Tổng hợp và docking phân tử các dẫn xuất curcumin từ p methoxybenzaldehyde

Nhiệm vụ của khóa luận: - Tổng hợp thành công 04 dẫn xuất curcumin từ p-methoxybenzaldehyde - Xác định cấu trúc hóa học của 04 dẫn xuất bằng phổ 1H, 13C-NMR, HSQC và MS - Xác định các

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ KỸ THUẬT HÓA HỌC

TỔNG HỢP VÀ DOCKING PHÂN TỬ CÁC DẪN

XUẤT CURCUMIN TỪ p-METHOXYBENZALDEHYDE

GVHD: HOÀNG MINH HẢO SVTH: PHAN ĐĂNG QUỚI TỬ MSSV: 15128078

Tp Hồ Chí Minh, tháng 7/2019

SKL 0 0 5 9 9 2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Họ và tên sinh viên: Phan Đăng Quới Tử MSSV: 15128078

Ngành: Công nghệ Kỹ thuật Hóa học

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

1 Tên khóa luận:

Tổng hợp và docking phân tử các dẫn xuất curcumin từ p-methoxybenzaldehyde

2 Nhiệm vụ của khóa luận:

- Tổng hợp thành công 04 dẫn xuất curcumin từ p-methoxybenzaldehyde

- Xác định cấu trúc hóa học của 04 dẫn xuất bằng phổ 1H, 13C-NMR, HSQC và MS

- Xác định các tương tác giữa các dẫn xuất và protein CDK2 (PDB: 2R3I) bằng phương

pháp docking phân tử

3 Ngày giao nhiệm vụ khóa luận: 22/02/2019

4 Ngày hoàn thành khóa luận: 19/07/2019

5 Họ tên người hướng dẫn: TS Hoàng Minh Hảo

Nội dung hướng dẫn: Toàn bộ khóa luận

Nội dung và yêu cầu khóa luận tốt nghiệp đã được thông qua bởi

Trưởng Bộ môn Công nghệ Hóa học

Tôi chân thành cảm ơn TS Hoàng Minh Hảo – Giảng viên Bộ môn Công nghệ Hóa học, Khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm, Trường ĐH Sư phạm Kỹ thuật Tp Hồ Chí Minh Thầy đã luôn hỗ trợ và chỉ dạy tôi rất tận tình từ khi hình thành ý tưởng đến khi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin cảm ơn Cô Nguyễn Thị Mỹ Lệ - Chuyên viên Phòng Thí nghiệm, Bộ môn Công nghệ Hóa học Cô đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi rất nhiều về dụng cụ, máy móc, thiết bị trong quá trình thực hiện khóa luận tại phòng thí nghiệm

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Tôi hứa sẽ vận dụng những kiến thức và kỹ năng học được để phục vụ cho mục tiêu nghề nghiệp tương lai Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả, chúc mọi người nhiều sức khỏe và thành công

Tp Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 07 năm 2019

Sinh viên thực hiện

PHAN ĐĂNG QUỚI TỬ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan toàn bộ nội dung được trình bày trong khóa luận tốt nghiệp là của riêng tôi Tôi xin cam đoan các nội dung được tham khảo trong khóa luận tốt nghiệp

đã được trích dẫn chính xác và đầy đủ theo quy định

Tp Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 07 năm 2019

Sinh viên thực hiện

PHAN ĐĂNG QUỚI TỬ

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC VIẾT TẮT ix

TÓM TẮT x

MỞ ĐẦU xi

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1

1.1 Tổng quan về curcumin 1

1.1.1 Sơ lược về nghệ vàng và curcuminoid 1

1.1.2 Hoạt tính sinh học của curcuminoid 2

1.1.3 Pharmacophore của curcumin 5

1.1.4 Các dẫn xuất isoxazole và pyrazole của curcumin 7

1.2 Tình hình nghiên cứu về các dẫn xuất curcumin 8

1.2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 8

1.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 10

1.3 Giới thiệu về phương pháp docking 11

1.4 Receptor – Cyclin dependent kinase 2 (CDK2) 12

1.5 Docking phân tử các dẫn xuất curcumin đối với 2R3I 13

1.6 Điểm mới và tính cấp thiết của đề tài 14

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Đối tượng nghiên cứu 15

2.2 Nguyên liệu, trang thiết bị thí nghiệm 15

2.2.1 Nguyên liệu 15

2.2.2 Dụng cụ và trang thiết bị 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Tổng hợp 16

2.3.2 Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc hóa học 20

2.3.3 Phương pháp docking phân tử 22

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26

3.1 Kết quả tổng hợp các dẫn xuất curcumin 26

3.1.1 Kết quả tổng hợp (1E,4Z,6E)5hydroxy1,7bis(4methoxyphenyl)hepta -1,4,6-trien-3-one (QT01) 26

3.1.2 Kết quả tổng hợp 3,5-bis((E)-4-methoxystyryl)isoxazole (QT02) 28

3.1.3 Kết quả tổng hợp 3,5-bis((E)-4-methoxystyryl)-4H-pyrazole (QT03) 30

3.1.4 Kết quả tổng hợp 3,5-bis((E)-4-methoxystyryl)-1-phenyl-1H-pyrazole (QT04) 32

3.2 Kết quả docking phân tử các dẫn xuất curcumin 34

3.2.1 Kết quả redocking 34

3.2.2 Kết quả docking phân tử các dẫn xuất curcumin 36

3.3 Cơ chế tổng hợp các dẫn xuất curcumin từ chất nền p-methoxybenzaldehyde 40 3.3.1 Cơ chế tổng hợp (1E,4Z, 6E)5hydroxy1,7bis(4methoxyphenyl)hepta -1,4,6-trien-3-one (QT01) 40

3.3.2 Cơ chế tổng hợp 3,5-bis((E)-4-methoxystyryl)isoxazole (QT02) 41

3.3.3 Cơ chế tổng hợp 3,5-bis((E)-4-methoxystyryl)-4H-pyrazole (QT03) 42

3.3.4 Cơ chế tổng hợp 3,5-bis((E)-4-methoxystyryl)-1-phenyl-1H-pyrazole

(QT04) 42

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44

Kết luận 44

Kiến nghị 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

PHỤ LỤC 50

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Thân, củ nghệ vàng 1

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của curcuminoid 2

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của curcumin 3

Hình 1.4 Cấu trúc curcumin và các dẫn xuất isoxazole và pyrazole curcumin được tổng hợp 7

Hình 1.5 Các dẫn xuất curcumin do Ohtsu và cộng sự tổng hợp 10

Hình 1.6 Cấu trúc của protein CDK2 13

Hình 1.7 Tương tác giữa SCF với protein CDK2 (ID: 2R3I) 13

Hình 2.1 Hệ thống phản ứng tổng hợp (1E,4Z,6E) 5 – hydroxy 1,7 bis (4 -methoxyphenyl)hepta -1,4,6-trien-3-one 17

Hình 2.2 Các xách định giá trị x, y trên bản mỏng 21

Hình 2.3 Thông số redocking 23

Hình 2.4 Thông số docking 24

Hình 3.1 Kết quả bản mỏng của hợp chất QT01 với ba hệ dung môi A, B và C 26

Hình 3.2 Công thức cấu tạo của hợp chất QT01 28

Hình 3.3 Kết quả bản mỏng của hợp chất QT02 với ba hệ dung môi A, B và C 28

Hình 3.4 Công thức cấu tạo của hợp chất QT02 30

Hình 3.5 Kết quả bản mỏng của hợp chất QT03 với ba hệ dung môi C, D và E 30

Hình 3.6 Công thức cấu tạo của hợp chất QT03 32

Hình 3.7 Kết quả bản mỏng của hợp chất QT04 với ba hệ dung môi A, B và C 32

Hình 3.8 Công thức cấu tạo của hợp chất QT04 34

Hình 3.9 Tương tác của ligand SCF với CDK2 (ID: 2R3I) 35

Hình 3.10 Vị trí tương đối của ligand được re-dock (màu đỏ) so với ligand đồng kết tinh (màu xanh) 35

Hình 3.11.Tương tác của các dẫn xuất curcumin được tổng hợp từ chất nền p-methoxybenzaldehyde với CDK2 (ID: 2R3I) 38

Hình 3.12 Tương tác của các dẫn xuất curcumin với CDK2 (ID: 2R3I) 39

Hình 3.13 Cơ chế phản ứng tổng hợp hợp (1E,4Z,6E) – 5 – hydroxy – 1,7 – bis (4-methoxyphenyl)hepta -1,4,6-trien-3-one 40

Hình 3.14 Cơ chế phản ứng tổng hợp 3,5-bis((E)-4-methoxystyryl)isoxazole 41

Hình 3.15 Cơ chế phản ứng tổng hợp 3,5-bis((E)-4-methoxystyryl)-4H-pyrazole 42 Hình 3.16 Cơ chế phản ứng tổng hợp 3,5-bis((E)-4-methoxystyryl)-1-phenyl-1H-

pyrazole 43

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần các chất trong thân rễ nghệ 2Bảng 1.2 Cấu trúc hóa học của curcumin và dẫn xuất 6 Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng trong quy trình tổng hợp các dẫn xuất curcumin từ

chất nền p-methoxybenzaldehyde 15

Bảng 3.1 Điểm số docking và amino acid gắn kết của SCF và các dẫn xuất curcumin 36

DANH MỤC VIẾT TẮT

ACD Available Chemical Directory

CC Column Chromatography (Sắc ký cột)

CDK2 Cyclin - Dependent Kinase 2

CSD Cambridge Structural Database

MS Mass Spectrometry (Phổ khối lượng)

NMR Nuclear Magnetic Resonance (Cộng hưởng từ hạt nhân) PDB Protein Data Bank (Ngân hàng dữ liệu protein)

TBARS Thiobarbituric Acid Reactive Substances

TLC Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng)

TÓM TẮT

Curcumin được biết đến như là một hợp chất phenolic – hoạt chất có giá trị về mặt y học trong củ nghệ vàng Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng curcumin có hoạt tính rất đa dạng như: kháng viêm, kháng oxy hóa, kháng ung thư … Mặc dù curcumin có hoạt tính hứa hẹn và đa dạng nhưng curcumin không bền dược động học và khả năng hấp thu kém nên có hiệu quả thấp trong y học Để tìm kiếm các dẫn xuất curcumin khác,

trong phạm vi nghiên cứu của khóa luận, p-mexthoxybenzaldehyde đã được chọn làm

chất nền để tổng hợp các dẫn xuất của curcumin Hợp chất QT01 được tổng hợp bằng

phản ứng ngưng tụ aldol hóa giữa p-mexthoxybenzaldehyde với 2,4-pentanedione, xúc tác và n-butylamine Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng hai nhóm 1,3-diketone của

curcumin đóng vai trò quan trọng đối với hoạt tính kháng viêm, kháng ung thư Vì thế, các dẫn xuất isoxazole (QT02) và pyrazole (QT03, QT04) lần lượt được tổng hợp từ QT01 với hydroxylamine hydrochloride (NH2OH.HCl), hydrazine hydrate (NH2NH2.H2O) và phenylhydrazine hydrochloride (NH2NHC6H5.HCl) trong acetic acid tại 80 oC kết hợp khuấy từ Độ tinh khiết và cấu trúc hóa học của các chất dẫn xuất được xác định bằng các phương pháp như TLC, đo nhiệt độ nóng chảy, phổ 1H,

13C-NMR, HSQC, MS

Các dẫn xuất được tiến hành docking phân tử đối với enzyme cyclin-dependent kinase

2 (CDK2; PDB: 2R3I) để xác định năng lượng và vị trí tương tác của các dẫn chất với mục tiêu tác động CDK2

MỞ ĐẦU

Curcumin là được biết đến như là một hợp chất phenolic – hoạt chất có giá trị về mặt y học trong củ nghệ vàng Curcumin có hoạt tính rất đa dạng như: kháng viêm, kháng oxy hóa, kháng ung thư … Hoạt tính của curcumin đến từ các nhóm thế trên hai nhân phenyl, 02 nhóm carbonyl (>C=O) và nối đôi >C=C< nên việc biến đổi curcumin thành các dẫn xuất khác dựa trên các phản ứng tập trung vào các trung tâm hoạt tính trên là cần thiết và hứa hẹn Nghiên cứu này tập trung vào thay đổi các nhóm thế trên nhân phenyl bằng cách sử dụng dẫn xuất benzaldehyde ban đầu tương ứng Tiếp theo, biến đổi hóa học được thực hiện trên 02 nhóm carbonyl ở vị trí 1,3 của dẫn xuất curcumin vừa được tổng hợp nhằm tìm kiếm các dẫn xuất có hoạt tính tốt hơn

Curcumin và các dẫn xuất có hoạt tính đa dạng như kháng oxy hóa, kháng viêm, kháng ung thư, nên việc hiểu chi tiết hơn các tương tác giữa curcumin và các dẫn xuất lên các mục tiêu tác động có ý nghĩa quan trọng Docking phân tử sẽ giúp phân tích cụ thể hơn về các tương tác, từ việc phân tích docking phân tử sẽ đề xuất các dẫn xuất mới nhằm nâng cao hiệu quả tương tác giữa phối tử và mục tiêu Cyclin – dependent kinase

2 (CDK2) là mục tiêu (receptor) được chọn để nghiên cứu docking phân tử vì enzyme này đóng vai trò quan trọng điều tiết chu kỳ tế bào, vì vậy liên quan trực tiếp đến bệnh ung thư Các dẫn xuất curcumin sau khi tổng hợp sẽ tiến hành docking phân tử lên enzyme CDK2 (PDB: 2R3I) nhằm xác định năng lượng tương tác và trung tâm hoạt động của các dẫn xuất đối với enzyme – CDK2

Các phản ứng tổng hợp dẫn xuất curcumin từ chất nền p-methoxybenzaldehyde dựa

trên cơ chế của phản ứng cộng ái nhân vào nhóm carbonyl của aldehyde và ketone Phần mềm Molecular Operating Environment (MOE) được sử dụng để thực hiện docking phân tử Chemdraw được sử dụng để vẽ các cấu trúc hóa học của các dẫn xuất curcumin

Kết quả nghiên cứu thu được sẽ cung cấp thêm thông tin về các dẫn xuất curcumin, định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo về các dẫn xuất và ứng dụng của chúng trong

y học

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về curcumin, curcuminoid

1.1.1 Sơ lược về nghệ vàng và curcuminoid

Nghệ, hay còn gọi là nghệ vàng, thuộc họ gừng, thân cao khoảng 0,6 đến 1,0 m Thân

rễ có dạng hình trụ hoặc hơi dẹt, khi bẻ hoặc cắt ngang có màu vàng cam do có chứa chất màu curcuminoid Lá hình trái xoan, thon nhọn ở hai đầu, hai mặt đều nhẵn, lá khum hình máng rộng, đầu tròn màu xanh lục nhạt, lá non hẹp hơn, màu tím nhạt (Hình 1.1) Củ nghệ có vị đắng, cay, mùi thơm hơi nồng, chứa tinh dầu với hàm lượng

3 – 5 % màu vàng nhạt, thơm Ngoài ra, thành phần trong củ nghệ còn có tinh bột, canxi oxalate (CaC2O4) và chất béo [1]

Hình 1.1 Thân, củ nghệ vàng

Hiện nay, nghệ là một cây trồng quen thuộc ở khắp các nước vùng nhiệt đới, từ Nam Á đến Đông Nam Á và Đông Á Ở Việt Nam, nghệ cũng được trồng ở khắp các địa phương, từ vùng đồng bằng ven biển đến vùng núi cao như Vĩnh Phúc, Hải Dương, Hưng Yên, Nghệ An, Quảng Nam, Đồng Nai, Bình Dương,… Phần củ nghệ được sử dụng trong thực phẩm, dược phẩm

Thành phần hóa học chính và quan trọng nhất của củ nghệ là curcuminoid (curcumin, demethoxycurcumin – DMC, bisdemethoxycurcumin – BDMC), chiếm hàm lượng khoảng 6%, là thành phần tạo màu vàng cho nghệ, trong đó lượng curcumin chiếm khoảng 70-80% khối lượng Trong củ nghệ còn chứa tinh dầu (hàm lượng từ 2-7%) với các thành phần chính là artumeron, zingberen, borneol [2, 3]

Ngoài ra còn có những thành phần khác trong củ nghệ được trình bày trong Bảng 1.1

Bảng 1.1 Thành phần các chất trong thân rễ nghệ

Thành phần Khối lượng/100g Đơn vị

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của curcuminoid

Curcumin tương đối trơ và không gây độc đối với cả động vật lẫn người ngay cả với lượng lớn Theo nghiên cứu, curcumin không gây độc với người khi dùng ở liều lượng cao [4] Chính nhờ tính an toàn đó mà curcumin là chất có tiềm năng sử dụng trong ngành dược

Curcumin có giá trị hoạt tính sinh học đa dạng là do trong công thức cấu tạo của curcumin có các nhóm hoạt tính (Hình 1.3):

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của curcumin

1 Nhóm parahydroxyl: hoạt tính chống oxi hoá

2 Nhóm keto: kháng viêm, kháng ung thư, chống đột biến tế bào

3 Nhóm liên kết đôi: kháng viêm, kháng ung thư, chống đột biến tế bào

Hoạt tính sinh học chủ yếu của curcumin là kháng oxy hoá, kháng khuẩn, kháng virus

và kháng một số loại ung thư Các nghiên cứu cho thấy curcumin có tác dụng tiêu diệt

tế bào ung thư Tại Mỹ, Đài Loan, người ta đã tiến hành thử lâm sàng dùng curcumin điều trị ung thư và kết luận rằng curcumin có thể ức chế sự phát triển tế bào ung thư

da, dạ dày, ruột, vòm họng, dạ con, bàng quang Curcumin còn có tương tác tốt với dạ dày, ruột, gan, mật, lọc máu, làm sạch máu, điều trị vết thương, chống viêm khớp, dị ứng, nấm, chống vi khuẩn Từ nǎm 1993, các nhà khoa học thuộc Đại học Harvarrd (Mỹ) đã công bố ba chất có tác dụng kìm hãm tế bào HIV-1, HIV-1-RT và một trong

ba chất đó là curcumin [5, 6]

1.1.2.1 Hoạt tính kháng oxy hóa

Gốc tự do là các chất phản ứng mạnh, được tạo ra khi cơ thể thu nhận khí oxy hoặc chuyển hóa thức ăn để tạo ra năng lượng Bản thân các gốc tự do góp phần vào quá trình lão hóa của cơ thể Tuy nhiên, nếu số lượng gốc tự do quá nhiều có thể gây tổn thương các tế bào lành Đây là nguyên nhân chính dẫn đến một số bệnh như ung thư,

xơ cứng động mạch, làm suy yếu hệ thống miễn dịch gây dễ bị nhiễm trùng, làm giảm trí tuệ, teo cơ quan bộ phận người cao niên [7]

Curcumin là hợp chất tự nhiên có khả năng kháng oxy hóa Curcumin có khả năng ngăn cản sự tạo thành gốc tự do như superoxide, hydroxyl Ngăn cản sự peroxide hóa các lipid trong cơ thể nhờ vào nhóm OH trên vòng bezene [8] Tinh dầu và curcumin tách từ củ nghệ vàng thể hiện hoạt tính quét gốc tự do DPPH cao Tinh dầu nghệ thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa mạnh hơn so với curcumin ở cả hai thử nghiệm kháng oxy hóa DPPH và MDA [9]

1.1.2.2 Hoạt tính kháng viêm, kháng virus, vi khuẩn và kháng nấm

Viêm nhiễm là một chuỗi phản ứng của cơ thể nhằm chống lại tổn thương mô Phản ứng này cần thiết cho quá trình lành viết thương, nhưng đồng thời làm đau, nổi mẫn đỏ

và phồng viết thương Trong quá trình viêm nhiễm, cơ thể sinh ra arachidonic acid Enzyme cylooxygenase chuyển hóa arachidonic acid thành các chất gây viêm Liên kết đôi ở C3,4 và C3’,4’ và nhóm OH ở C8,8’ (Hình 1.2) trên vòng benzene của curcumin

có khả năng ức chế enzyme cylooxygenase, từ đó giảm quá trình chuyển hóa arachidonic acid [10] Curcumin còn có khả năng ức chế virus HIV [11] Ngoài ra, hỗn hợp các curcumin, DMC và BDMC còn có thể kháng giun [12]

Ngoài ra, tinh dầu nghệ vàng có khả năng kháng mạnh với các chủng vi nấm

Microsporum gypseum, Trichophyton mentagrophytes, Candida albicans [9]

1.1.3.3 Hoạt tính kháng đông máu

Sự kết tụ của các tiểu huyết cầu trong máu sẽ gây ra hiện tượng đông máu Curcumin

có khả năng ngăn cản hoạt động của enzyme cyclooxyenase tạo thêm tiểu huyết cầu, nên curcumin có tác dụng chống đông máu [13]

1.1.1.4 Hoạt tính kháng ung thư

Ung thư hiện là căn bệnh nan y và hiện chưa có thuốc chữa Yêu cầu của thuốc trị ung thư là ức chế sự phát triển và biệt hóa các tế bào ung thư nhằm chặn đứng sự phát triển

và di căn của ung thư Tuy nhiên nhược điểm chung của đại đa số các thuốc trị ung thư hiện nay là không có sự chọn lọc cao, dễ kháng thuốc và hệ số an toàn giảm dần theo thời gian sử dụng, ngoài ra chúng có thể gây độc cho các tế bào lành và gây ra các tác

dụng phụ như rụng tóc, buồn nôn,… Vì vậy việc tìm ra một hoạt chất có tác dụng chống ung thư nguồn gốc từ tự nhiên và tăng hoạt tính của các hoạt chất đó đang là vấn đề được quan tâm hàng đầu

Curcumin là chất ức chế tế bào ung thư theo cơ chế tự ức chế từng phần các tế bào ác tính [14] Curcumin có tác dụng ức chế tế bào ung thư ở cả ba giai đoạn khởi phát, tiến triển và giai đoạn cuối Kết quả là các tế bào ung thư bị vô hiệu hóa nhưng không gây ảnh hưởng đến tế bào lành tính, đồng thời ngăn ngừa sự hình thành tế bào ung thư mới

Curcumin có khả năng ức chế sự tạo khối u, tác động đến hầu hết các giai đoạn của quá trình hình thành và phát triển khối u [13]

Trong giai đoạn đầu của bệnh, các tế bào bình thường bị tác động bởi các gốc tự do và

bị biến đổi thành các tế bào ung thư Curcumin có thể ngăn chặn quá trình này bằng cách bắt giữ các gốc oxy hóa khác nhau như gốc hydroxyl HO, gốc peroxyl ROO+, singlet oxygen [15] Curcumin có khả năng bảo vệ lipid, hemoglobin và AND khỏi quá trình oxy hóa Curcumin tinh khiết có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh hơn DMC và BDMC Curcumin được chứng minh có khả năng chống di căn đối với một vài loại tế bào ung thư đồng thời ức chế sự phát triển của tế bào ung thư Khả năng làm giảm quá trình di căn này còn phụ thuộc vào nguồn gốc và loại khối u ác tính [13]

Nhóm methoxy (-OCH3) được xác định có vai trò quan trọng trong cơ chế trung hòa gốc tự do DPPH của curcumin Curcuminoid và các dẫn xuất thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư tuyến tiền liệt PC3 mạnh Trong đó, các dẫn xuất pyrazole thể hiện hoạt tính cao hơn so với curcumin, nổi bật là dẫn xuất methyl pyrazole-curcumincarboxylate có hoạt tính gấp 38 lần curcumin [9]

1.1.3 Pharmacophore của curcumin

Curcumin là một diarylheptanoid với hai nhóm p-OH và m-OCH3 liên kết với một

β-diketone bởi hai liên kết olefin đối xứng Các liên kết đôi olefin được xem là cầu nối giữa vòng thơm và nhóm diketone và thường không được thay đổi khi thiết kế các dẫn xuất curcumin Thay vào đó, nhóm diketone, vòng thơm và các nhóm thế là mục tiêu chính trong thiết kế các dẫn xuất Vì thế, các nhóm thế đã được thay đổi trên cấu trúc

curcumin, bao gồm các dẫn xuất có vòng 1,2 – azole để tạo thành dẫn xuất mới [16]

Khi loại bỏ nhóm p-OH hoặc thêm vào nhóm m-OCH3 dẫn đến hoạt tính chống tăng sinh tế bào giảm nhẹ [17] Nếu thay đổi vị trí của nhóm p – phenolic và m – methoxy

cho nhau thì hoạt tính chống tăng sinh tế bào bị mất đi [17]

Mối quan hệ giữa hoạt tính và cấu trúc hóa học của curcumin được thiết lập bằng cách

so sánh hoạt tính sinh học của curcumin với các dẫn xuất của curcumin (Bảng 1.2)

Bảng 1.2 Cấu trúc hóa học của curcumin và dẫn xuất

lấy gốc tự do của curcumin có liên quan đến số lượng nhóm thế m-OCH3 và mức độ

hydro hóa của nhánh heptadiene trong cấu trúc của curcumin [19, 20] Glycosyl hóa

vòng thơm làm cho curcumin tan trong nước với sự ổn định động học cao và chỉ số điều trị tốt [21]

1.1.4 Các dẫn xuất isoxazole và pyrazole của curcumin

Trong nhiều năm qua, số lượng lớn các dẫn xuất curcumin đã được tổng hợp bởi các nhà nghiên cứu trên thế giới Các dẫn xuất mới này có khả năng ức chế gốc tự do [22], gây độc tế bào, kháng viêm và các hoạt tính khác [23-25] Một số dẫn xuất còn có hoạt tính chống ung thư [26], chất kích hoạt NF – κB [27], thuốc siêu vi [28],…

Curcumin và 9 dẫn xuất curcumin (Hình 1.4) được tổng hợp để khảo sát hoạt tính Hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất trên được đánh giá bằng thử nghiệm sulforhodamine B chống lại năm dòng tế bào ung thư ở người: U – 251 MG, PC – 3 (tuyến tiệt liệt ở người), HTC – 15 (đại trực tràng ở người), K562 (bệnh bạch cầu tủy xương mãn tính ở người và SKLU – 1 (ung thư phổi) Các dẫn xuất được thử nghiệm, sàng lọc ở nồng độ 50 µM [29]

Hình 1.4 Cấu trúc curcumin và các dẫn xuất isoxazole và pyrazole curcumin

được tổng hợp

Theo kết quả này, methyl hóa nhóm hydroxy ở vòng thơm làm tăng khả năng gây độc

tế bào (trên 90% tế bào bị ức chế) Sự hiện diện nhóm methoxy và nhóm N, N –

dimethylamine làm giảm hoạt tính của chúng Để khảo sát tác dụng của việc thay thế nhóm β-diketone bằng vòng 1,2-azole, các dẫn xuất isoxazole và pyrazole đã được

tổng hợp [30] Kết quả cho thấy rằng các dẫn xuất này tăng hoạt tính của dẫn xuất so với curcumin Các kết quả tương tự về hoạt tính các dẫn xuất của curcumin chống lại các dòng ung thư khác nhau cũng được công bố trong các tài liệu tham khảo [16, 31] Điều đáng chú ý, khi nhóm liên kết olefin được hydro hóa thì hoạt tính các dẫn xuất giảm so với curcumin [30]

Hoạt tính kháng oxy hóa của curcumin và các dẫn xuất isoxazole, pyrazole curcumin

còn được đánh giá khả năng kháng oxy hóa bằng thử nghiệm in vitro Kết quả cho

thấy, tất cả các hợp chất có hoạt tính kháng oxy hóa đầy hứa hẹn Trong đó, dẫn xuất pyrazole được đánh giá có hoạt tính tốt hơn curcumin do có sự hiện diện của vòng pyrazole [32]

Isoxazole và pyrazole curcumin có tác dụng ức chế COX-2 tốt hơn curcumin Ngoài

thử nghiệm in vitro, curcumin và các dẫn xuất isoxazole, pyrazole curcumin còn được đánh giá hoạt tính kháng viêm in vivo bằng cách thử nghiệm phù chân chuột Kết quả

cho thấy, pyrazole cho hoạt tính cao nhất [32] Bên cạnh đó, khi nhóm chức isoxazole được thay thế bởi pyrazole, hoạt tính của dẫn xuất này tăng lên đáng kể, chứng tỏ sự hiện diện của nhóm –NH trong dẫn xuất pyrazole đóng vai trò quan trọng lên hoạt tính kháng viêm [33]

1.2 Tình hình nghiên cứu về các dẫn xuất curcumin

1.2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Curcumin và các dẫn xuất curcumin đã và đang trở thành mục tiêu nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới trong lĩnh vực thiết kế, tổng hợp các chất kháng ung thư, kháng oxy hóa, …

Nhóm tác giả W.F Chen, S.L Deng, B Zhou, … đã nghiên cứu về khả năng kháng oxy hóa của curcumin và các dẫn xuất của nó chống lại sự peroxid hóa gốc tự do của lipoprotein (LDL) [34] Sự peroxy hóa được bắt đầu bằng một chất khởi đầu hòa tan trong nước 2,2′-azobis (2-amidinopropane hydrochloride) (AAPH) hoặc ion cupric (Cu2+) Quá trình oxy hóa lipoprotein của curcumin và các dẫn xuất curcumin nhưng không có nhóm phenolic:1,7-bis(3,4-dimethoxyphenyl)-1,6-heptadiene 3,5-dione (1), 1,7-bis(4-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione (2) và 1,7- diphenyl-1,6-heptadiene-3,5-dione (3) được theo dõi thông qua động lực học của quá trình Kết quả

cho thấy, hoạt tính kháng oxy hoá của các chất (1), (2), (3) đều yếu hơn các dẫn xuất curcumin nhiều lần Do đó, nhóm nghiên cứu cho rằng nhóm phenolic đóng vai trò quan trọng tạo nên hoạt tính của các dẫn xuất curcuminoid

Shim và công sự đã tổng hợp thành công các dẫn xuất hydrazinocurcuminoids Trong

đó, dẫn xuất hydrazinocurcumin được xem là một chất tiềm năng ức chế sự tăng sinh

tế bào nội mô ở động mạch chủ ở dạng nano, không gây độc tế bào Nghiên cứu này cho thấy đây có thể là một tác nhân chống ung thư hứa hẹn [35]

Flynn và cộng sự đã tổng hợp các dẫn xuất curcumin So sánh hoạt tính kháng oxy hóa

5 – lipoxygenase (5-LO) trên tế bào đa nhân của người, dẫn xuất B có hoạt tính ức chế giảm 8 lần so với curcumin Pyrazole curcumin (A) là một chất ức chế tiềm năng đối với 5 – LO Trong khi đó, dẫn xuất C được báo cáo rằng có hoạt tính giảm 53 lần so với pyrazole curcumin Điều này chỉ ra rằng, sự hiện diện của hệ liên hợp trên mạch carbon làm tăng hoạt tính của các dẫn chất [35, 36]

Ohtsu và cộng sự cũng đã tổng hợp hàng loạt dẫn xuất curcumin, trong đó có 5 dẫn xuất (Hình 1.5) cho thấy hoạt tính kháng ung thư tốt hơn so với hydroxyflutamide hiện

có sẵn để điều trị ung thư tuyến tiền liệt và các hợp chất này có thể được phát triển hơn nữa để kiểm soát ung thư tuyến tiền liệt Các nghiên cứu SAR chỉ ra rằng bis(3,4-dihydroxy phenyl), hệ β-diketone liên hợp và tính đối xứng của nội phân tử của các phân tử dẫn xuất là các yếu tố quan trọng liên quan đến hoạt tính chống oxy hóa Ngoài ra, sự hiện diện của β-diketone và nhóm cho hydrogen rất quan trọng đối với hoạt tính kháng ung thư [35, 37, 38]

Hình 1.5 Các dẫn xuất curcumin do Ohtsu và cộng sự tổng hợp

Vankatessan và cộng sự đã sử dụng ba mô hình để nghiên cứu tầm quan trọng của các nhóm hydroxy phenolic cũng như các nhóm thế khác trên 2 vòng benzene của dẫn xuất curcumin đến hoạt tính kháng oxy hóa Kết quả cho thấy rằng, dẫn xuất curcumin với nhóm phenolic có hoạt tính mạnh hơn các dẫn xuất không chứa nhóm phenolic Vì vậy, nhóm thế phenolic trên vòng benzene có đóng góp quan trọng đối với hoạt tính kháng oxy hóa của các dẫn xuất curcumin [35, 39]

1.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, trong những năm gần đây cũng đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về curcumin và các dẫn xuất curcumin

Theo nghiên cứu của Phan Thị Hoàng Anh [9], “Nghiên cứu quy trình tách chiết, tổng hợp dẫn xuất và xác định tính chất, hoạt tính của tinh dầu và curcumin từ cây nghệ

vàng (Curcuma longa L) Bình Dương”, 30 dẫn xuất curcuminoid đã được tổng hợp

(có 10 dẫn xuất hoàn toàn mới), bao gồm 22 dẫn xuất của curcumin, 01 dẫn xuất của demethoxycurcumin và 07 dẫn xuất của bisdemethoxycurcumin Trong đó, các dẫn xuất từ phenylpyrazole curcuminoid chiếm phần lớn Các dẫn xuất này được thiết kế

và tổng hợp bằng cách thay đổi các nhóm thế trên vòng benzene của nhóm phenylpyrazole bởi các nhóm mang hoạt tính (-NO2, -F, -Cl, -Br, …) tại các vị trí

ortho, meta và para Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học cho thấy, các dẫn xuất đều có

hoạt tính kháng oxy hóa, kháng ung thư, nổi bật là các dẫn xuất isoxazole, pyrazole curcumin thể hiện hoạt tính gây độc cao hơn curcumin, dẫn xuất methyl

pyrazolecurcumincarboxylate có hoạt tính mạnh trong thử nghiệm gây độc tế bào ung thư tuyến tiền liệt PC3 cao gấp 38 lần curcumin, rất có tiềm năng trong sản xuất thuốc chữa ung thư tuyến tiền liệt

Đặng Thị Mỹ Lệ và Đỗ Thị Xuân Vui đã thực hiện đề tài “Điều chế và khảo sát hoạt tính sinh học của các dẫn xuất 2-hydrazinobenzothiazolcurcumin và 2,4-diflourophenylhydrazinocurcumin từ curcumin” [40] Kết quả cho thấy, 2-hydrazinobenzothiazolcurcumin (HBTC) và 2,4-diflourophenylhydrazinocurcumin (DFPHC) đều thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa ở hai thử nghiệm DPPH và MDA DFPHC còn thể hiện hoạt tính kháng ung thư đối với dòng tế bào Hep – G2 HBTC và

DFPHC đều có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm đối với các chủng Salmonella typhi

(-), Shigella dysenteriae (-), Candida albicans

Nghiên cứu của tác giả Lê Xuân Tiến (2009), “Nghiên cứu tổng hợp hydrazinocurcumin và isoxazolecurcumin - Khảo sát hoạt tính sinh học của chúng” đã công bố rằng hydrazinocurcumin và isoxazolecurcumin có hoạt tính kháng oxy hóa tương tự như curcumin [41] Ngoài ra, hydrazinocurcumin và isoxazole còn có khả năng gây độc tế bào đối với dòng tế bào ung thư Hep – G2, trong đó, hydrazinocurcumin có hoạt tính cao gấp 02 lần curcumin

Tác giả Cao Thị Kim Anh và Lưu Thị Ngọc Vĩnh đã tổng hợp thành công dẫn xuất 3,5-diflourophenylhydrazinocurcumin và 4-flourophenylhydrazinocurcumin và khảo sát hoạt tính của chúng Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học cho thấy, cả 02 dẫn xuất đều có hoạt tính kháng ung thư trên dòng tế bào Hep-G2, LU và RD So sánh hoạt tính kháng oxy hóa với curcumin, 4-flourophenylhydrazinocurcumin thể hiện hoạt tính mạnh hơn curcumin nhưng 3,5-diflourophenylhydrazinocurcumin lại có hoạt tính yếu hơn [42]

1.3 Giới thiệu về phương pháp docking

Số lượng protein với cấu trúc ba chiều được biết đến ngày càng tăng và được công bố rộng rãi trên ngân hàng protein (Protein Data Bank - PDB) [43, 44] Sự gia tăng này là

do sự phát triển của các kỹ thuật xác định cấu trúc, nổi bật là kỹ thuật X-ray [45] Sau khi cấu túc protein và phối tử (ligand) đồng kết tinh được công bố, cùng với sự hỗ trợ hiệu quả của máy tính thì hàng loạt các thuốc đã được thiết kế dựa trên cấu trúc của

hợp chất dẫn đầu Việc thiết kế thuốc mới dựa trên kết quả của phương pháp docking phân tử Các phân tử thuốc được “gắn” vào khoang gắn kết của protein, từ đó năng lượng gắn kết của các cấu dạng của từng phân tử thuốc được tính toán Kết quả từ phương pháp docking phân tử sẽ định hướng cho việc thiết kế các thuốc mới có năng lượng gắn kết tốt nhất với protein, nghĩa là có hoạt tính tốt hơn [46]

Trong mô hình docking phân tử, tương tác giữa phối tử và mục tiêu tác động (protein, enzyme) là các tương tác van der Waals, tương tác tĩnh điện, liên kết hydrogen, tương tác ưa nước, kỵ nước… Trong kỹ thuật docking phân tử, mục tiêu tác động thường đưa vào dưới dạng cấu trúc cứng, trong khi phối tử có thể chuyển động tương đối và thay đổi cấu hình để phù hợp với các khoang gắn kết của mục tiêu tác động

Docking phân tử là kỹ thuật mô hình hóa nhằm dự đoán vị trí và cấu hình tối ưu nhất

mà phối tử có thể gắn kết trên mục tiêu Docking phân tử có vai trò quan trọng trong việc dự đoán ái lực và hoạt tính của các hoạt chất đối với protein, enzyme, từ đó có thể

dự đoán khả năng hoạt hóa hoặc ức chế mục tiêu Ngoài ra, docking phân tử còn giúp

dự đoán được tâm hoạt động, vị trí và cấu hình tối ưu của phối tử tham gia phản ứng khi xem xét cơ chế xúc tác của enzyme Từ đó giúp thiết kế các thuốc mới có hoạt tính tốt hơn phục vụ trong y dược

1.4 Receptor – Cyclin dependent kinase 2 (CDK2)

Cyclin-dependent kinases (CDKs) là một họ protein kinases tham gia vào quá trình điều tiết chu kỳ của tế bào CDKs là các protein tương đối nhỏ, có trọng lượng phân tử

từ 34 đến 40 kDa [47, 48] Thông thường, một CDK sẽ liên kết với một protein điều tiết là Cyclin, nếu không có Cyclin thì CDK gần như bất hoạt Tuy nhiên, khi tạo thành phức Cyclin-CDK thì trở nên hoạt hóa Phức chất này sẽ xúc tác cho quá trình phosphate hóa các protein từ Adenosine triphosphate (ATP) Hầu hết các phức Cyclin-CDK điều tiết chu kỳ sống của tế bào Tế bào động vật có ít nhất 09 loại protein CDK (CDK1-9), trong đó CDK1-4 tham gia trực tiếp vào quá trình điều tiết chu kỳ sống của

tế bào Vì vậy, các CDK liên quan trực tiếp đến các bệnh ung thư

CDK2 (Hình 1.6) là một protein ở người được mã hóa bởi gen CDK2

Hình 1.6 Cấu trúc của protein CDK2

Cấu trúc tinh thể của CDK2 được tìm kiếm và tải về từ ngân hàng dữ liệu protein (PDB – Protein Data Bank) Có nhiều cấu trúc tinh thể kết tinh của CDK2 được tìm thấy Protein được lựa chọn phải có độ phân giải cao và ligand đồng kết tinh với protein là chất có hoạt tính ức chế CDK2 mạnh Ngoài ra, mục tiêu tác động phải có khoang gắn kết đủ lớn thực hiện docking phân tử các dẫn xuất isoxazole và pyrazole curcumin Vì thế, tinh thể đồng kết tinh của CDK2 với 5-(2-fluorophenyl)-N-(pyridin-4-ylmethyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-amine (SCF) có độ phân giải 1.28 Å (PDB-2R3I), IC50 = 1000 nM được chọn làm đích tác động trong nghiên cứu này Tương tác giữa SCF với amino acid của protein được thể hiện trong Hình 1.7

Hình 1.7 Tương tác giữa SCF với protein CDK2 (ID: 2R3I)

1.5 Docking phân tử các dẫn xuất curcumin đối với 2R3I

Curcumin tương tác với các mục tiêu khác nhau trong quá trình phát triển của tế bào ung thư, trong đó có cả protein kinases [49] Curcumin ức chế hoạt động của protein kinase C bằng cách hình thành liên kết hydrogen với Leu251 và Gln257 Ngoài ra, curcumin còn tương tác tốt với glycogen synthase kinase – 3b thông qua các liên kết với Val135, Ile62 và Arg141 [50] Curcumin còn được xem là chất ức chế không cạnh tranh của photphorylase kinase [49]

CDK1-4 đóng vai trò quan trọng trong điều tiết chu kỳ tế bào, bất kỳ sự bất thường nào trong hoạt động của các CDK đều có khả năng dẫn đến sự phát triển thành tế bào ung thư Phương pháp docking phân tử được sử dụng để nghiên cứu và mô phỏng các tương tác của curcumin với CDK, từ đó hình thành ý tưởng thiết kế các dẫn xuất mới

từ curcumin để tạo ra các tương tác tốt hơn với CDK

CDK2 đã được chọn làm mục tiêu docking với curcumin [51] Kết quả docking cho thấy rằng, curcumin không tương tác tốt với CDK2 tại các vị trí liên kết của ATP [49]

Từ kết quả này, có thể nhận xét rằng curcumin không trực tiếp ức chế tế bào ung thư qua tương tác với CDK2 mà thông qua cơ chế khác Vì thế, cần phải thiết kế các dẫn xuất curcumin mới mang các nhóm thế tương tác với CDK2 tốt hơn

1.6 Điểm mới và tính cấp thiết của đề tài

Các nghiên cứu trước đây ở Việt Nam chủ yếu tập trung vào curcumin được phân lập

từ tinh bột nghệ, làm cơ sở cho việc tổng hợp các dẫn xuất khác từ curcumin Đây là phương pháp kém hiệu quả vì tốn kém chi phí và thời gian phân lập Điểm mới của phương pháp được sử dụng trong đề tài luận văn là tổng hợp toàn phần dẫn xuất

curcumin từ chất nền p-methoxybenzaldehyde cho hiệu suất cao và tiết kiệm thời gian

Các dẫn xuất curcumin như isoxazole, pyrazole curcumin,… có khả năng kháng oxy hóa, kháng viêm,… đặc biệt là khả năng kháng ung thư trên nhiều dòng tế bào Kết quả docking phân tử sẽ định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo trong thiết kế các dẫn xuất mới có hoạt tính tối ưu hơn Nếu được nghiên cứu sâu hơn, các dẫn xuất curcumin có thể ứng dụng thiết kế thuốc chữa và phòng các bệnh ung thư

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của khóa luận là các phản ứng tổng hợp dẫn xuất curcumin từ

chất nền p-methoxybenzaldehyde với acetyl acetone, các phản ứng đóng vòng

isoxazole, pyrazole từ nhóm 1,3 dicarbonyl và docking phân tử các dẫn xuất đối với Cyclin – dependent kinase 2 (CDK2)

2.2 Nguyên liệu, trang thiết bị thí nghiệm

2.2.1 Nguyên liệu

2.2.1.1 Nguyên liệu dùng trong tổng hợp

Các hóa chất dùng trong tổng hợp được cho trong Bảng 2.1:

Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng trong quy trình tổng hợp các dẫn xuất curcumin

từ chất nền p-methoxybenzaldehyde

1 p-methoxybenzaldehyde 98% Acros Organics

3 Hydroxylamine hydrochloride 99% Acros Organics

6 n-Butylamine 99,5% Acros Organics

*Tổng hợp tại phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ, Khoa CN Hóa học và Thực phẩm,

ĐH Sư phạm Kỹ thuật Tp Hồ Chí Minh

2.2.1.2 Nguyên liệu dùng trong kiểm nghiệm

- Bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck, Đức)

- Dung môi giải ly: n – hexane, ethyl acetate, acetone

2.2.2 Dụng cụ và trang thiết bị

2.2.2.1 Dụng cụ và trang thiết bị dùng trong tổng hợp

- Các dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn (250 mL, 100 mL), erlen, beaker, pipet, micropipet, ống đong, phễu chiết

- Máy khuấy từ gia nhiệt, cá từ

- Hệ thống sinh hàn

- Hệ thống cô quay chân không

- Cân phân tích

2.2.2.2 Dụng cụ và trang thiết bị dùng trong kiểm nghiệm

- Bình giải ly, ống vi quản

- Máy soi đèn UV

- Máy đo điểm nóng chảy M5000 (Trường Đại học Lạc Hồng)

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân – NMR (Bruker), máy đo phổ khối lượng –

MS (Agilent Technologies) (Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Tổng hợp

2.3.1.1 Tổng hợp tri-n-butyl borate

Cho 62,0 g acid boric (H3BO3, 1,0 mol) và 450,0 g n-butanol (6,0 mol, 555,0 mL) vào bình cầu một cổ 1,0 L, lắp hệ thống chưng cất và tiến hành gia nhiệt Sau khi thu được

250,0 mL sản phẩm chưng cất, thêm 200,0 g n-butanol (247,0 mL) vào bình cầu và

tiếp tục gia nhiệt đến khi nhiệt độ tăng vọt từ 117,0 oC đến 150,0 oC Tiếp tục đun đến khi nhiệt độ đạt 220,0 oC thì dừng Để nguội bình cầu, cho sản phẩm vào chai 250,0

mL Duran, đậy kín nắp để sử dụng cho phản ứng tổng hợp chất QT01

2.3.1.2.Tổng hợp one (QT01)

(1E,4Z,6E)-5-hydroxy-1,7-bis(4-methoxyphenyl)hepta-1,4,6-trien-3-Dẫn xuất curcumin có thể được tổng hợp từ nhiều chất nền khác nhau Trong khuôn

khổ luận văn này, tôi chọn p-methoxybenzaldehyde làm chất nền, cho phản ứng với acetyl acetone để tổng hợp (1E,4Z,6E)-5-hydroxy-1,7-bis(4-methoxyphenyl)hepta -

1,4,6-trien-3-one

Tiến hành phản ứng: Quy trình phản ứng được thực hiện theo quy trình đã được xuất

bản trong tài liệu [52] Trong bình cầu 250 mL, cho vào 1,03 mL acetyl acetone (10,0

mmol), 0,35 g boric oxide (10,0 mmol), 50,0 mL ethyl acetate, 2,44 mL p – methoxybenzaldehyde (20,0 mmol) và 10,8 mL tri-n-butylborate Lắp ráp hệ thống

như Hình 2.1, khuấy từ đến 80 oC và gia nhiệt trong vòng 30 phút

Hình 2 1 Hệ thống phản ứng tổng hợp

(1E,4Z,6E)-5-hydroxy-1,7-bis(4-methoxyphenyl)hepta -1,4,6-trien-3-one

Sau 30 phút, nhỏ từ từ 0,4 mL n-butylamine (40% mole so với acetyl acetone, hòa tan

trong 5,0 mL ethyl acetate) vào bình cầu bằng kim tiêm trong 30 phút, tiếp tục khuấy

từ gia nhiệt ở 80 oC Theo dõi tiến trình phản ứng bằng TLC Kết quả TLC cho thấy sau 4 giờ, phản ứng đạt cân bằng Sau đó, thêm 25,0 mL HCl 1,0 M vào hỗn hợp phản ứng, khuấy từ tại 80 oC trong 60 phút, kết thúc phản ứng

Chiết: Hỗn hợp phản ứng được làm nguội, thêm dung dịch NaHCO3 (30,0 mL) bão hòa và chiết bằng ethyl acetate (315,0 mL) Gom dịch chiết ethyl acetate vào erlen Làm khan nước bằng Na2SO4 Tiến hành lọc loại bỏ muối, thu dung dịch sản phẩm Sử dụng máy cô quay chân không để loại dung môi thu sản phẩm thô

Chuẩn bị dung môi giải ly cột và mẫu cho quá trình sắc ký cột: Dung môi giải ly đầu

tiên được chọn là dung cho Rf của chất cần tinh sạch là 0,15 trên bản mỏng Mẫu cần sắc ký được chuẩn bị bằng cách hòa tan trong một lượng tối thiểu acetone và trộn chung với silica gel Cho 4,0 g silica gel và 5,0 mL acetone vào sản phẩm thô (2,96 g) trong bình cầu 100 mL Tiến hành cô quay để thu được bột khô sản phẩm thô và silica

gel

Chạy cột sắc ký và tinh sạch: Tỷ lệ silica gel so với mẫu là 50:1 về khối lượng Silica

gel được tạo hỗn hợp huyền phù với dung môi được chọn làm dung môi giải ly cột đầu tiên Đường kính cột sắc ký được chọn sao cho tỷ lệ chiều cao silica gel và đường kính cột là 7:1 Đặt một lớp bông gòn dưới đáy cột để ngăn silica gel rơi xuống Thêm dung môi giải ly vào cột, chiều cao dung môi khoảng 1,0 cm Rót hỗn hợp huyền phù silica gel vào cột, dùng bóp cao su để silica gel được đồng đều trong cột Thêm đầy dung môi vào cột, cân bằng cột bằng cách dùng bóp cao su đẩy dung môi ra khỏi cột 3 lần (không để khô dung môi trong cột) Nạp mẫu bột khô sản phẩm vào cột chứa silica

gel Tiến hành giải ly bằng (hệ) dung môi n-hexane:ethyl acetate có độ phân cực tăng

dần Dung dịch giải ly được hứng trong các hủ bi, tùy theo khoảng cách giữa các vết trên bản mỏng mà hứng lượng nhiều ít khác nhau Độ tinh sạch của dịch giải ly được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng Dịch giải ly trong các hủ bi được chấm và giải ly Những hủ bi nào có kết quả giống nhau trong bản mỏng sau khi hiện hình bằng UV thì gom chung lại với nhau Phân đoạn chứa chất quan tâm được cô quay đuổi dung môi

để tiến hành các thí nghiệm hoặc tinh sạch tiếp nếu cần

2.3.1.3 Tổng hợp 3,5-bis((E)-4-methoxystyryl)isoxazole (QT02)

3,5-bis((E)-4-methoxystyryl)isoxazole được tổng hợp từ phản ứng giữa

(1E,4Z,6E)-5-hydroxy-1,7-bis(4-methoxyphenyl)hepta -1,4,6-trien-3-one và hydroxylamine Acetic acid được sử dụng làm dung môi phản ứng và xúc tác

Tiến hành phản ứng: Quy trình được thực hiện theo quy trình đã được xuất bản trong

tài liệu [30] Hòa tan 200,0 mg (0,595 mmol) hợp chất QT01 bằng 10,0 mL acetic acid

trong bình cầu 100 mL Lắp đặt hệ thống phản ứng như Hình 2.1 Gia nhiệt kết hợp khuấy từ ở 80 oC trong 30 phút Sau đó, cho 82,74 mg hydroxylamine hydrochlodride (NH2OH.HCl) vào bình cầu Theo dõi phản ứng bằng TLC Kết quả TLC cho thấy phản ứng kết thúc sau 9h

Chiết: Hỗn hợp phản ứng được làm nguội, trung hòa bằng dung dịch NaHCO3 bão hòa (50,0 mL) và chiết bằng dichloromethane (3x15,0 mL) Gom các dịch chiết dichloromethane vào bình erlen, làm khan nước bằng Na2SO4 Hỗn hợp được lọc qua phễu lọc Buchner thu dung dịch dichloromethane Đuổi dung môi dưới áp suất thấp bằng máy cô quay chân không thu được chất rắn thô

Tinh chế: Sản phẩm thô được tinh chế bằng phương pháp sắc ký cột với hệ dung môi

có độ phân cực tăng dần từ 100% n-hexane đến n-hexane:ethyl acetate (95:5 v/v)

2.3.1.4 Tổng hợp 3,5-bis((E)-4-methoxystyryl)-4H-pyrazole (QT03)

3,5-bis((E)-4-methoxystyryl)-4H-pyrazole được tổng hợp từ phản ứng giữa

(1E,4Z,6E)-5-hydroxy-1,7-bis(4-methoxyphenyl)hepta -1,4,6-trien-3-one và hydrazine

hydrate Acetic acid được sử dụng làm dung môi phản ứng và xúc tác

Tiến hành phản ứng: Quy trình được thực hiện theo quy trình đã được xuất bản trong

tài liệu [30] Hòa tan 200,0 mg (0,595 mmol) hợp chất QT01 bằng 10,0 mL acetic acid trong bình cầu 100 mL Gia nhiệt kết hợp khuấy từ ở 80 oC trong 30 phút Sau đó, cho 58,0 µL hydrazinehydrate (N2H4.H2O) vào bình cầu Theo dõi phản ứng bằng TLC Kết quả TLC cho thấy phản ứng kết thúc sau 6h

Chiết: Hỗn hợp phản ứng được làm nguội, trung hòa bằng dung dịch NaHCO3 bão hòa (50,0 mL) và chiết bằng dichloromethane (3x15,0 mL) Gom các dịch chiết dichloromethane vào bình erlen, làm khan nước bằng Na2SO4 Hỗn hợp được lọc qua phễu lọc Buchner thu dung dịch dichloromethane Đuổi dung môi dưới áp suất thấp

bằng máy cô quay chân không thu được chất rắn thô

Tinh chế: Sản phẩm thô được tinh chế bằng phương pháp sắc ký cột với hệ dung môi

có độ phân cực tăng dần từ 100% n-hexane đến n-hexane:ethyl acetate (8:2 v/v)

2.3.1.5 Tổng hợp 3,5-bis((E)-4-methoxystyryl)-1-phenyl-1H-pyrazole (QT04)

3,5-bis((E)-4-methoxystyryl)-1-phenyl-1H-pyrazole được tổng hợp từ phản ứng giữa

(1E,4Z,6E) -5 - hydroxy - 1,7 - bis (4 - methoxyphenyl) hepta -1,4,6- trien - 3 - one và

phenylhydrazine hydrocloride Acetic acid được sử dụng làm dung môi phản ứng và xúc tác

Tiến hành phản ứng: Quy trình được thực hiện theo quy trình đã được xuất bản trong

tài liệu [30] Hòa tan 200,0 mg (0,595 mmol) hợp chất QT01 bằng 10,0 mL acetic acid trong bình cầu 100 mL Gia nhiệt kết hợp khuấy từ ở 80 oC trong 30 phút Sau đó, cho 173,0 mg phenylhydrazine hydrochloride (C6H5-NH-NH2.HCl) vào bình cầu Theo dõi phản ứng bằng TLC Kết quả TLC cho thấy phản ứng kết thúc sau 6h

Chiết: Hỗn hợp phản ứng được làm nguội, trung hòa bằng dung dịch NaHCO3 bão hòa (50,0 mL) và chiết bằng dichloromethane (3x15,0 mL) Gom các dịch chiết dichloromethane vào bình erlen, làm khan nước bằng Na2SO4 Hỗn hợp được lọc qua phễu lọc Buchner thu dung dịch dichloromethane Đuổi dung môi dưới áp suất thấp bằng máy cô quay chân không thu được chất rắn thô

Tinh chế: Sản phẩm thô được tinh chế bằng phương pháp sắc ký cột với hệ dung môi

có độ phân cực tăng dần từ 100% n-hexane đến n-hexane:ethyl acetate (95:5 v/v)

2.3.2 Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc hóa học

2.3.2.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Phương pháp sắc ký lớp mỏng được sử dụng để kiểm tra sơ bộ độ tinh khiết của sản phẩm Trong đó, pha tĩnh silica gel 60 F254 (Merck) được tráng lên tấm nhôm kích thước 20x20 cm, pha động là dung môi hoặc hệ dung môi

Chuẩn bị mẫu thử: mẫu thử được hòa tan trong dung môi thích hợp (thường là

acetone), có nồng độ khoảng 2 mg/mL Mẫu thử được chấm trên bản mỏng cùng với tác chất

Dung môi giải ly: Chọn dung môi (hệ dung môi) giải ly thích hợp, sao cho giá trị R f

của vết sản phẩm dao động từ 0,1 đến 0,9 khi giải ly với 3 hệ dung môi có độ phân cực tăng dần Một hệ cho Rf  0,2, một hệ cho Rf  0,5 và một hệ cho Rf  0,8 Mẫu thử được xem là tinh khiết nếu không có vết lạ xuất hiện trên bản mỏng sau khi giải ly với

03 hệ dung môi đã chọn Các hệ dung môi có độ phân cực khác nhau được điều chế từ

n-hexane và ethyl acetate Một số hệ dung môi được sử dụng trong luận văn:

 Hệ dung môi A: n-hexane:ethyl acetate (9:1 v/v)

 Hệ dung môi B: n-hexane:ethyl acetate (8:2 v/v)

 Hệ dung môi C: n-hexane:ethyl acetate (7:3 v/v)

 Hệ dung môi D: n-hexane:ethyl acetate (6:4 v/v)

 Hệ dung môi E: n-hexane:ethyl acetate (5:5 v/v)

Giá trị Rf được tính toán như sau: Rf = 𝑥

Phát hiện vết: Vết sản phẩm sau khi giải ly được soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng

254 nm và 365 nm Nếu vết sản phẩm không bắt màu UV thì có thể quan sát vết bằng cách nhúng bản mỏng vào dung dịch acid H2SO4 40% trong nước, sau đó nung nóng

2.3.2.2 Phương pháp đo điểm nóng chảy

Do sản phẩm thu được đều ở dạng rắn nên đo nhiệt độ nóng chảy là một trong những phương pháp được sử dụng để xác định độ tinh khiết của sản phẩm Nhiệt độ nóng