Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp 2 (curcumin o yl)ethyldihydrophosphat

Hiện nay, curcumin ngày càng giành được sự quan tâm đặc biệt của các nhà nghiên cứu thuốc hiện đại nhờ hoạt tính sinh học đa dạng phòng và hỗ trợ điều trị ung thư, chống oxy hóa, chống v

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ TRÂM

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH

TỔNG HỢP 2-(CURCUMIN-O-YL)ETHYL

DIHYDROPHOSPHAT

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, trong suốt thời gian thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, gia đình và bạn bè

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn

Văn Hải và PGS TS Nguyễn Đình Luyện, hai thầy đã trực tiếp chỉ bảo và

hướng dẫn tôi, truyền đạt cho tôi những kiến thức, kinh nghiệm quý báu, giúp tôi có định hướng tốt hơn trong việc nghiên cứu và hoàn thành đề tài một cách tốt nhất

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô Bộ môn Công nghiệp

Dược – Tổng hợp hóa dược đã hết lòng giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi

cho tôi tiến hành nghiên cứu đề tài

Tôi cũng xin cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trường cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập tại nhà trường

Trong quá trình thực hiện luận văn tôi đã nhận được sự giúp đỡ của các cán bộ thuộc phòng Thử nghiệm sinh học – Viện công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam; các cán bộ khoa Hóa – trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội; các cán bộ Viện Thực phẩm chức năng, tôi xin chân thành cảm ơn

Và cuối cùng, cho tôi bày tỏ lòng biết ơn đặc biệt tới gia đình, người thân

và bạn bè đã luôn sát cánh, động viên, chăm lo cho tôi trong cuộc sống và sự nghiệp

Hà Nội, ngày 4 tháng 4 năm 2018

Học viên

Nguyễn Thị Trâm

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Khái quát chung về Curcumin 3

1.1.1 Cấu trúc phân tử Curcumin 3

1.1.2 Tính chất lý hóa 3

1.1.3 Tính chất dược lý của curcumin 6

1.2 Một số hướng biến đổi hóa học cải thiện độ tan và hoạt tính của curcumin 8

1.3 Tiền thuốc phosphat trong nghiên cứu phát triển thuốc và curcumin 12 Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Nguyên liệu - hóa chất 18

2.2 Dụng cụ - thiết bị 19

2.3 Nội dung nghiên cứu 20

2.4 Phương pháp nghiên cứu 20

2.4.1 Quy trình tổng hợp, tinh chế sản phẩm 20

2.4.2 Kiểm tra sơ bộ độ tinh khiết 21

2.4.3 Xác định cấu trúc hóa học 21

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 22

3.1 Quy trình tổng hợp 22

3.1.1 Tổng hợp dẫn chất mono-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin (LH-1) 22 3.1.2 Tổng hợp dẫn chất 2-(curcumin-O-yl)ethyl dihydrophosphat (LH-2)…… 31

3.2 Xác định cấu trúc 36

3.2.1 Kết quả phân tích phổ của LH-1 36

3.2.2 Kết quả phân tích phổ của LH-2 40

Chương 4 BÀN LUẬN 43

4.1 Về quy trình tổng hợp 43

4.1.2 Về tổng hợp dẫn chất mono-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin (LH-1)

……… 43

4.1.2 Về tổng hợp dẫn chất 2-(curcumin-O-yl)ethyl dihydrophosphat (LH-2) 46

4.2 Về xác định cấu trúc các sản phẩm 48

4.2.1 Về xác định cấu trúc của LH-1 48

4.2.2 Về xác định cấu trúc của LH-2 50

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AR Thuốc thử tinh khiết phân tích (Analytical reagent)

CTCT Công thức cấu tạo

Hệ số phân bố dầu nước

MS Phổ khối lượng (Mass spectrometry)

MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazoli bromid

Rf Hệ số lưu giữ (Retention factor)

SC50 Nồng độ trung hòa được 50% gốc tự do (Scavenging

concentration at 50%) SKLM Sắc ký lớp mỏng

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

Bảng 1.1 Sơ lược một số hướng biến đổi cấu trúc cải thiện độ tan hoạt tính

của curcumin 9

Bảng 2.1 Danh mục các nguyên liệu - hóa chất 18

Bảng 2.2 Danh mục thiết bị, dụng cụ thí nghiệm 19

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát tỷ lệ mol 2-bromoethanol : curcumin 25

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát nhiệt độ phản ứng tạo LH-1 25

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát dung môi phản ứng tạo LH-1 26

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát xúc tác phản ứng tạo LH-1 27

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát nồng độ tác nhân trong phản ứng tạo LH-1 27

Bảng 3.6 Kết quả tổng hợp LH-1 ở quy mô 2 g/mẻ 31

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát tỷ lệ mol POCl3 : LH-1 32

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát nhiệt độ, thời gian phản ứng tạo LH-2 33

Bảng 3.9 Kết quả tổng hợp LH-2 quy mô 2g/mẻ 36

Bảng 3.10 Kết quả phân tích phổ khối lượng (CH3OH) của LH-1 37

Bảng 3.11 Kết quả phân tích phổ IR (KBr) của LH-1 37

Bảng 3.12 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) của LH-1 38 Bảng 3.13 Kết quả phân tích phổ 13C-NMR (500 MHz, CD3OD) của LH-1 39 Bảng 3.14 Kết quả phân tích phổ khối lượng (CH3OH) của LH-2 40

Bảng 3.15 Kết quả phân tích phổ IR (KBr) của LH-2 40

Bảng 3.16 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO) của LH-2 41

Bảng 3.17 Kết quả phân tích phổ 13 C-NMR (DMSO-d6) của LH-2 42

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của curcumin 3

Hình 1.2 Các dạng tồn tại của curcumin theo pH dung dịch 4

Hình 1.3 Sự phân hủy curcumin trong môi trường kiềm 5

Hình 1.4 Sự phân hủy của curcumin dưới tác dụng của ánh sáng 6

Hình 1.5 Cơ chế dọn gốc tự do của curcumin 7

Hình 1.6 Các vị trí trong biến đổi cấu trúc của curcumin 8

Hình 1.7 Công thức một số dẫn chất của curcumin 10

Hình 1.8 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất monoalkyl hóa từ curcumin theo tác giả Hoàng Dung 12

Hình 1.9 Cơ chế giải phóng thuốc mẹ từ tiền thuốc 13

Hình 1.10 Tiền thuốc phosphat của Lopinavir và Ritonavir 14

Hình 1.11 Tiền thuốc phosphat của propofol 14

Hình 1.12 Tiền thuốc phosphat của dẫn chất benzimidazol 15

Hình 1.13 Tiền thuốc của α-6-chloro-2-(methylthio)-5-(naphthalen-1-yloxy)-1H-benzo[d]imidazol 15

Hình 1.14 Tiền thuốc của chalcon 16

Hình 1.15 Cấu tạo curcumin-O-yl dihydrophosphat 16

Hình 1.16 Sơ đồ tổng hợp 2-(curcumin-O-yl)ethyl dihydrophosphat (LH-2)17 Hình 2.1 Sơ đồ tổng hợp LH-1 và LH-2 20

Hình 3.1 Sơ đồ phản ứng tổng hợp LH-1 22

Hình 3.2 Sơ đồ quy trình tổng hợp LH-1 ở quy mô 2 g/mẻ 30

Hình 3.3 Sơ đồ phản ứng tổng hợp LH-2 bằng phosphoryl clorid 31

Hình 3.4 Sơ đồ quy trình tổng hợp LH-2 ở quy mô 2 g/mẻ 35

Hình 4.1 Các sản phẩm phụ của phản ứng tạo LH-1 43

Hình 4.2 Vết các sản phẩm trên sắc ký lớp mỏng 44

Hình 4.3 Nguyên lý phản ứng của quá trình tinh chế LH-1 45

Hình 4.4 Cơ chế phản ứng phosphoryl hóa bằng tác nhân POCl3 46

Hình 4.5 Dạng hỗ biến ceto-enol của LH-1 48

ĐẶT VẤN ĐỀ Curcumin (diferuloylmethan, (1E,6E)-1,7-bis(4’-hydroxy-3’-

methoxyphenyl)-1,6-heptadien-3,5-dion) là hợp chất đóng vai trò chủ đạo

trong tác dụng chữa bệnh của củ nghệ (Curcuma longa L.) - dược liệu được

dùng rất lâu đời trong y học cổ truyền của nhiều nước trên thế giới, nhất là Ấn

Độ, Trung Quốc và các nước Đông Nam Á [33] Hiện nay, curcumin ngày càng giành được sự quan tâm đặc biệt của các nhà nghiên cứu thuốc hiện đại nhờ hoạt tính sinh học đa dạng (phòng và hỗ trợ điều trị ung thư, chống oxy hóa, chống viêm, kháng khuẩn…) với cơ chế tác dụng đa đích, độ an toàn cao, hầu như không gây ra bất cứ tác dụng phụ nào và không độc đến liều 8 g/kg thể trọng [3], [31]

Nhược điểm chính của curcumin là sinh khả dụng rất thấp (dưới 1%) do hấp thu kém, chuyển hóa và đào thải nhanh khỏi cơ thể Một trong các yếu tố lý-hóa quan trọng ảnh hưởng đến điều này là độ tan kém của curcumin

Tạo ra tiền thuốc là một trong những hướng đi quan trọng trong cải thiện

độ tan, sinh khả dụng và các dược tính khác của thuốc gốc (thuốc mẹ) Các nghiên cứu về tiền thuốc đã chỉ ra, khi gắn thêm nhóm phosphat, độ tan và sinh khả dụng của một số chất tăng lên đáng kể, chẳng hạn, tiền thuốc oxyethylphosphat của ritonavir có độ tan cao gấp 1 600 lần so với ritonavir, tiền thuốc ethyl dioxy phosphat của propofol có độ ổn định tăng, độ tan trong nước cao hơn propofol gấp 70 lần và có thể sử dụng đường tiêm, tedizolid phosphat cũng cải thiện độ tan của thuốc mẹ tedizolid và làm tăng sinh khả dụng đường uống [12] [22] [23] [32] Cách tiếp cận này đã được tác giả L Ding và cộng

sự phát triển trên phân tử curcumin năm 2015 bằng cách phosphoryl hóa trực tiếp nhóm –OH phenol của curcumin và thu được một số dẫn chất phosphat

trong đó dẫn chất monophosphat của curmumin là curcumin-O-yl

dihydrophosphat thể hiện hoạt tính ức chế mạnh hơn trên tế bào HeLa (IC50 = 6,78 µM) so với curcumin (IC50 =17,67 µM) [13] Các nghiên cứu về cơ chế

2

tác dụng đã chứng minh rằng, hoạt tính sinh học của curcumin là do 2 cơ chế chính: chống oxy hóa và chống viêm Phân tích mối liên quan giữa cơ chế này với cấu trúc phân tử của các hợp chất khung curcumin cho thấy, cần thiết phải

có mặt của nhóm β-diceton, OH phenol và methoxy để duy trì hoạt tính Kết quả gần đây của Nhóm nghiên cứu chúng tôi về 2-hydroxyethyl hóa curcumin

cho thấy, khả năng chống oxy hóa của sản phẩm monoalkyl hóa

O-(2-hydroxyethyl)-curcumin khá tốt, với SC50 là 59,50 μM (tốt hơn vitamin C) [5] Tuy nhiên, việc tổng hợp dẫn chất này còn gặp nhiều khó khăn, quá trình tinh chế phải sử dụng đến sắc ký điều chế hoặc sắc ký cột [5] [10]

Trên cơ sở đó, chúng tôi lựa chọn biến đổi chỉ một nhóm OH phenol của curcumin, giữ lại một nhóm OH phenol và cấu trúc β-diceton và nhóm methoxy; lựa chọn ethylenoxy làm cầu nối với nhóm thân nước phosphat Đề

tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp 2-(curcumin-O-yl)ethyl

dihydrophosphat” được thực hiện với mục tiêu:

Xây dựng được quy trình tổng hợp 2-(curcumin-O-yl)ethyl dihydrophosphat từ curcumin ở quy mô 2 g/mẻ

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Khái quát chung về Curcumin

1.1.1 Cấu trúc phân tử Curcumin

Curcumin (curcumin I, diferuloylmethan) là hợp chất thiên nhiên được

phân lập từ củ nghệ (Curcuma longa L, họ Gừng – Zingiberaceae), có tên khoa học là (1E,6E)-1,7-bis(4’-hydroxy-3’-methoxyphenyl)-1,6-heptadien- 3,5-dion Về mặt cấu trúc, curcumin thuộc dãy diarylheptanoid chứa 1,3-

diceton, trong đó mỗi nhóm carbonyl liên hợp với nối đôi (Hình 1.1) [34]:

3'

4' 5' 6' 1' 2' 1

2 3 4 5 6 7

4'' 5'' 6''

 Dạng thù hình: Curcumin tồn tại dưới dạng bột vô định hình hoặc tinh thể

hình kim màu vàng cam [25]

 Điểm chảy: 183o

C [33]

 Sự hấp thụ ánh sáng: Curcumin có khả năng hấp thụ bức xạ khả kiến, tạo

ra màu vàng Các cực đại hấp thụ ở trong các dung môi khác nhau dao động ở bước sóng từ 408 nm (carbon tetraclorid) đến 430 nm (DMSO) [21] Curcumin có hấp thu cực đại tại 415-420 nm trong aceton, 427 nm trong ethanol Curcumin có khả năng phát huỳnh quang (504 nm) khi bị kích thích bởi bước sóng 424 nm trong aceton [20]

 Tính tan:

4

Curcumin thực tế không tan trong nước ở pH acid và trung tính (<0,1

µg/mL), tan được trong kiềm [39] Curcumin tan được trong nước khi có mặt các chất hoạt động bề mặt như: natri dodecylsulfat, cetylpyridin bromid, gelatin, polysaccharid, polyethylenglycol, cyclodextrin [19] Curcumin tan được trong acid acetic, ethanol, methanol, aceton (20 mg/mL),

dimethylsulfoxid, dicloromethan, cloroform, ethyl acetat, ít tan trong n-hexan,

không tan trong ether [2]

Ở pH > 7,5, dung dịch có màu đỏ, curcumin tồn tại ở các dạng ion H2A-,

HA2- và A3- lần lượt tương ứng với các giá trị pka là 7,8; 8,5 và 9,0 (xem Hình 1.2) [19]:

Hình 1.2 Các dạng tồn tại của curcumin theo pH dung dịch

 Về mặt hóa học curcumin chứa các nhóm chức -OH phenol, β-diceton, alken, nhân thơm, vì vậy curcumin có các phản ứng hóa học đặc trưng của các nhóm chức này: phản ứng hydro hóa, imin hóa, tạo phức với ion kim loại [4]

 Độ ổn định:

Curcumin tương đối ổn định ở pH acid, nhưng nhanh chóng bị phân hủy

ở pH >7 Sản phẩm phân hủy chính là acid ferulic và feruloylmethan, ngoài ra còn có các sản phẩm ngưng tụ (Hình 1.3) [19]

Hình 1.3 Sự phân hủy curcumin trong môi trường kiềm

Dưới tác dụng của ánh sáng, curcumin phân hủy thành vanillin, acid vanillic, aldehyd ferulic, acid ferulic Curcumin cũng không bền ngay cả khi

có và không có mặt của oxy Khi có mặt oxy và ánh sáng, curcumin bị phân hủy tạo thành 4-vinylguaialcol và vanillin (Hình 1.4) [19] Trong điều kiện không có oxy, curcumin có thể bị vòng hóa

O

CH3

O H

 h

 h

 h

Hình 1.4 Sự phân hủy của curcumin dưới tác dụng của ánh sáng

1.1.3 Tính chất dược lý của curcumin

 Sinh khả dụng

Đã có rất nhiều nghiên cứu được thực hiện để đánh giá sinh khả dụng của curcumin trên cả động vật và người Một nghiên cứu gần đây của Yang và cộng sự cho thấy sau khi tiêm tĩnh mạch một liều curcumin 10 mg/kg trên chuột, nồng độ đỉnh trong huyết tương là 0,05 μg/mL (trong khi đó một liều curcumin gấp 50 lần khi dùng đường uống trên chuột cũng cho nồng độ đỉnh trong huyết tương là 0,01 μg/mL) [37] Một thí nghiệm khác cho chuột sử dụng curcumin liều 1 g/kg theo đường uống ghi nhận được nồng độ đỉnh trong huyết tương đạt 0,5 μg/mL sau 45 phút [27]

Tính chất dược động học của curcumin trên người đã được nghiên cứu bởi C D Lao và cộng sự [24] Kết quả nghiên cứu cho thấy, khi dùng curcumin đường uống với liều 0,50 - 8,00 g thì không phát hiện vết curcumin trong huyết tương sau 1, 2, 4 h Khi tăng liều lên đến 10,00 g, nồng độ curcumin trong huyết tương lần lượt là 66, 91, 121 nM sau 1, 2, 4 h Tương tự với liều 12,00 g, nồng độ curcumin đo được là 81, 156, 139 nM Một nghiên

cứu khác chỉ ra rằng sau khi uống curcumin với liều 8,00 g thì curcumin sẽ được hấp thu vào máu và đạt đỉnh trong vòng 1 - 2 h, nồng độ đỉnh là 1,77 - 1,87 µM, nồng độ này nhỏ hơn rất nhiều so với LC50 của curcumin (21±17 µM); mặt khác sự chuyển hóa curcumin ra khỏi cơ thể cũng diễn ra một cách nhanh chóng [11], [15] Các nghiên cứu trên đều đưa đến kết luận curcumin

có sinh khả dụng thấp, điều này giải thích vì sao mặc dù nhiều nhà khoa học

đã khẳng định giá trị hữu ích của curcumin đối với sức khỏe con người nhưng cho đến nay curcumin vẫn chưa có mặt một cách độc lập trong danh mục dược chất chính thức của y học hiện đại [18]

 Cơ chế tác dụng:

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, hai cơ chế chính quyết định tạo ra các hoạt tính của curcumin là chống oxy hóa và chống viêm Trong đó, nhóm β-diceton, OH phenol, nhóm methoxy và hệ nối đôi liên hợp trong mạch carbon trung tâm đóng vai trò quan trọng tạo nên hoạt tính của curcumin Nhờ cấu trúc đặc biệt này, các gốc tự do có thể lan truyền trên phân tử curcumin ở các

vị trí khác nhau, hấp thụ các gốc tự do để chuyển thành dạng dimer, từ đó các gốc tự do được dọn dẹp khỏi cơ thể, tạo nên hoạt tính kháng tế bào ung thư

Hình 1.5 Cơ chế dọn gốc tự do của curcumin

Curcumin + Gốc tự do

Dimer của curcumin

Hình 1.6 Các vị trí trong biến đổi cấu trúc của curcumin

Một số ví dụ về các dẫn chất có tác dụng tốt thu được sau khi biến đổi khung cấu trúc curcumin và công thức cấu tạo của các dẫn chất này lần lượt

được trình bày ở Bảng 1.1 và Hình 1.7

Bảng 1.1 Sơ lược một số hướng biến đổi cấu trúc cải thiện độ tan hoạt tính

Kháng dòng tế bào ung thư KB và HeLa tốt hơn curcumin [14]

PEG hóa 2

Tan tốt hơn, ức chế hoàn toàn sự sinh trưởng tế bào ung thư tuyến tụy (5 µM) tốt hơn curcumin (20 µM)

[26]

Tạo dẫn chất carboxylic 3

Tan tốt, kháng khuẩn tốt hơn trên nhiều vi khuẩn Gram(+), Gram(-) [6]

5a 5b

(5b) kháng ký sinh trùng chủng

Trypanosoma, Leishmania tốt

hơn (5a) chống oxy hóa và kháng

tế bào ung thư gan tốt hơn

[1] [10]

Nhómβ-di ceton

Imin hóa 6

Hoạt tính chống oxy hóa DPPH

(in vitro) tốt hơn [34]

hơn

[7]

10

O O

O O

O O

OCH3O

H3CO

HO

O HO

OH

O HO

OH

O O

OCH3O

H3CO O

O HO

H3CO

HO

N O

OCH3 OH

Năm 2007, P Somparn và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của curcumin và dẫn xuất, bao gồm: dẫn xuất tự nhiên demethoxycurcumin (DMC), bisdemethoxycurcumin (BDMC), các dẫn xuất hydro hóa của curcumin như tetrahydrocurcumin (THC), hexahydrocurcumin (HHC), octahydrocurcumin (OHC) Hoạt tính chống oxy hóa được đánh giá thông qua khả năng dọn gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) và khả năng ức chế AAPH (2,2-azobis(2-amidinopropan)dihydroclorid) - một tác nhân gây ra quá trình peroxy hóa lipid Kết quả nghiên cứu cho thấy THC thể hiện khả năng dọn gốc tự do DPPH cao nhất với giá trị IC50 = 18,7 µM Hoạt tính này giảm dần theo thứ tự: THC > HHC = OHC > curcumin > DMC > BDMC Đồng thời, THC cũng có khả năng ức chế mạnh nhất đối với AAPH

Lý giải cho những điều này, các tác giả cho rằng chính sự có mặt của nhóm methoxyphenyl và đặc biệt là sự hydro hóa hệ nối đôi liên hợp trong mạch carbon trung tâm đã làm tăng hoạt tính của curcumin lên một cách đáng kể [35]

Năm 2008, M Majeed và cộng sự đã tiến hành tổng hợp

tetrahydrocurcumin và nghiên cứu trên in vitro so sánh tác dụng chống oxy

hóa của tetrahydrocurcumin và các curcuminoid Nghiên cứu thực hiện trên tế bào hồng cầu thỏ và gan chuột, sử dụng acid linoleic là chất nền trong hệ ethanol/nước, được phân tích bằng phương pháp thiocyanat và phương pháp TBA Kết quả cho thấy rằng tetrahydrocurcumin có hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất trong tất cả các curcuminoid Giải thích về cơ chế tác dụng và đặc tính chống oxy hóa mạnh hơn của THC so với curcumin, các tác giả cho rằng THC là chất chuyển hóa chính của curcumin ở đường tiêu hóa Nhóm phenolic đóng vai trò dọn các gốc tự do trong giai đoạn đầu của quá trình chống oxy hóa Tuy nhiên, sự phân cắt liên kết C-C trong khung β-diceton cũng được quan sát thấy trong quá trình này Như vậy, nhóm β-diceton đóng vai trò dọn các gốc tự do trong giai đoạn sau [28]

12

Năm 2016, tác giả Hoàng Dung cũng đã tổng hợp được dẫn chất monoalkyl hóa và thử hoạt tính chống oxy hóa hệ DPPH và kháng tế bào ung thư gan HepG2 [5]

Hình 1.8 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất monoalkyl hóa từ curcumin theo tác giả

ký cột [5]

1.3 Tiền thuốc phosphat trong nghiên cứu phát triển thuốc và curcumin

Tạo ta tiền thuốc là một trong những hướng đi quan trọng trong nghiên cứu phát triển thuốc hiện nay Các tiền thuốc có khả năng cải thiện độ tan, độ

ổn định và tăng sinh khả dụng của thuốc ban đầu (thuốc mẹ) Trong cơ thể, thuốc mẹ được giải phóng qua quá trình biến đổi sinh học nhờ các enzym Các cấu trúc hay được sử dụng để xây dựng tiền thuốc là ester, amid, carbamat, carbonat, ether, imin, phosphat…(xem Hình 1.9) Trong đó, ester phosphat có ưu điểm là tương đối bền trong môi trường chuyển hóa do có pKa thấp, từ 1-2 Ở pH sinh lý 7,0-7,4, nó bị deproton hóa mang điện tích âm tương đối bền nhưng lại dễ dàng hoạt hóa giải phóng thuốc mẹ dưới tác dụng của các enzym: esterase, phosphatase, amidase…ở ruột và trong tế bào [22]

Hình 1.9 Cơ chế giải phóng thuốc mẹ từ tiền thuốc

 Các tiền thuốc phosphat trong nghiên cứu phát triển thuốc

Trên thực tế, rất nhiều nhà nghiên cứu đã sử dụng phương pháp tạo tiền thuốc phosphat để tăng độ tan và tăng sinh khả dụng của thuốc Degoey và cộng

sự đã tổng hợp một loạt các tiền thuốc của lopinavir (LPV) và ritonavir (RTV) – các chất ức chế protease HIV Kết quả cho thấy các tiền thuốc oxymethylphosphat và oxyethylphosphat có độ tan trong nước tương ứng cao hơn 700 lần và 1 600 lần so với LPV và RTV (Hình 1.10) Các nghiên cứu về dược động học trên chuột và chó cũng cho thấy nồng độ cao các thuốc mẹ sau khi dùng qua đường uống [12]

14

Hình 1.10 Tiền thuốc phosphat của Lopinavir và Ritonavir

Một ví dụ khác đó là tiền thuốc dưới dạng ester phosphat của propofol Propofol là một thuốc thân dầu, thường được sử dụng trong nhũ tương dầu trong nước Để khắc phục nhược điểm này, H Kumpulainen và cộng sự đã gắn thêm nhóm phosphat vào propofol qua cầu ethylenedioxy (Hình 1.11) Kết quả cho

thấy tiền thuốc ethyl dioxy phosphat (chất 10) có độ ổn định tăng, độ tan trong

nước cao hơn propofol gấp 70 lần và có thể sử dụng đường tiêm [23]

Propofol Độ tan trong nước tăng 70 lần

O PO

N HN O

O

O O

O R P

OO

NH O

HO HN

O O

N S

O R O NH

O O

S N

Độ tan trong nước tăng 1600 lần

Hình 1.11 Tiền thuốc phosphat của propofol

11 Độ tan trong nước tăng 30 000 lần

Hình 1.12 Tiền thuốc phosphat của dẫn chất benzimidazol

Một dẫn chất khác của benzimidazol có độ tan trong nước kém là

α-6-chloro-2-(methylthio)-5-(naphthalen-1-yloxy)-1H-benzo[d]imidazol (13)

Flores-ramos và cộng sự đã gắn thêm nhóm phosphat vào 13 tạo tiền thuốc 14

có độ tan trong nước tăng 50 000 lần so với chất ban đầu 13 Các thử nghiệm

trên in vitro và in vivo cho thấy tiền thuốc 14 có hoạt tính tương tự 13, tuy

nhiên liều dùng trên in vivo giảm đi so với 13 [17] [22]

O

N H

N SCH3Cl

O

N

N SCH3Cl

O P O

O N H

O

N N

O N H

O

P OH O HO

Hình 1.14 Tiền thuốc của chalcon

 Tiền thuốc phosphat của curcumin

Năm 2015, L Ding và các cộng sự đã thực hiện phosphoryl hóa trực tiếp nhóm –OH phenol của curcumin và thu được một số dẫn chất phosphat trong

đó dẫn chất monophosphat của curmumin là curcumin-O-yl dihydrophosphat

(16) (Hình 1.15) thể hiện hoạt tính ức chế mạnh trên tế bào HeLa (IC50 = 6,78 µM) so với curcumin (IC50 =17,67 µM) Phép thử in vitro trong bào tương

chuột cho thấy dẫn chất này giải phóng từ từ ra curcumin [13]

HO OHO

OH

Hình 1.15 Cấu tạo curcumin-O-yl dihydrophosphat

Như vậy, khi gắn thêm 1 nhóm phosphat trên -OH phenol của curcumin

có tác dụng làm tăng độ tan và hoạt tính của curcumin

Đầu năm 2017, nhóm nghiên cứu chúng tôi đã bước đầu gắn thành công nhóm phosphat trên phân tử curcumin thông qua cầu oxyethyl để tạo ra 2-

(curcumin-O-yl)ethyl dihydrophosphat theo sơ đồ Hình 1.16 Những thử

15

5

Độ tan trong nước tăng 3 000 lần

nghiệm ban đầu cho thấy, dẫn chất phosphat này có tác dụng chống oxy hóa tốt hơn curcumin ban đầu, tác dụng kháng tế bào ung thư cũng cao hơn gấp 1,7-2,3 lần so với curcumin ban đầu [8]

Hình 1.16 Sơ đồ tổng hợp 2-(curcumin-O-yl)ethyl dihydrophosphat (LH-2)

Trên cơ sở các phân tích trên, chúng tôi tiếp tục phát triển các nghiên

cứu về 2-(curcumin-O-yl)ethyl dihydrophosphat nhằm tìm được các ứng dụng

xa hơn, có thể đóng góp vào việc phát triển thuốc từ nguồn dược liệu sẵn có Luận văn tập trung giải quyết các vấn đề về quy trình tổng hợp chất này, đánh giá độ tan trong nước của nó

18

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu - hóa chất

- Nguyên liệu ban đầu được sử dụng là curcumin được tinh chế từ hỗn

hợp bột curcuminoid chiết xuất từ Curcuma longa L (cung cấp bởi Công ty

CPDP Bắc Ninh), tại phòng Tổng hợp Hóa dược Bộ môn Công nghiệp Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội đạt hàm lượng >96%

- Các hóa chất cần thiết khác đều đạt tiêu chuẩn AR (Analytical reagent - thuốc thử phân tích) được thống kê trong Bảng 2.1

Bảng 2.1 Danh mục các nguyên liệu - hóa chất

1 2-bromoethanol >95%, AK Sci (Mỹ)

4 Acid hydrocloric AR, Trung Quốc

5 Dicloromethan AR, Trung Quốc

6 Diethyl ether AR, Trung Quốc

8 Kali carbonat AR, Trung Quốc

11 Natri sulfat khan AR, Trung Quốc

12 Natri hydroxid AR, Trung Quốc

13 Phosphoryl clorid AR, Trung Quốc

15 Silicagel cỡ hạt 0,063-0,2

6 Bộ lọc hút chân không Buchner Trung Quốc

7 Cân kỹ thuật Sartorius BP 2001S Thụy Sĩ

8 Cân phân tích Mettler Toledo AB204-S Thụy Sĩ

9 Cốc có mỏ 50 mL, 100 mL, 250 mL, 500 mL, 1 L Đức

13 Hệ phản ứng có áo nhiệt Chemglass 5 L Mỹ

14 Máy cất quay chân không Buchi R-210, R-220 Thụy Sĩ

16 Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker 500 MHz

Ascend

Mỹ

17 Máy đo phổ hồng ngoại Jasco FT/IR-6700 Nhật

18 Máy đo phổ khối lượng Bruker evoq qube Mỹ

19 Máy khuấy từ có bộ phận gia nhiệt IKA Đức

20

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu quy trình tổng hợp:

 Tổng hợp dẫn chất mono-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin (LH-1) và khảo

sát các yếu tố ảnh hưởng

 Tổng hợp dẫn chất 2-(curcumin-O-yl)ethyl dihydrophosphat (LH-2) và

khảo sát các yếu tố ảnh hưởng

- Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng đo nhiệt độ nóng chảy và sắc ký lớp mỏng (SKLM) với hệ dung môi thích hợp

- Xác định cấu trúc các sản phẩm tổng hợp được bằng phổ khối lượng (MS), phổ hồng ngoại (IR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR)

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Quy trình tổng hợp, tinh chế sản phẩm

Sử dụng các phản ứng cơ bản trong hóa học hữu cơ để tổng hợp các chất dự

kiến: phản ứng O-alkyl hóa, phản ứng ester hóa, thủy phân, trung hòa (xem

H 3 CO O OH

OH OH

LH-2

C23H25O10P M =492,42

LH-1

Hình 2.1 Sơ đồ tổng hợp LH-1 và LH-2

2,5); n-butanol : acid acetic : nước (5,0 : 2,0 : 2,5) Quan sát sắc kí đồ dưới

bước sóng 254 và 366 nm của đèn tử ngoại

 Sử dụng các phương pháp cất, chiết lỏng – lỏng, chiết rắn - lỏng, sắc ký cột và kết tinh để tinh chế sản phẩm

2.4.2 Kiểm tra sơ bộ độ tinh khiết

 Sử dụng phương pháp SKLM (theo các điều kiện như trên) và đo nhiệt độ nóng chảy để kiểm tra sơ bộ độ tinh khiết của sản phẩm

 Nhiệt độ nóng chảy được ghi trên máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt

22

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Quy trình tổng hợp

3.1.1 Tổng hợp dẫn chất mono-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin (LH-1)

a Tiến hành theo tài liệu

Tiến hành theo tác giả Changtam, phản ứng O-alkyl hóa curcumin sử

dụng tác nhân 2-bromoethanol, xúc tác kali carbonat trong aceton [10]

7 1''

O

5'' 4'' 3'' 2''

2'

O O

1 2 3

7 1''

OH

5'' 4'' 3'' 2''

 Xử lý phản ứng:

Để nguội khối phản ứng, cất loại hết aceton ở 50°C Hòa tan phần còn lại trong bình cầu với 100 mL dicloromethan rồi chuyển vào bình chiết 250 mL Rửa pha hữu cơ bằng nước đến pH trung tính để loại hoàn toàn kali carbonat

và một phần tác nhân dư Tinh chế sản phẩm bằng sắc ký cột

Cất loại dicloromethan đến khi còn khoảng 10 mL dịch, trộn với 1,0 g silicagel Nhồi đủ lượng silicagel 63-200 µm vào sắc ký cột (chiều dài 60 cm, đường kính 3 cm Nạp mẫu, rửa giải với hệ dung môi dicloromethan :

methanol (100 : 1) loại bỏ các phân đoạn curcumin Rửa giải tiếp với hệ

dicloromethan : methanol (50 : 1) để thu các phân đoạn LH-1 Gộp các phân

đoạn sản phẩm, cất loại dung môi và thu sản phẩm Sấy sản phẩm ở 60o

C trong 2 giờ, cân

 Kết quả: thu được 0,21 g LH-1 (hiệu suất 37,35 %), nhiệt độ nóng chảy:

159,8-161,7°C; R f = 0,66 (hệ dung môi dicloromethan : methanol = 9 : 1)

b Cải tiến phương pháp tinh chế

 Sơ đồ phản ứng: xem Hình 3.1

 Mô tả phản ứng:

Khuấy hỗn hợp gồm 2,0 g (5,44 mmol) curcumin, 3,76 g (27,12 mmol) kali carbonat khan và 80 mL aceton khan trong bình cầu hai cổ dung tích

1000 mL Lấy 0,72 ml (10,88 mmol) tác nhân 2-bromoethanol pha loãng với

400 ml aceton khan Khuấy và đun hỗn hợp phản ứng (55oC) rồi nhỏ từ từ dung dịch tác nhân trong aceton, đun tiếp trong 16 giờ Theo dõi phản ứng bằng SKLM

 Xử lý phản ứng:

Sau khi kết thúc phản ứng, cất loại aceton Hòa tan phần còn lại trong bình cầu với 200 mL dicloromethan rồi chuyển vào bình chiết 500 mL Rửa pha hữu cơ bằng nước đến pH trung tính Thay vì dùng sắc ký cột để tinh chế sản phẩm, chúng tôi sử dụng phương pháp chiết lỏng-lỏng ở pH thích hợp và kết tinh để tinh chế sản phẩm

Phương pháp tiến hành như sau:

Thêm 150 mL nước cất vào bình chiết, kiềm hóa bằng dung dịch NaOH 1M đến pH 12, tách lấy pha nước Chỉnh pH pha nước bằng dung dịch HCl 1M đến pH 10, đồng thời thêm lần lượt thể tích dicloromethan Lắc bình chiết, tách thu pha hữu cơ Tiến hành nhiều lần, theo dõi bằng SKLM với hệ dung môi dicloromethan : methanol = 9 : 1 Rửa lại pha hữu cơ với nước cất Làm khan pha hữu cơ bằng natri sulfat khan qua đêm Lọc loại chất làm khan

24

Cất loại hoàn toàn dung môi ở 45oC thu lấy cắn Kết tinh cắn trong methanol thu được tinh thể hình kim màu vàng cam Sấy sản phẩm ở 60o

C trong 2 giờ, cân

 Kết quả: thu được 0,48 g LH-1 (hiệu suất 21,4%), sản phẩm có nhiệt độ

nóng chảy 159,8 – 161,7oC; R f = 0,66

Nhận xét: Hiệu suất phản ứng theo quy trình không sử dụng sắc kí cột cho

hiệu suất thấp hơn quy trình sử dụng sắc kí cột (theo tài liệu) nhưng cho nhiều

ưu điểm hơn: thao tác dễ dàng, giảm chi phí, có thể thu hồi dung môi và tái sử dụng được Do đó, chúng tôi lựa chọn quy trình không sử dụng sắc ký cột để khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng nhằm xây dựng quy

trình thích hợp tổng hợp LH-1

c Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng:

Đề tài đã tiến hành khảo sát các yếu tố sau:

- Tỷ lệ mol 2-bromoethanol : curcumin

- Nhiệt độ

- Dung môi

- Xúc tác

- Nồng độ tác nhân

Theo dõi phản ứng bằng SKLM, chọn điểm kết thúc phản ứng khi trên sắc

ký đồ xuất hiện tạp dialkyl hóa và trialkyl hóa

 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol 2-bromoethanol : curcumin

Cố định các điều kiện nhiệt độ 55- 56oC, dung môi aceton, xúc tác K2CO3, chúng tôi khảo sát các tỷ lệ mol 2-bromoethanol : curcumin như sau: 0,5 : 1; 1 : 1; 1,5 : 1; 2 : 1; 3 : 1 Theo dõi phản ứng trong 16 giờ Kết quả được thể hiện

ở Bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát tỷ lệ mol 2-bromoethanol : curcumin

chất dialkyl Vết LH-1 đậm nhất ở tỷ lệ 2-bromoethanol : curcumin = 2 : 1 (thu được 0,48 g LH-1, hiệu suất 21,4 %) Nếu tăng tỷ lệ tác nhân : curcumin

lên tiếp, tác nhân lại có xu hướng alkyl hóa vào dẫn chất monoalkyl nhiều hơn

vào curcumin, sản phẩm phụ là dẫn chất dialkyl tăng lên, hàm lượng LH-1 lại

giảm (hiệu suất 18,7%)

 Ảnh hưởng của nhiệt độ:

Sau khi lựa chọn được tỷ lệ mol tối ưu, chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng ở các nhiệt độ 25°C, 35°C, 45°C, 55°C Kết quả thu được trình bày ở Bảng 3.2:

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát nhiệt độ phản ứng tạo LH-1

STT Nhiệt độ phản ứng m sản phẩm (g) Hiệu suất (%)

26

Nhận xét:

Kết quả khảo sát cho thấy phản ứng O-alkyl hóa curcumin xảy ra ở nhiệt

độ ≥ 45°C Ở điều kiện nhiệt độ 45°C, phản ứng có xảy ra nhưng sản phẩm tạo ra ít, vết trên SKLM mờ nhạt, hiệu suất thấp (4,7%) Tại nhiệt độ 55°C - nhiệt độ sôi của hỗn hợp phản ứng, sản phẩm monoalkyl tạo ra nhiều nhất, thu

được 0,48 g LH-1 Khi tăng nhiệt độ lên, phản ứng tạo dialkyl nhiều hơn

 Ảnh hưởng của dung môi

Sau khi lựa chọn được các điều kiện tối ưu về tỷ lệ mol, nhiệt độ, chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của dung môi (aceton, acetonitril) đến phản ứng thông qua theo dõi các vết trên SKLM Kết quả thu được thể hiện ở Bảng 3.3

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát dung môi phản ứng tạo LH-1

STT Dung môi Nhiệt độ m sản phẩm (g) Hiệu suất (%)

Nhận xét:

Trong môi trường acetonitril, nhiệt độ 55°C, phản ứng monoalkyl hóa

curcumin vẫn xảy ra nhưng thu được ít sản phẩm monoalkyl hơn (0,1 g

LH-1), hiệu suất chỉ đạt 4,5% Phản ứng monoalkyl hóa curcumin trong môi

trường aceton xảy ra tốt, thu được nhiều sản phẩm monoalkyl hơn (hiệu suất đạt 21,4 %)

 Ảnh hưởng của xúc tác

Với tỷ lệ mol 2-bromoethanol : curcumin = 2:1, dung môi aceton, nhiệt độ 55°C, chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của xúc tác (K2CO3, pyridin, KI – số mol bằng 10% số mol curcumin) đến phản ứng, kết quả trình bày ở Bảng 3.4

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát xúc tác phản ứng tạo LH-1

STT Xúc tác m sản phẩm (g) Hiệu suất (%) Thời gian (giờ)

Nhận xét:

Phản ứng O-alkyl hóa curcumin không xảy ra khi sử dụng xúc tác là

pyridin Phản ứng xảy ra tốt khi dùng K2CO3 làm xúc tác Kết hợp KI và

K2CO3 làm xúc tác thì hiệu suất thay đổi không đáng kể, phản ứng xảy ra nhanh hơn, monoalkyl tạo ra nhanh, thời gian phản ứng được rút ngắn

 Ảnh hưởng của nồng độ tác nhân

Thay đổi nồng độ tác nhân và theo dõi ảnh hưởng của nồng độ tác nhân đến hiệu suất phản ứng, kết quả thu được thể hiện ở Bảng 3.5

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát nồng độ tác nhân trong phản ứng tạo LH-1

Nhận xét:

Nồng độ tác nhân cũng ảnh hưởng đến kết quả phản ứng tạo LH-1 Khi

nồng độ tác nhân lớn (0,72 mL tác nhân/ 200 mL aceton) thì phản ứng có xu hướng tạo nhiều sản phẩm phụ là dẫn chất dialkyl hóa và trialkyl hóa Pha loãng tác nhân hơn (0,72 mL tác nhân/ 400 mL aceton) thì sản phẩm monoalkyl hóa tạo ra tốt, tạp dialkyl hóa xuất hiện ít, hiệu suất đạt 21,4 % Khi tăng độ pha loãng tác nhân (0,72 mL tác nhân/ 600 mL aceton) thì tạp

28

dialkyl hóa và trialkyl hóa xuất hiện ít nhưng hiệu suất không thay đổi đáng

kể, tốn dung môi

d Tổng hợp LH-1 ở quy mô 2g/mẻ

Từ kết quả của các khảo sát trên, chúng tôi đã lựa chọn được các thông

số cho quy trình tổng hợp LH-1 như sau:

- Tỷ lệ mol 2-bromoethanol : curcumin = 2 : 1

- Phương pháp tinh chế: không sử dụng sắc ký cột

Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành tổng hợp LH-1 ở quy mô 2g/mẻ theo quy

trình như sau:

Cho hỗn hợp gồm 10,0 g (27,2 mmol) curcumin, 18,8 g (135,6 mmol) kali carbonat khan, 0,5 g (2,72 mmol) KI, 2,4 L aceton khan trong bình phản ứng có áo nhiệt dung tích 5 L và 3,6 ml (54,4 mmol) tác nhân 2-bromoethanol Khuấy và đun hồi lưu (55oC) hỗn hợp phản ứng trong 36 giờ (theo dõi phản ứng bằng SKLM)

Sau khi kết thúc phản ứng, cất loại aceton Hòa tan phần còn lại trong bình cầu với 1,5 L dicloromethan rồi chuyển vào bình chiết 2 L Rửa pha hữu

cơ bằng nước đến pH trung tính Thêm 500 mL nước cất vào bình chiết, kiềm hóa bằng dung dịch NaOH 1M đến pH 12, tách lấy pha nước Chỉnh pH pha nước bằng dung dịch HCl 1M đến pH 10, đồng thời thêm lần lượt thể tích dicloromethan Lắc bình chiết, tách thu pha hữu cơ Tiến hành nhiều lần, theo dõi bằng SKLM với hệ dung môi dicloromethan : methanol = 9 : 1 Rửa lại pha hữu cơ với nước cất Làm khan pha hữu cơ bằng natri sulfat khan qua đêm Lọc loại chất làm khan Cất loại hoàn toàn dung môi ở 45o

C thu lấy cắn

Kết tinh cắn trong methanol thu được tinh thể hình kim màu vàng cam Sấy sản phẩm ở 60oC trong 2 giờ, cân

Rửa đến pH trung tính

Pha nước

(tạp curcumin)

Làm khan, cất Dicloromethan

C

Lọc, Sấy

LH-1

Hình 3.2 Sơ đồ quy trình tổng hợp LH-1 ở quy mô 2 g/mẻ

Sơ đồ quy trình được mô tả trong Hình 3.2:

Kết quả:

Bảng 3.6 Kết quả tổng hợp LH-1 ở quy mô 2 g/mẻ

Mẻ m curcumin (g) m sản phẩm (g) Hiệu suất %) t o nc ( o C) R f *

(*: hệ dung môi dicloromethan : methanol = 9 : 1)

Sau khi tiến hành 3 mẻ đều thu được sản phẩm dạng tinh thể hình kim

màu vàng cam có nhiệt độ nóng chảy 159,5-161,7°C, R f = 0,66 (hệ dung môi dicloromethan : methanol = 9 : 1) Hiệu suất trung bình 3 mẻ đạt 20,6 %

3.1.2 Tổng hợp dẫn chất 2-(curcumin-O-yl)ethyl dihydrophosphat (LH-2)

a Thử nghiệm phản ứng phosphat hóa LH-1

Phản ứng phosphat hóa bằng phosphoryl clorid được thực hiện theo tài liệu của Sowa với xúc tác là pyridin, nước trong dung môi acetonitril [36]

(0,48 mmol) LH-1 trong 10 mL acetonitril rồi nhỏ từ từ vào hỗn hợp trong

32

bình cầu Duy trì khuấy và kiểm soát và duy trì nhiệt độ trong bình ở 0°C

trong 4 giờ Theo dõi hỗn hợp phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi

n-butanol : acid acetic : nước (9,0 : 2,0 : 2,5)

 Xử lý phản ứng:

Kết thúc phản ứng, đổ hỗn hợp phản ứng vào 20 mL nước đá và khuấy tiếp trong 1 h Chỉnh pH hỗn hợp phản ứng về pH 2-3 bằng dung dịch NaOH 1M, cất quay chân không ở 50°C để loại bỏ acetonitril

Chuyển dịch còn lại vào bình chiết 250 mL, chiết với diethyl ether 3 lần, mỗi lần 30 mL để loại nguyên liệu còn dư Lấy pha nước, chiết 3 lần với ethyl acetat (70 mL/lần x 3 lần) để chuyển hết sản phẩm vào pha hữu cơ Rửa pha hữu cơ bằng nước cất (20 mL/lần x 2 lần) Làm khan bằng natri sunfat qua đêm, lọc loại chất làm khan, rồi cất quay chân không đến kiệt thu được sản phẩm

 Kết quả:

Thu được 0,2 g sản phẩm ( hiệu suất 83,7 %), sản phẩm có R f = 0,55 (hệ dung môi n-butanol : acid acetic : nước = 9,0 : 2,0 : 2,5)

b Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng:

 Ảnh hưởng của tỷ lệ mol POCl 3 : LH-1:

Tại nhiệt độ phản ứng ở 0-2°C, khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol POCl3 :

LH-1 tới hiệu suất phản ứng ở các tỷ lệ khác nhau (5:1, 10:1, 15:1, 20:1) và

theo dõi vết phản ứng trên SKLM Kết quả thu được như sau:

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát tỷ lệ mol POCl3 : LH-1

STT Tỷ lệ mol

POCl 3 : LH-1 Kết quả theo dõi SKLM m sản phẩm

(g)

Hiệu suất (%)