TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA DƯỢC
Trang 1TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA DƯỢC
🙢✵🙠
BÁO CÁO THÍ NGHIỆM
HÓA SINH
BÀI 2 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME
BÀI 4 KHẢO SÁT LIPID
GVHD: TS Phạm Phước Điền Sinh viên: Nguyễn Quỳnh Như
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, THÁNG 08 NĂM 2021
Trang 2BÀI 2 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME
I LY TRÍCH VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CỦA α- AMYLASE MẦM LÚA
1 Ly trích
2 Khảo sát hoạt tính tương đối của α -amylase mầm lúa
2.1 Tiến hành thí nghiệm và kết quả
Chuẩn bị 8 ống nghiệm như trong bảng dưới đây
Ổn định nhiệt độ của bể điều nhiệt ở 50oC, sau đó cho các ống nghiệm từ 1 đến 4 vào ổn định 5 phút Sau khi kết thúc thí nghiệm ống nghiệm 1, lấy ra khỏi bể điều nhiệt và đưa ống 5 vào Làm tương tự với các ống nghiệm từ 6 đến 8
Hút 1,6ml dịch enzyme ly trích được ở trên cho vào ống nghiệm 1, đồng thời ghi nhận thời điểm đó Dùng pipet loại 1 ml khuấy nhẹ dung dịch và lấy ra 1 giọt để thử màu với iod Khi màu của dung dịch iod không thay đổi thì sự thủy phân tinh bột được coi là kết thúc Ghi lại thời điểm kết thúc
Khoảng 100 hạt lúa nẩy mầm Nghiền nhuyễn trong cối sứ với
50ml nước cất để hòa tan enzyme
Lọc dịch bằng giấy lọc Thu dịch lọc có chứa amylase
Trang 3 Kết quả của các lần đo được ghi ở bảng sau:
Ống nghiệm
Dung dịch
cho vào
Nước cất (ml) 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8
Để ổn định ở 50oC
Thể tích dịch enzyme (ml) 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2
Thời gian kết thúc thủy phân (s) 250 197 145 66 42 36 42 56
2.2 Nhận xét
Nhìn vào đồ thị ta thấy rằng:
Dịch chiết enzyme amylase thu được thường có họat tính xúc tác ít ổn định, hoạt tính thay đổi tùy theo điều kiện thí nghiệm và các yếu tố môi trường
0 50 100 150 200 250 300
Thể tích enzyme (ml)
Hoạt tính tương đối của enzyme amylase
Trang 4 Hoạt tính enzyme amylase ổn định nhất ở thể tích V = 1ml Khi tăng dần thể tích dịch enzyme trên 1ml (hay nồng độ enzyme tăng dần) thì thời gian kết thúc thủy phân tăng dần (hay tốc độ thủy phân giảm dần) Khi giảm dần thể tích enzyme dưới 1ml thì thời gian kết thúc thủy phân tăng chậm Từ đó cho thấy nếu nồng độ enzyme quá cao hoặc quá thấp có thể dẫn đến giảm hoạt tính xúc tác của enzyme 2.3 Hiện tượng
Những giọt đầu tác dụng với iod cho màu xanh đen, những giọt sau tác dụng với iod cho màu tím đến tím đỏ cuối cùng là không màu
2.4 Giải thích
Ban đầu, khi mới cho enzyme vào, tinh bột trong ống nghiệm chưa kịp bị thủy phân, nên khi tác dụng với iod cho ra màu xanh đen chính là tinh bột chưa thủy phân tác dụng với iod Sau đó, enzyme xúc tác thúc đẩy nhanh quá trình thuỷ phân tinh bột tạo thành amylodextrin (cho màu tím với iod), tiếp tục thuỷ phân tạo thành erythrodextrin (cho màu tím đỏ với iod), tiếp tục tạo thành acrodextrin (không kết hợp với iod nên không cho màu) tiếp tục tạo thành maltodextrin (không kết hợp với iod) cuối cùng tạo thành maltose và glucose (không kết hợp với iod)
Trong hồ tinh bột ở nhiệt độ thường, phân tử tinh bột và các sản phẩm thủy phân của nó là dextrin tồn tại dưới dạng các chuỗi xoắn; cứ 6 phân tử glucose lập thành
1 bước xoắn có thể hấp phụ 1 phân tử iod làm cho dung dịch có màu Màu này thay đổi tùy thuộc vào cấu trúc của phân tử tinh bột (tỉ lệ amylose/amylopectin) và chiều dài của phân tử Amylose cho màu xanh dương đậm với iod trong khi amylopectin lại cho màu tím đỏ với iod
II KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ CƠ CHẤT LÊN TỐC ĐỘ THỦY GIẢI CỦA AMYLASE
1 Tiến hành thí nghiệm và kết quả
Chuẩn bị thí nghiệm theo bảng dưới, tiến hành tương tự thí nghiệm đầu
Kết quả các lần đo được ghi ở bảng sau:
Trang 5Ống nghiệm
Nồng độ tinh bột tương ứng
Hồ tinh bột 1% (ml) 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6
Để ổn định ở 50oC
Thời gian kết thúc thủy phân (s) 241 222 216 201 166 131 92
2 Nhận xét
Khi tăng nồng độ cơ chất, thời gian kết thúc thủy phân giảm dần nghĩa là tốc độ phản ứng tăng dần
241
201
166
131
92
0 50 100 150 200 250 300
Hồ tinh bột 1% (ml)
ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ CƠ CHẤT ĐẾN TỐC ĐỘ
THỦY PHÂN CỦA AMYLASE
Trang 6 Khi tăng nồng độ cơ chất lên đến một giới hạn xác định nào đó, tốc độ phản ứng đạt giá trị cực đại Vmax, nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất lên nữa thì tốc độ phản ứng sẽ không tăng tiếp tục tăng
3 Giải thích
Trong quá trình tạo phức trung gian enzyme – cơ chất, do ảnh hưởng của enzyme,
cơ chất được hoạt hóa, cấu tạo của cơ chất bị biến đổi, phân tử của cơ chất bị phân cực, các electron được phân phối lại, do đó điện tích của cơ chất cũng thay đổi Các liên kết bên trong phân tử cơ chất trở nên lỏng lẻo hơn, năng lượng họat hóa
để vượt qua hàng rào năng lượng giảm, tốc độ phản ứng tăng lên
Khi tốc độ phản ứng đạt giá trị cực đại nếu ta tiếp tục thêm cơ chất vào thì tốc độ
sẽ không tăng nữa do tất cả các trung tâm hoạt động của enzyme đã được bão hòa bởi cơ chất
4 Kết luận
Với cùng một lượng enzyme xác định, nếu tăng dần lượng cơ chất trong dung dịch thì thoạt đầu hoạt tính của enzyme tăng nhưng đến một lúc nào đó thì sự gia tăng
về nồng độ cơ chất cũng không làm tăng hoạt tính enzyme Đó là vì tất cả các trung tâm hoạt động của enzyme đã được bão hòa bởi cơ chất
Tốc độ phản ứng của phần lớn các phản ứng biến đổi theo nồng độc của cơ chất
và nồng độ enzyme Khi tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng tăng chỉ khi nồng độ cơ chất tương đối thấp Khi nồng độ cơ chất lớn tốc độ phản ứng ít phụ thuộc vào nồng độ cơ chất và có khuynh hướng đạt cực đại do nồng độ enzyme có mặt quyết định
Với một lượng cơ chất xác định, nồng độ enzyme càng cao thì tốc độ phản ứng xảy ra càng nhanh Tế bào có thể điều hoà tốc độ chuyển hoá vật chất bằng việc tăng giảm nồng độ enzyme trong tế bào
Trang 7BÀI 4 KHẢO SÁT LIPID
I TÍNH HÓA TAN CỦA LIPID
1 Tính hòa tan của mỡ trung tính
1.1 Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị 4 ống nghiệm như bảng sau:
Ống nghiệm
Dầu thực vật 3 giọt 3 giọt 3 giọt 3 giọt
Dung môi 1 ml nước 1 ml Ethanol 1 ml Acetone 1 ml Ether Lắc đều, so sánh kết quả trong ống nghiệm 1 với các ống nghiệm còn lại
1.2 Hiện tượng
Ống 1: Dầu không tan trong nước, phân
tách thành 2 lớp khác nhau, dầu ở trên,
nước ở dưới
Ống 1: Dầu không tan trong ethanol, phân
tách thành 2 lớp khác nhau, dầu ở dưới,
ethanol ở lớp trên
Ống 3, 4: Lipid tan hoàn toàn trong dung môi và không có sự tách lớp
Trang 8Ống nghiệm 2 sau khi đun cách thủy thì
một phần lipid tan ra
1.3 Giải thích
Ống 1: Không tan, vì dầu thực vật là chất không phân cực, nước là dung môi phân
cực mạnh nên lipid và nước không hỗn hòa vào nhau Lớp dầu nổi lên trên mặt nước
vì tỷ trọng của lipid nhỏ hơn tỷ trọng của nước
Ống 2: Không tan, vì dầu thực vật là chất không phân cực, ethanol là dung môi phân
cực nên dầu không thể tan trong ethanol Lớp dầu chìm xuống đáy ống nghiệm vì tỷ trọng của lipid lớn hơn tỷ trọng của ethanol
Ống 3: Dầu thực vật tan trong dung môi acetone vì cả dầu và acetone đều là chất
không phân cực nên dễ dàng hòa tan vào nhau
Ống 4: Dầu thực vật tan trong dung môi ether vì cả dầu và ether đều là chất không
phân cực nên dầu thực vật dễ dàng tan trong ether
2 Tính hòa tan của Lecithin
2.1 Tiến hành thí nghiệm
Dùng 2 ml lòng đỏ trứng đã đánh nhuyễn cho vào
1 ống nghiệm 25ml, thêm vào ống nghiệm 10ml
cồn tuyệt đối, khuấy đều
Đun cách thủy ở nhiệt độ 75- 80oC, tiếp tục khuấy
đều trong 10 phút
Lọc hỗn hợp trên qua ống nghiệm khô, dung dịch
chiết tiến hành thí nghiệm sau:
Trang 9Ống nghiệm
2.2 Hiện tượng và giải thích
Ống 1: Không đổi màu
Ống 2: Có màu vàng đục nhẹ
Giải thích
Ống nghiệm 1 không đổi màu vì
lecithin không tan trong acetone
Ống nghiệm 2 đổi màu là do lecithin tan
trong nước cất dẫn đến sự chuyển màu của dung dịch
2.3 Kết luận
Do cấu tạo như trên nên lecithin trong nước sẽ tạo thành dung dịch gọi là dung dịch giả Nhờ đặc tính vừa kỵ nước vừa ưa nước mà phospholipid tham gia trong việc đảm bảo tính thấm một chiều trong mang cấu trúc tế bào
II CHỈ SỐ ACID CỦA LIPID
1 Tiến hành thí nghiệm
Cân 0,3 g chất béo cho vào bình tam giác 100 ml, thêm 10 ml ethylic ether (5 ml cồn 96% và 5 ml ether), lắc đều cho tan chất béo
Cho 2-3 giọt phenolphtalein vào và chuẩn độ bằng KOH 0,01N cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 30 giây
Trang 102 Tính toán kết quả
Thể tích KOH 0,01N đã dùng là: V = 0,1 ml
mKOH = 0,1 𝑥 0,01 𝑥 56 = 0,056 (g)
Chỉ số acid là số miligam KOH cần để trung hòa acid béo tự do có trong 1g chất béo
Chỉ số acid của lipid là: A = 0,056 𝑥 1000
0,3 ≈ 187
III ĐỊNH LƯỢNG THEO PHƯƠNG PHÁP SOXLET
1 Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị mẫu để chiết rút mẫu:
+ Cân 1 g lạc khô cho vào cối sứ, nghiền nhỏ, chuyển qua bao giấy, gấp miệng bao quanh cho lạc khỏi rơi vãi
+ Sấy lại bao đựng mẫu ở nhiệt độ 105oC trong 30 phút Lấy ra để nguội trong bình hút
ẩm, cân lại bao có chứa mẫu, xác định khối lượng bao mẫu
Chuẩn bị mẫu trên máy Soxlet:
+ Đặt bình đun trên nồi cách thủy, lắp bình chiết khớp với miệng của bình đun, đặt bao đựng mẫu vào đáy bình chiết, lắp ống sinh hàn khớp với miệng của bình chiết, đặt phễu thủy tinh lên miệng ống sinh hàn, lắp các ống cao su theo nguyên tắc bình thông nhau + Mở máy nước để nước chảy vào hệ thống sinh hàn Đổ dung môi hữu cơ (ether) qua phễu thủy tinh, sao cho lượng dung môi đủ ngập phễu và chiếm khoảng 2/3 dung tích bình đun
Chiết rút mỡ trên máy Soxlet:
+ Bật bếp cách thủy ở 45 – 50 oC, khi dung môi bắt đầu sôi mở kẹp ống cao su cho nước lạnh chạy vào hệ thống sinh hàn làm ngưng đọng hơi dung môi thành giọt xuống bình chiết chứa mẫu
+ Cẩn thận điểu chỉnh kẹp cao su cho nước từ từ chảy ra ngoài
Trang 11+ Thời gian chiết khoảng 1,5 – 2 giờ, sau đó tháo bình chiết ra, hứng vài giọt ether trên
lam kính, hơ kính nếu lam kính trong suốt thì chứng tỏ mỡ trong nguyên liệu đã được
chiết hết
+ Tắt bếp cách thủy, khóa máy nước, tháo ống sinh hàn, dùng đũa thủy tinh gắp gói mẫu
ra khỏi bình chiết
+ Đặt trên đĩa petri, để nơi thoáng gió để dung môi bay hết Sấy khô gói mẫu ở nhiệt độ
105oC khoảng 30 phút, để nguội trong bình hút ẩm
Cân, xác định khối lượng gói mẫu đã chiết rút lipid ở nhiệt độ khô tuyệt đối
2 Tính toán kết quả
Hàm lượng lipid trong mẫu được tính theo công thức sau:
𝑿𝒑 = (𝒂 − 𝒃) 𝒙 𝟐𝟖, 𝟎𝟓
𝒄
Trong đó X: Hàm lượng lipid có trong nguyên liệu ở độ khô tuyệt đối
a (g): Khối lượng gói mẫu ở độ khô tuyệt đối
b (g): Khối lượng gói mẫu đã chiết rút ở độ khô tuyệt đối
c (g): Khối lượng mẫu đem phân tích
Theo thực nghiệm ta được:
Khối lượng mẫu khô đem đi nghiền là 1 g
Khối lượng mẫu (bao gồm cả giấy bọc) sau khi sấy lại là 2,02 g
Khối lượng sau khi chiết rút lipid (bao gồm giấy bọc) là 1,50 g
Suy ra:
Xp = (2,02−1,50) 𝑥 28,05
1 = 14,586
Vậy hàm lượng lipid có trong 1 g lạc khô là 14,586%