Chuong 11 ky thuat giai trinh tu

Nguyễn Thị Phương Thảo ,Bộ Môn CNSH Thực Vật, Khoa CNSH, ĐHNNHN 7Nguyên tắc: Nếu chúng ta biết khoảng cách của mỗi loại base từ một nguồn gốc đã biêt, thì có thể suy ra trình tự của DNA

Chương 11

Kỹ thuật xác định trình tự ADN

• Xác định trình tự ADN là việc xác định trình tự sắp xếp các nucleotides trong một đoạn DNA.

Khái niệm

Các mốc giải mã hệ gen của các sinh vật khác nhau

http://www.genomesonline.org

Genome Sequencing

http://www.genomesonline.org/

✓Maxam-Gilbert method (1977)

✓Sanger method (1977)

Các phương pháp xác định trình tự

✓Giải trình tự tự động

✓Next generation sequencing

✓Third generation sequencing

6

Nguyễn Thị Phương Thảo ,Bộ Môn CNSH Thực Vật, Khoa CNSH, ĐHNNHN 7

Nguyên tắc: Nếu chúng ta biết khoảng cách của mỗi loại base từ một

nguồn gốc đã biêt, thì có thể suy ra trình tự của DNA

Thì có thể suy ra trình tự đoạn DNA ban đầu là: GAATTCCCTCAGTC

Để có đuợc các thông tin này, có thể tạo ra một vị trí kết thúc của một đoạn DNA đang kéo dài tại một base đã biêt (A, T, C hoặc G) và ở một

vị trí đã biết trên DNA

Maxam-Gilbert Method

• Là phương pháp phân giải hóa học.

• Sử dụng hóa chất để phân hủy ADN ở các vị trí base đặc

hiệu→ tạo ra các đoạn có chiều dài khác nhau.

◼ Dimethyl sulfat methyl hóa G.

tại C.

khi bị biến đổi và cắt mạch.

Các loại hóa chất sử dụng

G Dimethylsulphate Piperidine Piperidine

C+T Hydrazine Piperidine Piperidine

C Hydrazine + alkali Piperidine Piperidine

A>C Alkali Piperidine Piperidine

Các b ướ c tiến hành

◼ Chuỗi ADN kép được đánh dấu phóng xạ với phosphorus (32P) ở đầu 5' Sử dụng Polynucleotide kinase enzyme và 32P-dATP

◼ Dùng dimethyl sulphoxide và đun nóng đến 90oC, 2 mạch của

ADN tách nhau ra và được tinh chế lại (e.g dùng điện di trên gel

và dựa trên nguyên tắc 1 mạch của ADN chắc chắn sẽ nặng hơnmạch kia bởi có chứa nhiều purine nucleotides (A and G) hơn

than pyrimidines (C and T) vốn nhẹ hơn)

• Các sợi đơn được chia thành các mẫu riêng rẽ và được sử lývới các hóa chất đặc hiệu, chỉ gây biến đổi 1 trong 4 base, xử

lý tiếp các mẫu này với piperidin để bẻ gẫy ADN tại vị trí bazơnitơ đã bị thay đổi tạo ra các đoạn oligonucleotid có chiều dàihơn kém nhau một nucleotid

• Điện di riêng rẽ 4 mẫu trên cùng 1 gel điện di, làm phim

phóng xạ tự ghi và đọc vị trí của các nucleotit lần lượt trên 4 mẫu từ cực dương của gel lên cực âm theo nguyên tắc: đoạn ADN càng ngắn càng dịch chuyển xa so với điểm xuất phát ban đầu trên bản điện di đồ

Phương pháp Maxam-Gilbert

G C T G C T A

A T

C T

G

T C

T C

T C

T C

đã bị thay đổi Maxam and Gilbert

Trình tự của sợi bổ sung

Tách các đoạn bằng điện di đồng thời sản phẩm ở 4 ống

phản ứng HIện hình qua phim X-ray Dài hơn

Ngắn hơn

Trình tự

Các băng xuất hiện trên phim tương ứng với các

đoạn bị gẫy ở các bazơ bị phá huỷ

Trình tự của sợi được giải mã

Ví dụ

Câu hỏi

Vì sao khi phá hủy G khi điện

dị không thấy đoạn CTACGTA?

Vì sao phải đánh dấu phóng xạ

ở nu đầu tiên?

Vì sao biết G là nu đầu tiên?

• Các chất hoá học dùng để cắt mạch đơn không hoàn toàn đặc

trưng cho từng phản ứng riêng biệt, phản ứng phụ sẽ diễn ra ảnhhưởng đến kết quả của sản phẩm cắt

• Đây là phương pháp xác định trình tự trực tiếp của ADN, do đó sốlượng ADN mẫu cần dùng là rất lớn, nếu lượng mẫu ban đầu ít thìcác băng điện di kết quả bằng phóng xạ tự ghi bị mờ, không rõ

Maxam, A & Gilbert, W A New Method of Sequencing DNA Proceedings of the National

Academy of Sciences, USA, 74, 560-4 (1977).

Citation Trends

Phương pháp Sanger (chain termination or dideoxy method)

Nguyên tắc hoạt động: khi

sinh tổng hợp sợi DNA, DNA

polymerase cần vị trí 3’OH

Phương pháp Sanger (chain termination or dideoxy method)

Nguyên tắc hoạt động: trình tự của một sợi

DNA đơn được xác định dựa vào hoạt động

của enzyme DNA polymerase trong quá trình

tổng hợp sợi DNA bổ xung Các sợi DNA

được tổng hợp mới này được kết thúc tại các

•DNA polymerase xúc tác gắn các Nu vào

mạch đơn đang tổng hợp ở vị trí 3'OH,

khi gặp nucleotid không có nhóm 3'OH,

phản ứng tổng hợp bị dừng lại

• Nhân tố kết thúc đặc hiệu được sử dụng là

các dideoxynucleotide (phương pháp

dideoxynucleotid)

Các yêu cầu cần thiết của phương pháp

Sanger

• Các bản sao của DNA khuôn ở dạng sợi đơn

• Một mồi thích hợp (bắt cặp với DNA khuôn)

• DNA polymerase

• 4 loại nucleotides

• Một lượng nhỏ dideoxynucleotides được đánh dấu (phóng

xạ hoặc chất nhuộm huỳnh quang)

• Chuẩn bị DNA khuôn ở dạng sợi đơn

• (thu hồi sợi đơn bằng biến tính nhiệt, hoặc xử lý với alkali)

❖ Clone DNA trong plasmid vector.

❖ Clone DNA trong bacteriophage M13 vector.

❖ Clone DNA trong phagemid.

❖ PCR có thể dùng để nhân sợi DNA đơn

• Bổ xung vào ống phản ứng đoạn mồi (tổng hợp hóa học, có thểđược đánh dấu).

• Bổ xung DNA polymerase

• 4 nucleotides: d-ATP, d-CTP, d-GTP và d-TTP

• Một lượng nhỏ các dideoxynucleotides (ddNTP) (cho vào 4 ốngphản ứng riêng rẽ)

Thành phần

• Các phân tử ddNTP có thể kết hợp ngẫu nhiên vào chuỗi ADN đang tổng hợp một cách bình thường qua nhóm 5 triphosphat nhưng lại không tiếp tục kết hợp được với phân tử desoxynucleotit triphosphat tiếp theo (dNTP)

• Kết quả sẽ cho một loạt các đoạn ADN được kết thúc một cách đặc hiệu bởi gốc dideoxynucleotides

• Tiến hành thí nghiệm tương tự cho 4 phản ứng tổng hợp ADN tách rời, mỗi phản ứng có bổ sung một loại dideoxynucleotide khác nhau

ta sẽ thu được các đoạn ADN có kết thúc bằng các

dideoxynucleotide khác nhau và hơn kém nhau 1 nucleotit

• Chạy điện di các đoạn này rồi hiện hình chúng, ta có thể xác định được trình tự chuỗi ADN

4 ống phản ứng riêng biệt

• Tính ổn định cao, có thể tiến hành với quy mô lớn

• Phản ứng không phụ thuộc vào tính đặc trưng hoá của các chấthoá học, không có phản ứng phụ

• Nếu kết hợp dùng với phản ứng PCR thì chỉ cần lượng ADN mẫu nhỏ, đồng thời có thể giảm được ảnh hưởng của ADN cấutrúc bậc 2

• Xác định được trình tự đoạn gen tương đối dài, khoảng 300 ~

400 bp

Ưu điểm của phương pháp Sanger

Vấn đề đặt ra

Có thể chạy trên 1 giếng không vì sẽ tiếtkiệm thời gian, nguyên vật liệu và hiệuquả hơn ➔ Sử dụng các ddNTPs huỳnhquang khác nhau

Giải trình tự tự động

• Các đoạn có huỳnh quang khác nhau được phân tách bởi điện di mao quản.

• Trình tự DNA được đọc tự động.

• Có hai phương pháp giải trình tự tự động dựa theo phương

Phương pháp sử dụng ddNTPs được đánh dấu (mồi không cần đánh dấu)

Phương pháp sử dụng mồi được đánh dấu và

ddNTPs không cần đánh dấu

• Chuẩn bị DNA khuôn

• Nhân DNA bằng PCR

• Nạp sản phẩm PCR vào máy giải trình tự

sequencer, chạy máy

• Phân tích kết kết quả từ các dữ liệu do máy cung cấp, so sánh kết quả đọc trên hai mạch

và đồ thị.

Các bước

• Sau khi diễn ra phản ứng, sản phẩm của cả 4 ống được trộn lẫn và cho điện di trong cùng một “giếng” trên gel (sẽ cho các băng cùng dẫy) …

• Gần phần đỉnh của gel là một máy phân

tích, nó sẽ kích thích sự phát huỳnh quang

của các oligo nucleotid bởi tia laser khi di

chuyển qua Màu của ánh sáng huỳnh quang của từng Oligo nucleotid sẽ được phát hiện qua các thiết bị điện tử

• Thông tin này được kết nối với máy tính đã có

phần mềm chương trình hoá biến đổi thông tin về màu thành trình tự base Thí dụ xanh da trời là

màu của chuỗi oligonucleotid thu được từ phản ứng dideoxy C, như vậy kết thúc sẽ là base ddC, xanh lá cây là A, da cam là G và đỏ là T.

• Máy tính sẽ in ra sơ đồ xác định trình tự vừa nêu

và lưu giữ các thông số.

Một số thông tin về dự án genome người

sử dụng phương pháp Sanger

Bộ genome người có bao nhiêu nucleotides?

Tốn bao nhiêu cho dự án đầu tiên giải trình tự bộ genome người?

Bao lâu để giải trình tự bộ genome người?

Dự án giải trình tự bộ genome người được hoàn thành khi nào?

Bộ genome đó là của ai?

Bộ genome người có bao nhiêu bp?

Bộ genome đó là của ai?

Nhiều người, nhưng hầu hết là lấy từ một người ở Buffalo

Một số thông tin về dự án genome người

sử dụng phương pháp Sanger

First generation sequencing

- Sanger sequencing

Next generation sequencing

- The bead-amplification sequencing (Roche/454FLX) -Sequencing by synthesis (Illumina/Solexa Genome analyzer) -Sequencing by ligation (Applied Biosystems SOLID System)

Third generation sequencing

- Nanopore technology (2012)

Next-Generation Sequencing Technologies

Landscape of Next-Generation Sequencing Technologies Thomas P et als (2011)

Next-Generation Sequencing Technologies

Next-Generation Sequencing Technologies

CHUẨN BỊ DNA ĐỂ GIẢI TRÌNH TỰ

LỰA CHỌN PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ

Shotgun Genome Sequencing

Complete genome copies

Fragmented genome chunks

Shotgun Genome Sequencing

Fragmented genome chunks

NOT REALLY DONE BY DUCK HUNTERS Hydroshearing, sonication, enzymatic shearing

ATTGTTCCCACAGACCG CGGCGAAGCATTGTTCC ACCGTGTTTTCCGACCG

TTTCCGACCGAAATGGC AGCTCGATGCCGGCGAAG

Lắp ráp

17 bp

66 bp

Lắp ráp

TAATGCGACCTCGATGCCGGCGAAGCATTGTTCCCACAGACCGTGTTTTCCGACCGAAATGGCTCC

trình tự liên ứng (consensus sequence)

Lắp ráp

TAATGCGACCTCGATGCCGGCGAAGCATTGTTCCCACAGACCGTGTTTTCCGACCGAAATGGCTCC

trình tự liên ứng (consensus sequence)

Độ che phủ (Coverage): Số lượng đoạn được đọc để có thể lắp ráp được một đoạn

trình tự hoàn chỉnh

Coverage: # of reads underlying the consensus

6 lần che phủ, độ che phủ 100%

Lắp ráp

TAATGCGACCTCGATGCCGGCGAAGCATTGTTCCCACAGACCGTGTTTTCCGACCGAAATGGCTCC

trình tự liên ứng (consensus sequence)

Độ che phủ (Coverage): Số lượng đoạn được đọc để có thể lắp ráp được một đoạn

trình tự hoàn chỉnh

Coverage: # of reads underlying the consensus

5 lần che phủ, độ che phủ 80%

Lắp ráp

Next generation sequencing

Pyrosequencing Biochemistry

• Trong quá trình tổng hợp DNA nhờ DNA

vào đầu 3’ của mạch DNA thì sẽ giải

phóng 1 phân tử phosphates dưới dạng

pyrophosphate (PPi).

• Sử dụng ATP sulfurylase xúc tác sự kết

hợp giữa PPi và adenosine

5’-phosphosulfate thành ATP.

cơ chất chuyển hóa luciferin thành

oxyluciferin và giải phóng năng lượng

dưới dạng ánh sáng Năng lượng ánh sáng

tạo thành tỷ lệ thuận với số nucleotides

tổng hợp mới vào mạch DNA.

• Sau khi phản ứng kết thúc, sử dụng

enzyme apyrase để phân hủy tất cả các

dNTPs dư thừa.

Ronaghi M Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing Genome Res 2001

CSB2008 August 2008 UCSC Sequencing Center

1) Prepare Adapter Ligated ssDNA Library (A-[insert]-B) 2) EmPCR: Clonal Amplification on 28 µ

beads followed by enrichment

4) Perform sequencing-by-synthesis

on the 454 Sequencer

3) Load beads and enzymes

in PicoTiter Plate™

Overview of The 454 Sequencing System

(300-800 base pairs) biotin tag

CSB2008 August 2008 UCSC Sequencing Center

Mix DNA Library

& capture beads (limited dilution)

Emulsion Based Clonal Amplification

“Break micro-reactors”

Isolate DNA containing beads

• Generation of millions of clonally amplified sequencing templates on each bead

• No cloning and colony picking

Create

“Water-in-oil”

emulsion

+ PCR Reagents + Emulsion Oil

CSB2008 August 2008 UCSC Sequencing Center

Centrifuge Step

Load Enzyme Beads

CSB2008 August 2008 UCSC Sequencing Center

Sequencing By Synthesis

DNA Capture

Bead Containing Millions of Copies of a Single

Luciferas e

APS

luciferin

Sequencing-By-Synthesis

454 Technology

ion torrent sequencing

Advances in DNA sequencing technology

20-node GridION setup can sequence a complete human genome in just 15 minutes

We know the sequence—but can we understand it?