Tổng hợp isoxazole curcumin từ curcumin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐH SƯ PHẠM KỸ THUẬT TPHCM BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN TỔNG HỢP ISOXAZOLE CURCUMIN TỪ CURCUMIN SV2019 – 143 Thuộc nhóm ngà

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TỔNG HỢP ISOXAZOLE CURCUMIN TỪ CURCUMIN

CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN

Tp Hồ Chí Minh, tháng 06/2019

SKC 0 0 6 9 7 8

MÃ SỐ: SV2019 – 143

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐH SƯ PHẠM KỸ THUẬT TPHCM

BÁO CÁO TỔNG KẾT

Thuộc nhóm ngành khoa học: Tự nhiên

TP Hồ Chí Minh, 06/2019

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN

TỔNG HỢP ISOXAZOLE CURCUMIN TỪ CURCUMIN

SV2019 – 143

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐH SƯ PHẠM KỸ THUẬT TPHCM

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN

TỔNG HỢP ISOXAZOLE CURCUMIN TỪ CURCUMIN

SV2019 – 143

Thuộc nhóm ngành khoa học: Tự nhiên

Dân tộc: Kinh

Lớp, khoa: 16128, Khoa CN Hóa học và Thực phẩm

Năm thứ: 03 /Số năm đào tạo: 04

Ngành học: Công nghệ Kỹ thuật Hóa học

Người hướng dẫn: TS Hoàng Minh Hảo

TP Hồ Chí Minh, 06/2019

i

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH iv

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về curcumin 2

1.1.1 Sơ lược về nghệ vàng và curcuminoid 2

1.1.2 Hoạt tính sinh học của curcuminoid 4

1.1.2.1 Hoạt tính kháng oxy hóa 5

1.1.2.2 Hoạt tính kháng viêm, kháng virus, vi khuẩn và ký sinh trùng 5

1.1.3.3 Hoạt tính kháng đông máu 6

1.1.1.4 Hoạt tính kháng ung thư 6

1.1.3 Pharmacophore của curcumin 7

1.1.4 Các dẫn xuất isoxazole và pyrazole của curcumin 8

1.2 Docking phân tử 9

1.2.1 Receptor – Cyclin Dependent Kinase 2 (CDK2) 9

1.2.2 Giới thiệu về phương pháp docking 11

1.2.3 Ý nghĩa của phương pháp docking phân tử 11

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Đối tượng nghiên cứu 12

2.2 Nguyên liệu, trang thiết bị 12

2.2.1 Nguyên liệu 12

ii

2.2.1.1 Nguyên liệu dùng trong tổng hợp 12

2.2.1.2 Nguyên liệu dùng trong kiểm nghiệm 12

2.2.2 Dụng cụ, trang thiết bị 12

2.2.2.1 Dụng cụ, trang thiết bị dùng trong tổng hợp 12

2.2.2.2 Dụng cụ, trang thiết bị dùng trong phân tích 13

2.3 Phương pháp nghiên cứu 13

2.3.1 Tổng hợp 13

2.3.1.1 Tổng hợp curcumin 13

2.3.1.2 Tổng hợp hợp chất isoxazole curcumin 15

2.3.2 Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc hóa học 16

2.3.2.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng 16

2.3.2.2 Phương pháp phổ 17

2.3.3 Phương pháp docking phân tử 17

2.3.3.1 Chuẩn bị cơ sở dữ liệu 17

2.3.3.2 Redocking 17

2.3.3.3 Docking 18

2.3.3.3 Đánh giá kết quả docking 19

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20

3.1 Kết quả tổng hợp curcumin và dẫn xuất isoxazole curcumin 20

3.1.1 Kết quả tổng hợp 20

3.1.1.1 Tính chất, độ tinh khiết 20

3.1.1.3 Xác định cấu trúc hóa học 20

3.1.2 Kết quả tổng hợp isoxazole curcumin 23

3.1.2.1 Tính chất, độ tinh khiết 23

3.1.2.2 Xác định cấu trúc hóa học 23

iii

3.2 Kết quả docking phân tử 25

3.2.1 Kết quả redocking 25

3.2.1.1 Tương tác của ligand đồng kết tinh với receptor 25

3.2.1.2 Kết quả redocking 26

3.2.2 Kết quả docking 27

3.3 Bàn luận về kết quả tổng hợp 28

3.3.1 Tổng hợp curcumin 28

3.3.2 Tổng hợp isoxazole curcumin 29

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31

TÀI LIỆU THAM KHẢO 32

PHỤ LỤC xxxv

iv

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Thân, củ nghệ vàng

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của curcuminoid

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của curcumin

Hình 1.4 Cấu trúc của protein CDK2

Hình 1.5 Cấu trúc của CDK2 (2R3I)

Hình 2.1 Hệ thống phản ứng tổng hợp curcumin

Hình 2.2 Kết quả bản mỏng của hỗn hợp phản ứng tổng hợp isoxazole sau 9h phản ứng Hình 2.3 Cách xác định giá trị x, y trên bản mỏng

Hình 2.4 Thông số redocking

Hình 2.5 Thông số docking phân tử curcumin và isoxazole curcumin

Hình 3.1 Kết quả bản mỏng của curcumin

Hình 3.2 Công thức cấu tạo của curcumin

Hình 3.3 Kết quả bản mỏng của hợp chất PT01

Hình 3.4 Cấu trúc hóa học của isoxazole curcumin

Hình 3.5 Tương tác giữa ligand đồng kết tinh với CDK2

Hình 3.6 Vị trí tương đối của ligand được re-dock (màu đỏ) so với ligand đồng kết tinh (màu xanh)

Hình 3.7 Tương tác của curcumin và isoxazole curcumin với CDK2

Hình 3.8 Cơ chế tổng hợp curcumin từ vanillin

Hình 3.9 Cơ chế tổng hợp isoxazole curcumin

v

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần các chất trong thân rễ nghệ

Bảng 1.2 Cấu trúc hóa học của curcumin và dẫn xuất

Bảng 2.1 Các hóa chất được sử dụng trong qui trình tổng hợp curcumin và dẫn xuất isoxazole curcumin

Bảng 3.1 Kết quả phổ NMR của curcumin

Bảng 3.2 Kết quả phổ NMR của hợp chất PT01

Bảng 3.3 Điểm số docking và acid amine gắn kết của curcumin và isoxazole curcumin

vii

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐH SƯ PHẠM KỸ THUẬT TPHCM

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

1 Thông tin chung:

- Tên đề tài: Tổng hợp isoxazole curcumin từ curcumin

năm đào tạo

Thực phẩm

03/04

- Người hướng dẫn: TS Hoàng Minh Hảo

2 Mục tiêu đề tài:

- Tổng hợp isoxazole curcumin từ curcumin

- Xác định cấu trúc hóa học của các dẫn xuất tổng hợp được

3 Tính mới và sáng tạo:

- Tổng hợp toàn phần curcumin từ vanillin và acetyl acetone Tiếp theo thực hiện phản

ứng giữa curcumin với hydroxylamine hydrochloride (NH2OH.HCl) để tổng hợp dẫn xuất isoxazole curcumin

4 Kết quả nghiên cứu:

Sau khi thực hiện đề tài, chúng tôi thu được những kết quả sau:

- Tổng hợp thành công curcumin từ vanillin và acetylacetone

- Tổng hợp thành công dẫn xuất isoxazole curcumin

- Xác định cấu trúc hóa học, độ tinh khiết của curcumin và dẫn xuất isoxazole curcumin bằng phương pháp TLC, phổ 1H, 13C-NMR và MS

5 Đóng góp về mặt giáo dục và đào tạo, kinh tế - xã hội, an ninh, quốc phòng và khả năng áp dụng của đề tài:

viii

Curcumin và dẫn xuất isoxazole curcumin được tổng hợp thành công là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo cho việc tổng hợp nhiều dẫn xuất curcumin hơn nữa nhằm khai

thác hết tiềm năng sinh học của curcumin và các dẫn xuất

6 Công bố khoa học của SV từ kết quả nghiên cứu của đề tài (ghi rõ tên tạp chí nếu

có) hoặc nhận xét, đánh giá của cơ sở đã áp dụng các kết quả nghiên cứu (nếu có): Không

Ngày 13 tháng 06 năm 2019

SV chịu trách nhiệm chính thực hiện đề tài

Nhận xét của người hướng dẫn về những đóng góp khoa học của SV thực hiện đề tài

(phần này do người hướng dẫn ghi):

1

MỞ ĐẦU

Curcuma longa L còn được gọi là cây nghệ vàng thuộc họ gừng (Zingiberaceae),

có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới Tamil Nadu, phía đông nam Ấn Độ Từ lâu, con người đã biết đến cây nghệ và sử dụng nó với nhiều mục đích khác nhau như làm gia vị, thuốc nhuộm, làm thuốc chữa bệnh Trong y học cổ truyền và dân gian, nghệ được sử dụng chữa các bệnh như bệnh loét dạ dày, loét ngoài da, hen suyễn, chữa bỏng Trong y học hiện đại ngày nay, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như chiếc tách các chất trong củ nghệ và nhận thấy curcumin, hoạt chất chính trong củ nghệ,

có tác dụng diệt khuẩn, diệt kí sinh trùng, kháng nấm, bảo vệ da, chống viêm nhiễm Đặc biệt, một số nghiên cứu cho thấy curcumin còn có tác dụng ức chế tế bào ung thư và ức chế tế bào HIV-1, HIV-1-RT Curcumin được xem là chất tiêu biểu cho các chất phòng chống ưng thư hiện nay, vì curcumin an toàn và không gây ra tác dụng phụ, chỉ tác dụng lên tế bào ung thư và không ảnh hưởng tới các tế bào lành Curcumin có tác dụng vô hiệu hóa các gốc tự do hình thành trong quá trình tự vệ của cơ thể, do bức xạ độc hại, cũng như

từ ngoài đưa vào cơ thể Vì thế, để tìm ra nhiều hơn nữa những dẫn xuất curcumin có hoạt tính sinh học cao, chúng tôi quyết định chọn và thực hiện đề tài “Tổng hợp isoxazole curcumin từ curcumin”

Trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu khoa học, curcumin được tổng hợp toàn phần

từ vanillin và acetyl acetone Isoxazole curcumin được tổng hợp bởi phản ứng giữa curcumin và hydroxylamine hydrochloride trong acid acetic Các sản phẩm được tinh chế bằng phương pháp thích hợp (kết tinh, sắc ký cột), xác định độ tinh khiết và cấu trúc hóa học bằng phương pháp TLC, phổ 1H, 13C – NMR và MS

2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về curcumin

1.1.1 Sơ lược về nghệ vàng và curcuminoid

Nghệ, hay còn gọi là nghệ vàng, thuộc họ gừng, thân cao khoảng 0,6 đến 1,0 mét Thân rễ có dạng hình trụ hoặc hơi dẹt, khi bẻ hoặc cắt ngang có màu vàng cam do có chứa chất màu curcuminoid Lá hình trái xoan, thon nhọn ở hai đầu, hai mặt đều nhẵn, lá khum hình máng rộng, đầu tròn màu xanh lục nhạt, lá non hẹp hơn, màu tím nhạt (Hình 1.1) Củ nghệ có vị đắng, cay, mùi thơm hơi nồng, chứa tinh dầu với hàm lượng 3 – 5 % màu vàng nhạt, thơm Ngoài ra, thành phần trong củ nghệ còn có tinh bột, canxi oxalate (CaC2O4)

và chất béo [1]

Hình 1.1 Thân, củ nghệ vàng

Hiện nay, nghệ là một cây trồng quen thuộc ở khắp các nước vùng nhiệt đới, từ Nam Á đến Đông Nam Á và Đông Á Ở Việt Nam, nghệ cũng được trồng ở khắp các địa phương, từ vùng đồng bằng ven biển đến vùng núi cao như Vĩnh Phúc, Hải Dương, Hưng Yên, Nghệ An, Quảng Nam, Đồng Nai, Bình Dương… Phần củ nghệ được sử dụng trong thực phẩm, dược phẩm

Nghệ là cây ưa ẩm, ưa sáng và có thể chịu nóng, cây có biên độ sinh thái rộng, thích nghi được với nhiều tiểu vùng khí hậu khác nhau Với mùa đông lạnh kéo dài nghệ vẫn tồn tại và sinh trưởng phát triển tốt

Thành phần hóa học chính và quan trọng nhất của củ nghệ là curcuminoid (curcumin, demethoxycurcumin – DMC, bisdemethoxycurcumin – BDMC), chiếm hàm

3

lượng khoảng 6%, là thành phần tạo màu vàng cho nghệ, trong đó lượng curcumin chiếm khoảng 70-80% khối lượng Trong củ nghệ còn chứa tinh dầu (hàm lượng từ 2-7%) với các thành phần chính là artumeron, zingberen, borneol [2, 3]

Ngoài ra còn có những thành phần với hàm lượng thấp hơn như demethoxycurcumin , bisdemethoxycurcumin, dihydrocurcumin, phytosterol, các acid béo và polysaccharid và một số thành phần khác được trình bày trong Bảng 1.1:

4

1.1.2 Hoạt tính sinh học của curcuminoid

Curcuminoid có 03 thành phần chính gồm curcumin, DMC và BDMC (Hình 1.2), trong đó curcumin chiếm thành phần lớn và có hoạt tính sinh học đa dạng, được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của curcuminoid

Curcumin tương đối trơ và không gây độc đối với cả động vật lẫn người ngay cả với lượng lớn Theo nghiên cứu, curcumin không gây độc với người khi dùng ở liều lượng cao [4] Chính nhờ tính an toàn đó mà curcumin là chất có tiềm năng sử dụng trong ngành dược

Curcumin có giá trị hoạt tính sinh học cao là do trong công thức cấu tạo của curcumin có các nhóm hoạt tính (Hình 1.3):

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của curcumin

1 Nhóm parahydroxyl: hoạt tính chống oxi hoá

2 Nhóm keto: kháng viêm, kháng ung thư, chống đột biến tế bào

3 Nhóm liên kết đôi: kháng viêm, kháng ung thư, chống đột biến tế bào

5

Hoạt tính sinh học chủ yếu của curcumin là kháng oxy hoá, kháng khuẩn, kháng virus và kháng một số loại ung thư Các nghiên cứu cho thấy curcumin có tác dụng tiêu diệt tế bào ung thư Tại Mỹ, Đài Loan, người ta đã tiến hành thử lâm sàng dùng curcumin điều trị ung thư và kết luận rằng curcumin có thể ức chế sự phát triển tế bào ung thư da,

dạ dày, ruột, vòm họng, dạ con, bàng quang Curcumin còn có tác dụng tốt với dạ dày, ruột, gan, mật, lọc máu, làm sạch máu, điều trị vết thương, chống viêm khớp, dị ứng, nấm, chống vi khuẩn Từ nǎm 1993, các nhà khoa học thuộc Đại học Harvarrd (Mỹ) đã công bố ba chất có tác dụng kìm hãm tế bào HIV-1, HIV-1-RT và một trong ba chất đó là curcumin [5, 6]

1.1.2.1 Hoạt tính kháng oxy hóa

Gốc tự do là các chất có khả năng phản ứng mạnh, được tạo ra khi cơ thể chúng ta thu nhận khí oxy hoặc chuyển hóa thức ăn để tạo ra năng lượng Bản thân các gốc tự do góp phần vào quá trình lão hóa của cơ thể Tuy nhiên, nếu số lượng gốc tự nhiên quá nhiều có thể gây tổn thương các tế bào lành là nguyên nhân chính dẫn đến một số bệnh như ung thư, xơ cứng động mạch, làm suy yếu hệ thống miễn dịch gây dễ bị nhiễm trùng, làm giảm trí tuệ, teo cơ quan bộ phận người cao niên [7]

Curcumin là hợp chất tự nhiên có khả năng chống oxy hóa Nó có khả năng ngăn cản sự tạo thành gốc tự do như superoxide, hydroxyl Ngăn cản sự peroxide hóa các lipid trong cơ thể nhờ vào nhóm OH trên vòng bezene [8]

1.1.2.2 Hoạt tính kháng viêm, kháng virus, vi khuẩn và ký sinh trùng

Viêm nhiễm là một chuỗi phản ứng của cơ thể nhằm chống lại tổn thương mô Phản ứng này cần thiết cho quá trình lành viết thương, nhưng đồng thời cũng tạo ra sự đau đớn kết hợp với nổi mẫn đỏ và phồng viết thương Trong quá trình viêm nhiễm, cơ thể sinh ra arachidonic acid Enzyme cylooxygenase chuyển hóa arachidonic acid thành các chất gây viêm Hai liên kết đôi trên mạch hetadien và nhóm OH trên vòng benzene của curcumin có khả năng ức chế enzyme cylooxygenase, từ đó giảm quá trình chuyển hóa arachidonic acid [9] Curcumin còn có khả năng ức chế virus HIV Ngoài ra, hỗn hợp các curcumin, DMC và BDMC còn có thể kháng giun [10]

6

1.1.3.3 Hoạt tính kháng đông máu

Sự kết tụ của các tiểu huyết cầu trong máu sẽ gây ra hiện tượng đông máu Curcumin có khả năng ngăn cản hoạt động của enzyme cyclooxyenase tạo thêm tiểu huyết cầu, nên curcumin có tác dụng chống đông máu [11]

1.1.1.4 Hoạt tính kháng ung thư

Ung thư hiện là căn bệnh nan y chưa có thuốc chữa Yêu cầu của thuốc trị ung thư

là ức chế sự phát triển và biệt hóa các tế bào ung thư nhằm chặn đứng sự phát triển và di căn của ung thư Tuy nhiên nhược điểm chung của đại đa số các thuốc trị ung thư hiện nay là không có sự chọn lọc cao, dễ kháng thuốc và hệ số an toàn giảm dần theo thời gian

sử dụng, ngoài ra chúng có thể gây độc cho các tế bào lành và gây ra các tác dụng phụ như rụng tóc, buồn nôn… Vì vậy việc tìm ra một hoạt chất có tác dụng chống ung thư nguồn gốc từ tự nhiên và tăng hoạt tính của các hoạt chất đó đang là vấn đề được quan tâm hàng đầu

Curcumin là chất ức chế tế bào ung thư vào loại mạnh nhất theo cơ chế tự ức chế từng phần các tế bào ác tính [12] Curcumin có tác dụng ức chế tế bào ung thư ở cả ba giai đoạn khởi phát, tiến triển và giai đoạn cuối Kết quả là các tế bào ung thư bị vô hiệu hóa nhưng không gây ảnh hưởng đến tế bào lành tính, đồng thời ngăn ngừa sự hình thành

tế bào ung thư mới

Curcumin có khả năng ức chế sự tạo khối u, tác động đến hầu hết các giai đoạn của quá trình hình thành và phát triển khối u [11]

Trong giai đoạn đầu của bệnh, các tế bào bình thường bị tác động bởi các gốc tự do

và bị biến đổi thành các tế bào ung thư Curcumin có thể ngăn chặn quá trình này bằng cách bắt giữ các gốc oxy hóa khác nhau như gốc hydroxyl OH-, gốc peroxyl ROO+, singlet oxygen, nitric oxide NO và peroxynitrite ONO- [13] Curcumin có khả năng bảo

vệ lipid, hemoglobin và AND khỏi quá trình oxy hóa Curcumin tinh khiết có hoạt tính kháng các ion oxy hóa mạnh hơn DMC và BDMC Curcumin được chứng minh có khả năng chống di căn đối với một vài loại tế bào ung thư đồng thời ức chế sự phát triển của

tế bào ung thư Khả năng làm giảm quá trình di căn này còn phụ thuộc vào nguồn gốc và loại khối u ác tính [11]

7

1.1.3 Pharmacophore của curcumin

Curcumin là một diarylheptanoid với hai nhóm p-OH và m-OCH3 liên kết với một β-diketone bởi hai liên kết olefin đối xứng Các liên kết đôi olefin được xem là cầu nối giữa vòng thơm và nhóm diketone và thường không được thay đổi khi thiết kế các dẫn xuất curcumin Thay vào đó, nhóm diketone, vòng thơm và các nhóm thế là mục tiêu chính trong thiết kế các dẫn xuất Vì thế, các nhóm thế đã được thay đổi trên cấu trúc curcumin, bao gồm các dẫn xuất có vòng 1,2 – azole để tạo thành dẫn xuất mới [14] Khi

loại bỏ nhóm p-OH hoặc thêm vào nhóm m-OCH3 dẫn đến hoạt tính chống tăng sinh tế

bào giảm nhẹ [15] Nếu thay đổi vị trí của nhóm p – phenolic và m – methoxy cho nhau

thì hoạt tính chống tăng sinh tế bào bị mất đi [15]

Mối quan hệ giữa hoạt tính và cấu trúc hóa học của curcumin được thiết lập bằng cách so sánh hoạt tính sinh học của curcumin với các dẫn xuất của curcumin (Bảng 1.2)

Bảng 1.2 Cấu trúc hóa học của curcumin và dẫn xuất

Bên cạnh dó, DMC, BDMC và các dẫn xuất của DMC, BDMC đều có hoạt tính thấp hơn curcumin và các dẫn xuất của curcumin Điều đó chứng tỏ rằng OCH3 có vai trò rất lớn đối với hoạt tính của curcumin [20]

1.1.4 Các dẫn xuất isoxazole và pyrazole của curcumin

Trong nhiều năm qua, số lượng lớn các dẫn xuất curcumin đã được tổng hợp bởi các nhà nghiên cứu trên thế giới Các dẫn xuất mới này có khả năng ức chế gốc tự do [21], gây độc tế bào, kháng viêm và các hoạt tính khác [22-24] Một số dẫn xuất còn có hoạt tính chống ung thư [25], chất kích hoạt NF – κB [26], thuốc siêu vi [27],…

Hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất trên được đánh giá bằng thử nghiệm sulforhodamine B chống lại năm dòng tế bào ung thư ở người: U – 251 MG, PC – 3 (tuyến tiệt liệt ở người), HTC – 15 (đại trực tràng ở người), K562 (bệnh bạch cầu tủy xương mãn tính ở người và SKLU – 1 (ung thư phổi) Các dẫn xuất được thử nghiệm, sàng lọc ở nồng độ 50 µM [28] Theo kết quả này, sự methyl hóa nhóm hydroxy ở vòng thơm làm tăng khả năng gây độc tế bào (trên 90% tế bào bị ức chế) Sự hiện diện nhóm

methoxy và nhóm N, N – dimethylamine làm giảm hoạt tính của chúng Để khảo sát tác

dụng của việc thay thế nhóm β-diketone bằng vòng 1,2-azole, các dẫn xuất isoxazole và pyrazole đã được tổng hợp [29] Kết quả cho thấy rằng các dẫn xuất này tăng hoạt tính của dẫn xuất so với curcumin Các kết quả tương tự về hoạt tính các dẫn xuất của

9

curcumin chống lại các dòng ung thư khác nhau cũng được công bố trong các tài liệu tham khảo [14, 30] Điều đáng chú ý, khi nhóm liên kết olefin được hydro hóa thì hoạt tính các dẫn xuất giảm so với curcumin [29]

Hoạt tính kháng oxy hóa của curcumin và các dẫn xuất isoxazole curcumin,

pyrazole curcumin còn được đánh giá bằng thử nghiệm in vitro (“nhặt” gốc tự do DPPH)

Kết quả cho thấy, tất cả các hợp chất đều có hoạt tính kháng oxy hóa đầy hứa hẹn Trong

đó, dẫn xuất pyrazole được đánh giá có hoạt tính tốt hơn curcumin do có sự hiện diện của vòng pyrazole [31]

Isoxazole và pyrazole có tác dụng ức chế COX-2 tốt hơn curcumin Ngoài thử

nghiệm in vitro, curcumin và các dẫn xuất isoxazole, pyrazole curcumin còn được đánh giá hoạt tính kháng viêm in vivo bằng cách thử nghiệm phù chân chuột Kết quả cho thấy,

pyrazole cho hoạt tính cao nhất [31] Bên cạnh đó, khi nhóm chức isoxazole được thay thế bởi pyrazole, hoạt tính của dẫn xuất này tăng lên đáng kể, chứng tỏ sự hiện diện của nhóm –NH trong dẫn xuất pyrazole là hết sức cần thiết cho hoạt tính của nó [32]

1.2 Docking phân tử

1.2.1 Receptor – Cyclin Dependent Kinase 2 (CDK2)

Cyclin-dependent kinases (CDKs) là một họ protein kinases tham gia vào quá trình điều tiết chu kỳ của tế bào CDKs là các protein tương đối nhỏ, có trọng lượng phân tử từ

34 đến 40 kDa [33, 34] Thông thường, một CDK sẽ liên kết với một protein điều tiết là Cyclin, nếu không có Cyclin thì CDK gần như bất hoạt Tuy nhiên, khi tạo thành phức Cyclin-CDK thì trở nên hoạt hóa Phức chất này sẽ xúc tác cho quá trình phosphate hóa các protein từ Adenosine triphosphate (ATP) Hầu hết các phức Cyclin-CDK điều tiết chu

kỳ sống của tế bào Tế bào động vật có ít nhất 09 loại protein CDK (CDK1-9), trong đó CDK1-4 tham gia trực tiếp vào quá trình điều tiết chu kỳ sống của tế bào Vì vậy, các CDK liên quan trực tiếp đến các bệnh ung thư

CDK2 (Hình 1.4) là một protein ở người được mã hóa bởi gen CDK2

10

Hình 1.4 Cấu trúc của protein CDK2

Cấu trúc tinh thể của CDK2 được tìm kiếm và tải về từ ngân hàng dữ liệu protein (PDB – Protein Data Bank) Có nhiều cấu trúc tinh thể kết tinh của CDK2 được tìm thấy Protein được lựa chọn phải có độ phân giải cao và ligand đồng kết tinh với protein là chất

có hoạt tính ức chế CDK2 mạnh Vì thế, tinh thể đồng kết tinh của CDK2 với 5-(2-fluorophenyl)-N-(pyridin-4-ylmethyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-amine (SCF) có độ phân giải 1.28 Å (2R3I) được chọn làm đích tác động trong nghiên cứu này (Hình 1.5)

Hình 1.5 Cấu trúc của CDK2 (2R3I)

11

1.2.2 Giới thiệu về phương pháp docking

Số lượng protein với cấu trúc ba chiều được biết đến ngày càng tăng và được công

bố rộng rãi trên ngân hàng protein (PDB) [35, 36] Sự gia tăng này là do sự phát triển của các kỹ thuật xác định cấu trúc, nổi bật là kỹ thuật X-ray [37] Sau khi cấu túc protein và phối tử (ligand) đồng kết tinh được công bố, cùng với sự hỗ trợ hiệu quả của máy tính thì hàng loạt các thuốc đã được thiết kế dựa trên cấu trúc của hợp chất dẫn đầu Việc thiết kế thuốc mới dựa trên kết quả của phương pháp docking phân tử Các phân tử thuốc được

“gắn” vào khoang gắn kết của protein, từ đó năng lượng gắn kết của các cấu dạng của từng phân tử thuốc được tính toán Kết quả từ phương pháp docking phân tử sẽ định hướng cho việc thiết kế các thuốc mới có năng lượng gắn kết tốt nhất với protein, nghĩa là

có hoạt tính tốt hơn [38]

Trong mô hình docking phân tử, tương tác giữa phối tử và mục tiêu tác động (protein, enzyme) là các tương tác van der Waals, tương tác tĩnh điện, liên kết hydrogen, tương tác ưa nước, kỵ nước… Trong kỹ thuật docking phân tử, mục tiêu tác động thường

có kích thước lớn nên rất khó để khảo sát hết tất cả các khả năng tương tác Vì thế, mục tiêu tác động thường đưa vào dưới dạng cấu trúc cứng, trong khi phối tử có thể chuyển động tương đối và thay đổi cấu hình để phù hợp với các khoang gắn kết của mục tiêu tác động

1.2.3 Ý nghĩa của phương pháp docking phân tử

Docking phân tử là kỹ thuật mô hình hóa nhằm dự đoán vị trí và cấu hình tối ưu nhất mà phối tử có thể gắn kết trên mục tiêu Docking phân tử có vai trò quan trọng trong việc dự đoán ái lực và hoạt tính của các hoạt chất đối với protein, enzyme, từ đó có thể dự đoán khả năng hoạt hóa hoặc ức chế mục tiêu Ngoài ra, docking phân tử còn giúp ta dự đoán được tâm hoạt động, vị trí và cấu hình tối ưu của phối tử tham gia phản ứng khi xem xét cơ chế xúc tác của enzyme Từ đó giúp thiết kế các thuốc mới có hoạt tính tốt hơn phục vụ trong y dược

12

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài nghiên cứu khoa học là curcumin và dẫn xuất isoxazole của curcumin

2.2 Nguyên liệu, trang thiết bị

2.2.1 Nguyên liệu

2.2.1.1 Nguyên liệu dùng trong tổng hợp

Các hóa chất dùng trong tổng hợp được cho trong Bảng 2.1:

Bảng 2.1 Các hóa chất được sử dụng trong qui trình tổng hợp curcumin và dẫn xuất

isoxazole curcumin

*Tổng hợp tại phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ, ĐH Sư phạm Kỹ thuật Tp Hồ Chí Minh

2.2.1.2 Nguyên liệu dùng trong kiểm nghiệm

- Bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck)

- Dung môi giải ly: n – hexane, ethyl acetate, acetone

2.2.2 Dụng cụ, trang thiết bị

2.2.2.1 Dụng cụ, trang thiết bị dùng trong tổng hợp

- Các dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn (250 mL, 100 mL), erlen, beaker, pipet,

micropipet, ống đong, phễu chiết

2.2.2.2 Dụng cụ, trang thiết bị dùng trong phân tích

- Bình giải ly, ống vi quản

- Đèn UV

- Máy đo điểm nóng chảy

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân – NMR (Bruker), máy đo phổ khối lượng –

MS (Agilent Technologies) (Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Tổng hợp

2.3.1.1 Tổng hợp curcumin

Curcumin được tổng hợp toàn phần từ vanillin và acetylacetone

Tiến hành phản ứng: Trong bình cầu 250 mL, cho vào 1.03 mL acetyl acetone

(10.0 mmol), 0.35 g boron oxide (10.0 mmol), 50.0 mL ethyl acetate, 3.04 g vanillin (20.0 mmol) và 10.8 mL tributylborate Lắp ráp hệ thống như Hình 2.1, khuấy từ gia nhiệt đến

80 oC và gia nhiệt trong vòng 30 phút

Hình 2.1 Hệ thống phản ứng tổng hợp curcumin

14

Sau 30 phút, nhỏ từ từ 0.4 mL n–butylamine (hòa tan trong 5.0 mL ethyl acetate)

vào bình cầu bằng kim tiêm trong 30 phút, tiếp tục khuấy từ gia nhiệt ở 80 oC Theo dõi tiến trình phản ứng bằng TLC Kết quả TLC cho thấy sau 4 giờ, phản ứng đạt cân bằng Sau đó, thêm 25.0 mL HCl 1.0 M vào hỗn hợp phản ứng, khuấy từ tại 70 oC trong 60 phút, kết thúc phản ứng

Chiết: Hỗn hợp phản ứng được làm nguội, chiết bằng ethyl acetate (3  15.0 mL)

và dung dịch NaHCO3 (30.0 mL) bão hòa Gom dịch chiết ethyl acetate vào erlen Làm khan nước bằng Na2SO4 Tiến hành lọc loại bỏ muối, thu dung dịch sản phẩm Sử dụng máy cô quay chân không để loại dung môi thu sản phẩm thô

Chuẩn bị dung môi giải ly cột và mẫu cho quá trình sắc ký cột: Dung môi giải ly

đầu tiên được chọn là dung cho Rf của chất cần tinh sạch là 0.15 trên bản mỏng Mẫu cần sắc ký được chuẩn bị bằng cách hòa tan trong một lượng tối thiểu acetone và trộn chung với silica gel Cho 1.0 g silica gel và 1.0 mL acetone vào sản phẩm thô (0.26 g) trong bình

cầu 100 mL Tiến hành cô quay để thu được bột khô sản phẩm thô và silica gel

Chạy cột sắc ký và tinh sạch: Tỷ lệ silica gel so với mẫu là 50:1 về khối lượng

Silica gel được tạo hỗn hợp huyền phù với dung môi được chọn làm dung môi giải ly cột đầu tiên Đường kính cột sắc ký được chọn sao cho tỷ lệ chiều cao silica gel và đường kính cột là 7:1 Đặt một lớp bông gòn dưới đáy cột để ngăn silica gel rơi xuống Thêm dung môi giải ly vào cột, chiều cao dung môi khoảng 1 cm Rót hỗn hợp huyền phù silica gel vào cột, dùng bóp cao su để silica gel được đồng đều trong cột Thêm đầy dung môi vào cột, cân bằng cột bằng cách dùng bóp cao su đẩy dung môi ra khỏi cột 3 lần (không

để khô dung môi trong cột) Nạp mẫu bột khô sản phẩm vào cột chứa silica gel Tiến hành

giải ly bằng (hệ) dung môi n-hexane:ethyl acetate có độ phân cực tăng dần Dung dịch

giải ly được hứng trong các hủ bi, tùy theo khoảng cách giữa các vết trên bản mỏng mà hứng lượng ít khác nhau Độ tinh sạch của dịch giải ly được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng Dịch giải ly trong các hủ bi được chấm và giải ly Những hủ bi nào có kết quả giống nhau trong bản mỏng sau khi hiện hình bằng UV thì gom chung lại với nhau Phân đoạn chứa chất quan tâm được cô quay đuổi dung môi để tiến hành các thí nghiệm hoặc tinh sạch tiếp nếu cần

15

2.3.1.2 Tổng hợp hợp chất isoxazole curcumin

Tiến hành phản ứng: Hòa tan 200 mg curcumin (0.54 mmol) bằng 10.0 mL acetic

acid trong bình cầu đáy tròn 100 mL Gia nhiệt kết hợp khuấy từ ở 80 oC trong 30 phút Sau đó, cho 75.54 mg hydroxylamine hydrochlodride (NH2OH.HCl, 1.08 mmol) vào bình cầu Theo dõi phản ứng bằng TLC (Hình 2.2) Kết quả TLC cho thấy phản ứng kết thúc sau 9h (không hết được chất nền và sản phẩm không sinh ra thêm)

Hình 2.2 Kết quả bản mỏng của hỗn hợp phản ứng tổng hợp isoxazole curcumin sau

9h phản ứng

Chiết: Hỗn hợp phản ứng được làm nguội, trung hòa bằng dung dịch NaHCO3 bão hòa (190.0 mL) và chiết bằng dichloromethane (315.0 mL) Gom các dung chiết dichloromethane vào bình erlene, làm khan nước bằng Na2SO4 Hỗn hợp được lọc qua phễu lọc Buchner thu dung dịch dichloromethane Đuổi dung môi dưới áp suất thấp bằng

máy cô quay chân không thu được chất rắn thô

Tinh chế: Sản phẩm thô được tinh chế bằng phương pháp sắc ký cột với hệ dung

môi có độ phân cực tăng dần từ 100% n-hexane đến n-hexane:ethyl acetate (7:3) thu được

hợp chất PT01 trong phân đoạn 02 (từ hủ bi 55 đến hủ bi 103)

Chuẩn bị mẫu thử: mẫu thử được hòa tan trong dung môi thích hợp, có nồng độ

khoảng 2 mg/mL

Dung môi giải ly: Chọn dung môi (hệ dung môi) giải ly thích hợp, sao cho giá trị

Rf của vết sản phẩm dao động từ 0,1 đến 0,9 khi giải ly với 3 hệ dung môi có độ phân cực tăng dần Một hệ cho Rf  0.2, một hệ cho Rf  0.5 và một hệ cho Rf  0.8 Mẫu thử được xem là tinh khiết nếu không có vết lạ xuất hiện trên bản mỏng sau khi giải ly với 3 hệ dung môi đã chọn Các hệ dung môi có độ phân cực khác nhau được điều chế từ n-hexane

và ethyl acetate

Giá trị Rf được tính toán như sau:

Hình 2.3 Cách xác định giá trị x, y trên bản mỏng

Rf =𝑥𝑦

• x là khoảng cách từ điểm chấm mẫu đến trung tâm của vết sau khi triển khai (Hình 2.3)

• y là khoảng cách từ điểm vết chấm đến mức tiền tuyến dung môi (Hình 2.3)

Phát hiện vết: Vết sản phẩm sau khi giải ly được soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng

254 nm và 365 nm Nếu vết sản phẩm không bắt màu UV thì có thể quan sát vết bằng cách nhúng bản mỏng vào dung dịch acid H2SO4 40% trong nước, sau đó nung nóng