô, tế bào thực vật được mô tả bởi White, Murashige và Skoog, Gamborg và cộng sự (1962), Và đặc biệt môi trường sử dụng nuôi cấy phải đảm bảo yếu tố vô trùng, tức là không có các yếu tố vi sinh tồn tại trong môi trường mà mắt thường có thể nhìn thấy[9][16]

I.3.3.3 Điều kiện nuôi cấy

Ánh sáng

Ánh sáng có tác động đến sự tăng trưởng và khả năng phát sinh hình thái của tế

bào trong nuôi cấy in vitro Mỗi loài thực vật khác nhau có những đáp ứng khác

nhau với từng loại ánh sáng, cường độ và thời gian chiếu sáng khác nhau Cường độ chiếu sáng cao làm tăng sự thoát hơi nước, môi trường nuôi cấy bị khô và nước trong tế bào sẽ giảm xuống gây ảnh hưởng đến sự phân chia và tăng trưởng của chúng Ngược lại, cường độ chiếu sáng yếu làm ảnh hưởng đến sự dự trữ chất dinh dưỡng của cây vì sự quang hợp kém hơn sự hô hấp Cường độ chiếu sáng trong phòng nuôi cấy mô thường trong khoảng 2000-3000 lux[10][21]

Nhiệt độ

Nhiệt độ trong khoảng 17 - 25 oC thường được áp dụng để cảm ứng sự tạo mô sẹo và sự tăng trưởng của tế bào nuôi cấy Nhiệt độ kích thích sự ra rễ tốt nhất là 25-28 oC Nhưng mỗi loài thực vật sẽ thích hợp với một nhiệt độ khác nhau Toivonen và cộng sự (1992) nhận thấy khi giảm nhiệt độ trong quá trình nuôi cấy sẽ làm tăng lượng acid béo tổng số trong mỗi tế bào (tính theo trọng lượng khô)[10][21]

pH

Độ pH của môi trường ảnh hưởng đến sự hòa tan các muối khoáng cần thiết cho cây Người ta thường chỉnh pH khoảng 5,7 - 5,8, đây là mức tốt để cây có thể hấp thụ muối khoáng Những thay đổi của pH chủ yếu do nhiệt độ, thời gian khử trùng, vật liệu nuôi cấy và agar[10][21]

Sự thoáng khí

Sự thoáng khí được hiểu như sự hiện diện của O2 và CO2 giúp cho cây quang hợp và hô hấp Mục đích của tăng cường trao đổi không giữa bình nuôi cấy và môi trường bên ngoài nhằm: tăng hàm lượng CO2 ở mức tối ưu trong bình nuôi cấy

nhằm tăng cường khả năng quang hợp của cây in vitro; giảm hàm lượng ethylen và

độc tố; giảm hàm lượng O2 trong bình nuôi cấy xuống khoảng 10%; giải quyết vấn

đề thủy tinh thể của cây do độ ẩm trong bình nuôi cấy cao; hình thành hệ rễ thứ cấp

ngay trong giai đoạn in vitro[10][21]

Muối khoáng

Nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với nhu cầu của cây ngoài tự nhiên Vì vậy, việc bổ sung đầy đủ các khoáng đa lượng và vi lượng là điều cần thiết[10][21]

Nguồn carbon

Nguồn carbon chủ yếu cho mô nuôi cấy là đường Mô tế bào nuôi cấy có sự quang hợp giới hạn, vì vậy người ta cần thêm glucose cần thiết cho sự tăng trưởng của mô vào môi trường nuôi cấy[10][21]

Vitamin

Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau, các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamin HCl (vitamin B1), pyridoxine HCl (vitamin B6), acid nicotinic, myo-inosiol[10][21]

Agar

Agar là một polyosid có trọng lượng phân tử cao, được chiết ra từ rong biển loại gelidium Có tác dụng làm giá thể giúp mô nuôi cấy không bị ngập trong môi

trường gây chết mô do thiếu oxi Tuy nhiên, người ta ít biết về sự ảnh hưởng của agar và nồng độ của nó trên sự ra rễ bất định Theo Németh (1986), sự hình thành rễ bất định, đặc biệt là cây thân gỗ không được tốt trong môi trường có agar; vì vậy đôi khi người ta dùng môi trường lỏng để nuôi cấy các loại cây thân gỗ Hơn nữa, nếu được cấy trong môi trường quá đặc thì rễ khi hình thành sẽ mọc hướng lên không khí[10][21]

Than hoạt tính

Than hoạt tính ảnh hưởng trên ba mặt: hút các hợp chất cản, hút các chất điều hoà sinh trưởng thực vật trong môi trường nuôi cấy hoặc làm đen môi trường tạo điều kiện để phát sinh rễ Khả năng kích thích sự tăng trưởng của tế bào mô thực vật

là do than hoạt tính kết hợp với các hợp chất phenol độc do mô tiết ra trong suốt thời gian nuôi cấy[10][21]

I.3.3.4 Chất điều hòa sinh trưởng

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật (còn gọi là các hormone sinh trưởng) là những chất được sinh ra trong cây để điều khiển các quá trình sinh trưởng phát triển của cây Bao gồm 2 nhóm: một là nhóm kích thích sinh trưởng có auxin, cytokinin, gibberelin và hai là nhóm ức chế sinh trưởng có acid absicic, ethylen và các hợp chất phenol

Hiện nay, người ta đã xác định được cấu tạo hóa học của các chất này và đã điều chế được những chất có tác dụng tương tự như các chất điều hòa sinh trưởng sinh ra trong cây để ứng dụng trong sản xuất

Auxin

Auxin rất cần thiết cho sự phân chia và tăng trưởng của tế bào nên nó có vai trò quan trọng trong sự phát sinh hình thái thực vật Auxin được tổng hợp trong ngọn thân, trong mô phân sinh (ngọn và lóng) và lá non (tức là nơi có sự phân chia tế bào nhanh) Sau đó, auxin di chuyển tới rễ và tích tụ trong rễ[20]

Auxin có tác động mạnh mẽ lên sự tăng trưởng tế bào, sự acid hóa vách tế bào, cảm ứng sự phân chia tế bào, kích thích sự hình thành mô sẹo, sự phát triển rễ và kích thích sự phân hóa mô dẫn Auxin kích thích sự kéo dài tế bào diệp tiêu và tế

rễ, auxin cần phối hợp với các vitamin (như thiamin mà rễ không tổng hợp được), acid amin (như arginin), nhất là các hợp chất ortho-diphenolic (như acid cafeic, acid chlorogenic)

Trong số các loại auxin được sử dụng trong nuôi cấy in vitro, 2,4-D được xem

là một auxin mạnh, có tác động hình thành mô sẹo Tuy nhiên, nếu sử dụng ở nồng

độ quá cao, auxin này sẽ gây độc cho tế bào, thậm chí gây biến đổi di truyền Trong

sự hình thành sơ khởi của rễ bất định, sử dụng NAA, IAA hay IBA thường đạt hiệu quả cao hơn so với 2,4-D Tuy nhiên, tác động của auxin ngoại sinh trong sự phát sinh cơ quan còn tùy thuộc vào trạng thái sinh lý cũng như hàm lượng chất điều hòa nội sinh trong nuôi cấy Trong suốt quá trình tạo rễ bất định, hàm lượng IAA nội sinh tích lũy tăng cao Điều này được giải thích là do auxin ngoại sinh ức chế hoạt động của enzyme IAA oxidase và IBA có khả năng chuyển đổi thành IAA do đó cũng làm tăng nhanh lượng IAA nội sinh, kích thích sự hình thành rễ bất định[22] Cytokinin

Mô phân sinh ngọn rễ là nơi tổng hợp chủ yếu các cytokinin tự do cho cả cơ thể thực vật Ở rễ, cytokinin cản sự kéo dài nhưng kích thích tăng rộng tế bào (sự tăng trưởng củ) Cytokinin ngăn cản sự lão hóa, thúc đẩy sự trưởng thành của diệp lạp và

là nhân tố chính điều khiển quá trình tái sinh mạch giúp cho sự tạo chồi Trong sự hình thành chồi, cytokinin có thể được xử lý riêng rẽ hay phối hợp các loại để làm tăng khả năng hình thành và chất lượng chồi

Ở nồng độ cytokinnin cao sẽ đưa đến kết quả là tạo thành các cụm chồi Số lượng chồi hình thành tùy thuộc vào nồng độ cytokinin Tuy nhiên, cũng có những bất lợi nhất định trong việc điều chỉnh nồng độ để cảm ứng tạo nhiều chồi Cytokinin ở nồng độ thấp kích thích sự phát triển chồi nách, nồng độ cao hơn sẽ

cảm ứng hình thành chồi bất định nhưng chồi rất khó ra rễ

Ở một số loài thực vật, mặc dù sự hình thành chồi được cảm ứng bởi cytokinin nhưng chồi không xuất hiện cho đến khi khúc cắt được chuyển sang môi trường giảm hoặc không có cytokinin Cytokinin cần cho giai đoạn cảm ứng tạo chồi nhưng kìm hãm sự kéo dài của chồi Những vấn đề này có thể khắc phục bằng cách giảm nồng độ chất điều hòa sau một hoặc vài lần cấy chuyền để chồi được phát triển tốt nhất[22]

Tuy vậy, việc sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng có sẵn trong tự nhiên như cytokinin có trong nước dừa, dịch chiết khoai tây, chuối; auxin có trong hoa mười

giờ cũng mang lại rất nhiều kết quả cao trong nuôi cấy in vitro và còn đảm bảo mức

độ an toàn trong các sản phẩm tạo thành, đó là điều rất cần trong nền công nghiệp sản xuất dược liệu ngày nay [12][26]

I.3.4 Sự phát sinh rễ bất định trong nuôi cấy mô

Rễ bất định là những rễ thông thường ở thực vật có mạch và được tạo ra ở nhiều vùng trên cơ thể thực vật như đốt, nhánh phụ, lá Rễ bất định có thể mọc ra từ mô của thân trong điều kiện môi trường stress hay bị vết thương cơ học hoặc trong môi trường tái sinh chồi Sự tạo rễ bất định là một bước ngoặt quan trọng trong nuôi cấy những cây thuốc quý, gỗ quý, những cây lương thực, thực phẩm Có ít nhất hai con đường hình thành rễ bất định: từ những tế bào có khả năng tạo cơ quan như tế bào tượng tầng hay từ mô sẹo

Sự hình thành rễ bất định được điều hòa bởi nhiều nhân tố môi trường và các yếu tố nội sinh Auxin và ethylen được xem là hai hormone kích thích sự hình thành

rễ bất định trong khi cytokinin và gibberelin thì ngược lại

Sự hình thành rễ bất định bao gồm hai giai đoạn:

- Giai đoạn tái phân chia của mô phân sinh bên tức là một số tế bào xảy ra sự phản phân hóa mạch ở vùng xuất hiện rễ tạo nên một đám tế bào lộn xộn đó là mầm mống của rễ

Giai đoạn phản phân hóa xảy ra như sau: lúc đầu, không bào còn to, lạp thể và ti

thể phân cắt mạnh, càng lúc càng nhỏ, tế bào trở nên giống tế bào mô phân sinh cấp hai; sau đó tế bào chất đậm đặc dần, không bào phân chia, nhân và hạch nhân to ra Sau giai đoạn này thì tế bào có đặc tính của tế bào vùng mô phân sinh cấp một có khả năng phân chia cơ quan Tiếp theo, các tế bào có sự phát triển mạnh hoạt tính phân chia để tạo thành khối mô phân sinh nhỏ Sự phân chia tăng lên tạo thành mô sẹo hay vùng phát sinh hình thái chứa các tế bào mô phân sinh cấp một

- Giai đoạn thứ hai là sự sinh trưởng và kéo dài của rễ, rễ thoát khỏi vỏ ra ngoài tạo nên rễ bất định[11][13][17][20]

Hình 1.2: Sự hình thành và phát triển rễ A: Sự hình thành sơ khởi rễ; B: Sơ khởi rễ

và rễ kéo dài (Nguồn: Mai Trần Ngọc Tiếng, 2001)

I.3.5 Sự kháng oxy hóa

I.3.5.1 Khái niệm về gốc tự do

Oxy được xem như một nguyên tố quan trọng giúp con người duy trì sự sống, chúng tham gia vào quá trình hô hấp ở tế bào, sản sinh năng lượng cung cấp cho mọi hoạt động sống của con người

Khoảng vài thập niên gần đây, các nghiên cứu khoa học đã chứng tỏ rằng oxy vào cơ thể tham gia nhiều quá trình sinh hóa và trong các quá trình đó oxy tạo ra những tiểu phân trung gian gọi là các gốc tự do Các gốc tự do có nguồn gốc oxy

H2O2[41]

Các dạng oxy hoạt động này do có năng lượng cao, kém bền nên dễ dàng phản ứng với những đại phân tử như protein, lipid, DNA gây rối loạn các quá trình sinh hóa trong cơ thể Đồng thời, khi một phân tử sống bị các gốc tự do tấn công, nó sẽ mất điện tử và trở thành một gốc tự do mới, tiếp tục phản ứng với những phân tử khác tạo thành một chuỗi phản ứng thường gọi là phản ứng dây truyền, gây ra các biến đổi có tác hại đối với cơ thể

Gốc tự do được tạo ra bằng nhiều cách Nó có thể là sản phẩm của những căng thẳng tâm thần, bệnh hoạn thể xác, mệt mỏi, ô nhiễm môi trường, thuốc lá, dược phẩm, tia phóng xạ mặt trời, thực phẩm có chất màu tổng hợp, nước có nhiều chlorine và ngay cả oxy[39]

I.3.5.2 Lợi ích của gốc tự do đối với cơ thể

Không phải là gốc tự do nào cũng có hại đối với cơ thể Nếu được kiểm soát, nó

là ngồn cung cấp năng lượng cho cơ thể, tạo ra chất màu melamine cần cho thị giác, góp phần sản xuất prostaglandins có công dụng ngăn ngừa nhiễm trùng, tăng cường miễn dịch, làm dễ dàng cho sự truyền đạt tín hiệu thần kinh, co bóp cơ thịt

I.3.5.3 Tác hại của gốc tự do đối với cơ thể

Gốc tự do có tác dụng không tốt cho cơ thể liên tục ngay từ lúc con người mới sinh ra và mỗi tế bào chịu sự tấn công của cả chục ngàn gốc tự do mỗi ngày Nếu không được kiểm soát, kiềm chế, gốc tự do gây ra các bệnh thoái hóa như: ung thư,

xơ vữa động mạch, làm suy yếu hệ thống miễn dịch gây dễ bị nhiễm trùng, làm

giảm trí tuệ, teo cơ quan bộ phận ở người cao niên, phá rách màng tế bào khiến chất dinh dưỡng thất thoát, tế bào không tăng trưởng rồi chết Chúng tạo ra chất lipofuscin tích tụ dưới da khiến ta có những vết đồi mồi trên mặt, trên mu bàn tay Ngoài ra, chúng còn tiêu hủy hoặc ngăn cản sự tổng hợp các phân tử protein, đường bột, lipid, enzyme trong tế bào, gây đột biến ở gene, ở DNA, RNA, làm chất collagen và elastin mất đàn tính, dẻo dai khiến da nhăn nheo, cơ khớp cứng nhắc

Theo các nhà nghiên cứu, gốc tự do hủy hoại tế bào theo chu trình sau đây: trước hết, gốc tự do oxy hóa màng tế bào, gây trở ngại trong việc thải chất bã và tiếp nhận thực phẩm, dưỡng khí rồi gốc tự do tấn công các ty thể, phá vỡ nguồn cung cấp năng lượng Sau cùng bằng cách oxy hóa gốc tự do làm suy yếu kích thích

tố, enzyme khiến cơ thể không tăng trưởng được

Trong tiến trình hóa già, gốc tự do cũng góp phần và có thể là nguy cơ gây tử vong Hóa già được coi như một tích tụ những thay đổi trong mô và tế bào Theo bác sĩ Denham Harman, các gốc tự do là một trong nhiều nguyên nhân gây ra sự hóa già và sự chết của các sinh vật Ông cho là gốc tự do phản ứng lên ty thể, gây tổn thương các phân tử bằng cách làm thay đổi hình dạng, cấu trúc, khiến chúng trở nên vô dụng và mất khả năng sản xuất năng lượng

Các gốc dạng oxy hóa hoạt động (ROS) sẽ được loại bỏ bằng các chất chống oxy hóa tự nhiên có sẵn trong cơ thể như enzyme superoxide dismutase (SOD), enzyme glutathione peroxidase (GSP-Px), enzyme catalase (CAT)… để tạo sự cân bằng giữa các dạng oxy hoạt động và các dạng chống oxy hóa trong cơ thể con người Đó là một trạng thái cơ bản của cân bằng nội mô (homeostasis) Trạng thái sinh lí này gọi là stress oxy hóa (oxidative stress) Hay nói cách khác stress oxy hóa

là sự rối loạn giữa các chất chống oxy hóa và các chất oxy hóa theo hướng tạo ra nhiều các chất oxy hóa

Ngày nay, do ảnh hưởng của điều kiện sống như: ô nhiễm môi trường, tiếng ồn, căng thẳng, lo lắng hay sử dụng thực phẩm chứa nhiều chất oxy hóa đã tạo điều kiện làm gia tăng gốc tự do, kéo theo sau đó là sự gia tăng các dạng oxy hoạt động

I.3.5.4 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa bằng thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH

Năm 1922, Golschmidt và Rem đã phát hiện ra một gốc tự do bền có màu tím đậm, hầu như không phân hủy, không nhị trùng hóa và cũng không phản ứng với oxy đó chính là gốc tự do DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) DPPH không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ Dung dịch DPPH có cực đại hấp thu tại 517

nm, sản phẩm khử của nó là DPPH-H (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazine) có màu vàng cam[40] Ngày nay, DPPH được sử dụng để khảo sát khả năng ức chế gốc tự do Phương pháp này rất hữu hiệu được dùng phổ biến vì đơn giản, nhanh chóng và ổn định

Nguyên tắc

DPPH là một góc tự do bền, dung dịch có màu tím, bước sóng cực đại hấp thụ tại 517 nm Các chất có khả năng kháng oxi hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt

Phản ứng trung hòa gốc DPPH của các chất kháng oxy hóa được minh họa bằng phản ứng được mô tả bên dưới:

20Hình 1.3: Phản ứng trung hòa DPPH

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

II.1: Vật liệu

II.1.1: Địa điểm thực hiện

Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào, khoa Công nghệ sinh học, trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh, cơ sở 3 Bình Dương

Thời gian: 06/2015 - 06/2016

II.1.2: Đối tượng nghiên cứu

Hạt Cà gai leo được khử với Javel 10%, trong thời gian 5 phút Sau 4 tuần nảy mầm, lá và đoạn thân cây được lấy làm mẫu thí nghiệm

Rễ cây Cà gai leo được thu nhận sau 8 tuần nuôi cấy in vitro rửa sạch, phơi

khô, cô cao và tiến hành khảo sát khả năng kháng oxi hóa

II.1.4: Môi trường nuôi cấy

Sử dụng môi trường nuôi cấy MS cơ bản, bổ sung một số thành phần:

- Đường: 30 g/L

- Agar: 7,5 g/L

- pH: 5,7 - 5,8 Chất điều hoà tăng trưởng thực vật: IAA, NAA

Chất điều hòa sinh trưởng có trong dịch chiết hoa mười giờ (IAA)[42]

Sử dụng chai thuỷ tinh 500 mL, cho vào mỗi chai 40 mL môi trường, hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm, trong 1 giờ 30 phút

II.1.5: Điều kiện nuôi cấy

- Độ ẩm trung bình : 70 ± 5 %

- Nhiệt độ : 26 ± 24 0C

- Thời gian chiếu sáng : 16 giờ/ngày

II.1.6: Hoá chất dùng trong nuôi cấy mô

o Indol-3-acetic acid (IAA)

o α-Napthalen acetic acid (NAA)

II.1.7: Hóa chất khảo sát khả năng kháng oxy hóa

- Cồn tuyệt đối 99,7 %

- Cồn 960

- Nước cất 1 lần

- 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (Merck- Germany)

- Acid ascorbic (vitamin C)

II.2: Phương pháp nghiên cứu

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức 9 lần lặp lại

Số liệu được xử lí bằng phần mềm Excel 2013, Statgraphic Plus 3.0

II.2.1: Tạo rễ bất định cây Cà gai leo Solanum hainanense Hance

II.2.1.1: Khảo sát sự tạo rễ bất định từ lá in vitro

Mục đích thí nghiệm: Khảo sát nồng độ chất điều hòa tăng trưởng thực vật

nhằm tìm ra môi trường tạo nhiều rễ nhất từ lá cây Cà gai leo in vitro

Vật liệu thí nghiệm: Lá ở vị trí thứ 2, 3, 4 (hình II.1) từ chồi Cà gai leo in vitro

sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS cơ bản

Hình 2 1: Chồi Cà gai leo in vitro sau 4 tuần nuôi cấy

Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng tạo rễ bất định từ lá Cà gai leo trong môi

trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật IAA

Môi trường nuôi cấy: Môi trường MS bổ sung chất điều hòa tăng trưởng IAA

theo bảng 2.1

Mô tả thí nghiệm: Cấy lá Cà gai leo in vitro vào môi trường MS bổ sung chất

điều hoà tăng trưởng thực vật IAA với nồng độ thay đổi

Thời gian theo dõi: 8 tuần

Chỉ tiêu đánh giá: số lượng rễ, chiều dài rễ, trọng lượng tươi rễ

Bảng 2 1: Ảnh hưởng của IAA trong quá trình tạo rễ bất định từ lá Cà gai

Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng tạo rễ bất định từ lá Cà gai leo trong môi

trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật NAA

Môi trường nuôi cấy: Môi trường MS bổ sung chất điều hòa tăng trưởng NAA

theo bảng 2.2

Mô tả thí nghiệm: Cấy lá Cà gai leo in vitro vào môi trường MS bổ sung chất

điều hoà tăng trưởng thực vật NAA với nồng độ thay đổi

Thời gian theo dõi: 8 tuần

Chỉ tiêu đánh giá: số lượng rễ, chiều dài rễ, trọng lượng tươi rễ

Bảng 2 2: Ảnh hưởng của NAA trong quá trình tạo rễ bất định từ lá Cà

gai leo in vitro

II.2.1.2: Khảo sát sự tạo rễ bất định từ đoạn thân in vitro

Mục đích thí nghiệm: Khảo sát nồng độ chất điều hòa tăng trưởng thực vật

nhằm tìm ra môi trường tạo ra nhiều rễ nhất từ đoạn thân in vitro

Vật liệu thí nghiệm: Đoạn thân dài 1-1,5 cm ở vị trí thứ 2, 3, 4 của cây Cà gai

leo in vitro sau 4 tuần nuôi cấy trong môi trường MS cơ bản như hình II.1

Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng tạo rễ bất định từ đoạn thân Cà gai leo trong

môi trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật IAA

Môi trường nuôi cấy: Môi trường MS bổ sung chất điều hòa tăng trưởng IAA

Mô tả thí nghiệm: Cấy đoạn thân Cà gai leo in vitro vào môi trường MS bổ

sung chất điều hoà tăng trưởng thực vật IAA với nồng độ thay đổi

Thời gian theo dõi: 8 tuần

Chỉ tiêu đánh giá: số lượng rễ, chiều dài rễ, trọng lượng tươi rễ

Bảng 2 3: Ảnh hưởng của IAA trong quá trình tạo rễ bất định từ đoạn thân Cà

gai leo in vitro

Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng tạo rễ bất định từ đoạn thân Cà gai leo trong

môi trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật NAA

Môi trường nuôi cấy: Môi trường MS bổ sung chất điều hòa tăng trưởng NAA

theo bảng 2.4

Mô tả thí nghiệm: Cấy đoạn thân Cà gai leo in vitro vào môi trường MS bổ

sung chất điều hoà tăng trưởng thực vật NAA với nồng độ thay đổi

Thời gian theo dõi: 8 tuần

Chỉ tiêu đánh giá: số lượng, chiều dài rễ, trọng lượng tươi rễ

Bảng 2 4: Ảnh hưởng của NAA trong quá trình tạo rễ bất định từ đoạn

thân Cà gai leo

Thí nghiệm 5: Khảo sát khả năng tạo rễ bất định từ đoạn thân Cà gai leo trong

môi trường MS có bổ sung dịch chiết hoa mười giờ

Môi trường nuôi cấy: Môi trường MS bổ sung dịch chiết hoa mười giờ theo

bảng 2.5

Mô tả thí nghiệm: Cấy đoạn thân Cà gai leo in vitro vào môi trường MS bổ

sung dịch chiết hoa mười giờ với nồng độ thay đổi

Thời gian theo dõi: 8 tuần

Chỉ tiêu đánh giá: số lượng rễ, chiều dài rễ, trọng lượng tươi rễ

Bảng 2 5: Ảnh hưởng của dịch chiết hoa mười giờ trong quá trình tạo rễ

bất định từ đoạn thân Cà gai leo in vitro

NT Nồng độ dịch chiết hoa mười giờ

II.2.2: Cách thu nhận các chỉ tiêu đánh giá

Các số liệu như số rễ, chiều dài rễ, trọng lượng tươi của rễ được lấy trên từng mẫu Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 9 lần lặp lại Các số liệu được xử lí bằng phần mềm STATGRAPHICS Plus 3.0

II.2.3: Định tính alkaloid

Tiến hành định tính alkanoid bằng 3 loại thuốc thử là: Thuốc thử Mayer, thuốc

thử Wagner, thuốc thử Dragendorf trên dịch chiết từ rễ Cà gai leo in vitro được thu

nhận sau 1 giờ đun cách thủy với H2SO4 1%

Thuốc thử Mayer (1865) hòa tan 1,36 g HgCl2 và 5 g KI trong 100 mL nước: alkaloid sẽ xuất hiện kết tủa màu trắng hoặc vàng nhạt

Thuốc thử Wagner (1863) hòa tan 1,27 g I2 và 2 g KI trong 100 mL nước: alkaloid sẽ xuất hiện kết tủa màu nâu

Thuốc thử Dragendof (1881) hòa tan 8g Bi(NO3)3.H2O trong HNO3 30% và 27,2 g KI trong 50 mL nước, trộn 2 dung dịch với nhau và để yên trong 24 giờ, sau

đó lọc và bổ sung nước cho đủ 100 mL: alkaloid sẽ xuất hiện kết tủa cam đến nâu nhạt

Dịch chiết từ rễ Cà gai leo in vitro được cho vào các ống nghiệm với thể tích

mỗi ống là 5ml và bổ sung 1 giọt thuốc thử sau đó quan sát hiện tượng

Ống đối chứng: Nước cất và thuốc thử

Chỉ tiêu đánh giá: màu sắc dung dịch, có tủa.

II.2.4: Xác định solasodine trong rễ bất định Cà gai leo

Rễ cây Cà gai leo sau 8 tuần nuôi cấy in vitro được thu nhận, sấy khô ở nhiệt

độ phòng đến trọng lượng không đổi, tiến hành Soxhlet trong 3 giờ sau đó cô cao Mục đích: Tạo nguyên liệu cho thí nghiệm sắc ký

Quy trình chiết cao thô[37]:

II.2.5: Sắc ký bản mỏng TLC

Bản mỏng: Silicagel 60 F254

Dung môi khai triển: Chloroform : methanol (19:1)[29]

Dung dịch thử: dùng dịch chiết HMG, IAA

Dung dịch chuẩn: hòa 1 mg solasodine trong 1 ml methanol

Chấm dung dịch lên bản mỏng: kẻ một vạch thẳng nằm ngang bằng bút chì, cách mép dưới bản mỏng 1 cm làm vạch xuất phát Dùng mao quản chấm các vết dung dịch thử và dung dịch chuẩn lên đó Các vết cách nhau 1 cm

Triển khai sắc ký: đặt bản mỏng vào bình sắc ký đã bão hòa hơi dung môi, mép phía chấm mẫu được nhúng vào dung môi nhưng không được cho điểm đã chấm mẫu chạm trực tiếp vào dung môi Sau khi dung môi chạy được ba phần bốn bản mỏng, lấy ra để sấy khô

Phát hiện các vết trên bản mỏng: soi bản mỏng dưới đèn UV có bước sóng 254

Rễ cây Cà gai leo ở các thí nghiệm sau 8 tuần nuôi cấy in vitro được thu

nhận, sấy khô ở nhiệt độ phòng đến trọng lượng không đổi, tiến hành Soxhlet trong

3 giờ sau đó cô cao để thử khả năng kháng oxy hóa Quy trình chiết cao thô:

II.2.6.2: Thuốc thử DPPH và dung dịch chuẩn

Thuốc thử DPPH-: DPPH- được pha trong cồn tuyệt đối 99,7 % với nồng độ 0,4 mg/mL để ổn định trong tối ở nhiệt độ 4 0C trong thời gian 30 phút sau đó được sử dụng để thử nghiệm

Dung dịch chuẩn: Ascorbic acid (vitamin C) được pha trong nước cất 1 lần với nồng độ 0,05 mg/mL bảo quản trong tối, ở nhiệt độ phòng

II.2.6.3: Thử nghiệm kháng oxy hóa

Khảo sát khả năng chống oxi hóa bằng gốc tự do DPPH- được thực hiện theo phương pháp của Connan và cs; Turkment và cs

Mẫu được pha loãng trong cồn 960 với nồng độ 80 mg/ml cho đều vào 3 ống nghiệm được phủ giấy nhôm, với thể tích mẫu trong mỗi ống nghiệm là 4 mL Mẫu đối chứng dương (+) là ascorbic acid nồng độ 0,05 mg/ml cho vào 1 ống nghiệm được phủ giấy nhôm với thể tích 4 mL

Mẫu đối chứng âm (-) là nước cất cho vào 1 ống nghiệm được phủ giấy nhôm với thể tích 4 mL

Cao thô Dịch chiết

5g rễ in vitro

100 ml Cồn 960Soxhlet

Cô quay

Mẫu đo 3 lần lấy số liệu trung bình của 3 mẫu, được so sánh với mẫu đối chứng dương và mẫu đối chứng âm Khả năng bẫy gốc tự do DPPH- được xác định bằng %

ức chế I (%) và được tính theo công thức:

C

S C

A

A

Trong đó:

- Ac: giá trị mật độ quang của dung dịch không có mẫu cao (control)

- As: giá trị mật độ quang của dung dịch có mẫu cao (sample)

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

III.1 Khảo sát sự hình thành rễ bất định từ lá Cà gai leo in vitro trong môi trường có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật IAA và NAA

III.1.1: Khảo sát sự hình thành rễ bất định từ lá trong môi trường bổ sung IAA

Sau 8 tuần nuôi cấy, rễ bất định hình thành từ lá Cà gai leo in vitro trên các

nghiệm thức trong môi trường MS có bổ sung IAA ở nồng độ thay đổi đã cho thấy tác động IAA với những tỷ lệ khác nhau lên sự hình thành số lượng, chiều dài khác nhau ở từng nghiệm thức

Bảng 3 1: Ảnh hưởng nồng độ IAA lên sự hình thành rễ bất định từ lá Cà gai

(mg/L)

Số rễ/mẫ

u

Chiều dài rễ (cm)

Trọng lượng tươi của rễ (gam)

I4 4 4,333

b

c 2,600bc 0,046c

Rễ dài, số lượng rễ nhánh ít, kích thước rễ nhỏ, hình thành cụm

chồi

I5 5 15,33b 6,422bc 0,194ab

Rễ dài, số lượng rễ nhánh nhiều, hình thành

cụm chồi

Các chữ cái a , b , c , d chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê với p < 0,05

Giữa các nghiệm thức thí nghiệm có sự khác biệt có ý nghĩa Ở nghiệm thức

đối chứng lá in vitro không hình thành rễ bất định và chết Rễ bất định được hình

thành sau 8 tuần nuôi cấy trong các nghiệm thức có bổ sung IAA cho thấy tác động của auxin nội sinh lên mẫu cấy Nghiệm thức I1 (MS + 1,0 mg/L IAA) có tỷ lệ rễ bất định cao nhất đạt 33,44 rễ/mẫu với chiều dài rễ đạt 7,033 cm và trọng lượng tươi của rễ là 0,356g khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng và các nghiệm thức khác (bảng 3.1 và hình 3.1)

6

5

4

Hình 3 1: Rễ bất định hình thành từ lá Cà gai leo in vitro sau 8 tuần tuổi Đối chứng

(1); MS + IAA 1,0 mg/L (2); MS + IAA 2,0 mg/L (3); MS + IAA 3,0 mg/L (4); MS +

IAA 4,0 mg/L (5); MS + IAA 5,0 mg/L (6)