Bài 4 giải trình tự gen xác định đột biến kháng thuốc và phenotype của vi sinh vật (1)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNGGẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Đột biến gen liên quan đến tính kháng thuốc Kết quả phân tích đột biến gen trên vùng II thuộc gen 23S rRNA của chủng Streptoc

Trang 1

Bài 4: Giải trình tự gen xác định đột biến kháng thuốc

(genotype) và phenotype của vi sinh vật

Trang 2

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP

Chuẩn đầu ra

1. Lấy ví dụ minh họa nguyên nhân đột biến gen liên quan đến kháng thuốc ở vi sinh vật

2. Diễn giải cơ chế kháng kháng sinh và vai trị của gen liên quan đến khả năng kháng kháng sinh

của vi khuẩn

3. Diễn giải các quy trình xác định đột biến kháng thuốc và genotype

Trang 3

Đột biến gen – kháng thuốc

Trang 4

Kháng thuốc

Kháng thuốc là gì?

+ Vi sinh vật vẫn phát triển với sự hiện diện của thuốc+ Điều trị khơng hiệu quả

Trang 5

Kháng thuốc

Nguyên nhân:

+ Chủ yếu do đột biến gen ở nhiễm sắc thể hoặc tiếp nhận plasmid kháng thuốc+ Nguyên nhân ngoài gen

Trang 6

Đột biến gen

• Các gen liên quan đến kháng sinh:

+ Gen trên chromosome

+ Gen trên plasmid

• Đột biến gen trên chromosome : tần suất 10 -7 đến 10-9

• Đột biến gen trên plasmid: tần suất lớn, lây truyền cao

Trang 7

Đột biến gen liên quan đến tính kháng thuốc

Trang 8

• Một số ví dụ:

1 Vi khuẩn lậu kháng ciprofloxacin: đột biến trên gen gyrA và parC:

+ gen gyrA: đột biến tại codon 91 (Ser thành Phe); codon 95 (Asp thành Ala) + gen parC: đột biến tại codon 85 (Ser thành Asn)

Trang 9

2 Streptococcus pneumoniae kháng erythromycin: đột biến trên vùng II thuộc gen 23S rRNA: đột

biến tại các vị trí codon 225,227,228,231,232

Trang 10

Kết quả phân tích đột biến gen trên vùng II thuộc gen 23S rRNA của chủng Streptocococcus pneumoniae

Trang 11

2 Vi rút HBV kháng thuốc lamivudine: Các đột biến trên vùng polymerase : đột biến rtA191T, rtM250V, rtS202G…

Trang 12

Kết quả giải trình tự gen phát hiện gen đột biến kháng thuốc của vi rút HBV

Trang 13

Cơ chế kháng kháng sinh và vai trò của gen liên quan đến khả

năng kháng kháng sinh của vi khuẩn

Trang 14

Cơ chế kháng kháng sinh

Trang 15

Tác dụng của kháng sinh trong cơ thể: 3 yếu tố

Kháng sinh

Người bệnh Vi khuẩn

Trang 16

Trang 17

• Kháng tự nhiên:

• Ví dụ: vi khuẩn Gram âm kháng vancomycin, vi khuẩn hiếu khí đề kháng metronidazol

• Kháng thu được: Vi khuẩn thu nhận gen mới qua hình thức đột biến gen và chuyển gen

• E.faecium có thể sử dụng các plasmid, transposon và các trình tự chèn (IS) trong bộ gen của chúng để thu nhận

và lan truyền yếu tố kháng thuốc

Trang 18

Kháng thu được – chuyển gen

Trang 19

Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn

Gen kháng làm xuất hiện tác dụng:

• Giảm tính thấm của vách/màng ngoài, màng bào tương: kháng tetracyclin, oxacillin

• Mất khả năng vận chuyển qua màng: kháng streptomycin

• Tăng hoạt động bơm kháng sinh

Trang 20

• Thay đổi tác động: thay đổi ribosom (erythromycin); thay đổi đích gắn penicillin-penicillin binding proteins (PBPs) (beta-lactam)

• Mất ái lực với kháng sinh: thay đổi con đường trao đổi chất do tạo isoenzyme: sulfamid

• Tạo enzyme biến đổi – phá huỷ cấu trúc kháng sinh:

Trang 21

• Phối hợp các cơ chế  vi khuẩn

kháng kháng sinh

Trang 22

Các phương pháp xác định kháng kháng sinh

Xét nghiệm kiểu hình (phenotype): Kháng sinh đồ : Kỹ thuật kháng sinh đồ khoanh giấy khuếch tán; xác định nồng độc ức chế tối thiểu MIC (lỏng, đặc), E-test; kỹ thuật phát hiện enzym phá huỷ kháng sinh

Xét nghiệm kiểu gen (genotype): PCR, RT-PCR, Real-time PCR, Microarray, giải trình tự gen

Trang 23

Xác định kháng thuốc kiểu hình

• Kháng sinh đồ:

1 Kháng sinh đồ phương pháp khuếch tán

2 Kháng sinh đồ phương pháp tìm MIC

3 Kỹ thuật phát hiện các enzym phá hủy thuốc_ Tiêu chuẩn đánh giá: CLSI, EUCAST

Trang 24

Xác định kháng thuốc kiểu hình

.Phương pháp khuếch tán Phương pháp MIC

Trang 25

Kháng sinh đồ phương pháp khuếch tán

1. Kháng sinh đồ bằng kỹ thuật khuếch tán khoanh giấy kháng sinh (Kirby-Bauer) :

+ Kết quả định tính: S (nhạy), I (trung gian); R (kháng)+ Khuyến cáo lâm sàng sử dụng kháng sinh với liều thông thường

Trang 26

Đường kính vùng ức chế được so sánh với CLSI

để phiên giải kết quả

Trang 27

Kháng sinh đồ với chủng liên cầu tan máu

Trang 28

Trang 29

Kháng sinh đồ phương pháp tìm MIC

2 Kháng sinh đồ phương pháp tìm MIC:

+ Kết quả định lượng: MIC: nồng độ ức chế tối thiểu+ Đánh giá được hiệu quả sử dụng trên lâm sàng

Trang 30

2 Kháng sinh đồ phương pháp tìm MIC:

+ Kỹ thuật E-test+ Kỹ thuật pha lỗng/vi pha lỗng: trên mơi trưởng lỏng và đặc+ Kỹ thuật kháng sinh đồ tự động

Trang 31

Trang 32

Kết quả E-test xác định MIC

Trang 33

Trang 34

Kháng sinh đồ phát hiện enzym phá hủy thuốc

3 Kỹ thuật phát hiện enzyme phá hủy thuốc: phát hiện beta-lactamase bằng nitrocefin:

Trang 35

Phát hiện ESBL

Trang 36

Phát hiện kiểu hình AmpC

• Phát hiện kiểu hình AmpC dựa vào sự ức chế AmpC bởi cloxacillin hoặc các dẫn xuất của axit boronic.

Trang 38

Phát hiện kiểu hình carbapenemase

Trang 39

CarbaNP test phát hiện kiểu hình carbapenemase

Trang 40

Trang 41

Trang 42

mCIM test phát hiện kiểu hình carbapenemase

Trang 43

mCIM test phát hiện kiểu hình carbapenemase

Phiên giải kết quả

• Dương tính: đường kính 6 đến 15mm hoặc có những khuẩn lạc mọc

li ti trong vòng đường kính 16 đến 18 mm

• Âm tính: đường kính ≥ 19 mm

• mCIM dương tính làm eCIM để phân biệt các metallico-β-lactamase

từ serin carbapenemase trong các enterobacterales

Trang 44

Xác định gen đột biến kháng thuốc

Xét nghiệm kiểu gen: xác định các gen đột biến kháng thuốc:

+ Xác định chính xác về mặt phân tử

+ Định hướng trong điều trị

+ Dự đốn khả năng kháng thuốc (genotype  phenotype)

Trang 45

Xác định gen đột biến kháng thuốc

+ Sử dụng với các vi sinh vật không/khó xác định kháng thuốc bằng các xét nghiệm kiểu hình

+ Xây dựng chiến lực chống lại sự kháng thuốc

+ Không đánh giá được mức độ biểu hiện thực tế

Trang 46

Genotype và phenotype

• Các biến đổi trong gen được thể hiện hoặc khơng thể hiện thành kiểu hình

• Sự biểu hiện ở kiểu hình là tập hợp của tất cả các biến đổi trong gen

Trang 47

Genotype và phenotype

• Genotype: đặc hiệu cao, độ nhạy thấp hơn: do độ đa dạng của đột biến (đột biến

điểm, đột biến gen), đột biến mới

• Phenotype: phát hiện các đột biến mới, cơ sở để nghiêm cứu genotype

Trang 48

Các kỹ thuật xác định đột biến kháng thuốc và genotype

Trang 49

Phân loại kỹ thuật xác định đột biến

1 Kỹ thuật PCR : PCR, Real time PCR; multiplex PCR, PCR-SSCP…

2 Kỹ thuật LAMP

3 Kỹ thuật Microarray ADN

4 Kỹ thuật giải trình tự gen: WGS; NGS; Sanger…

………

Trang 50

Trang 51

Kỹ thuật PCR

+ Sự đề kháng hiện diện ở S aureus đa kháng thuốc được xác định bằng PCR thông thường hoặc RT-PCR đa hợp để phát hiện gen mecA

+ Multix PCR được sử dụng để giám sát trong các phòng thí nghiệm tham chiếu phát hiện một số

gen ESBL phổ biến nhất: blaTEM, blaSHV, blaCTX-M và blaOXA

Trang 52

Kỹ thuật LAMP

+ Khếch đại axit nucleic ở nhiệt độ khơng đổi

+ Thiết bị tự động, nhanh hơn PCR; cĩ thể nhìn sản phẩm bằng mắt thường

+ Ít linh hoạt hơn PCR, thể tích phản ứng lớn

Ví dụ: được phát triển để phát hiện các gen ESBL, AmpC và carbapenemase trong vi khuẩn được

phân lập từ cả người và động vật

Trang 53

Kỹ thuật Micoarray AND

+ Phát hiện các gen kháng thuốc và các gen độc lực dựa vào các yếu tố di truyền di động như plasmid và transposon

Ví dụ: được áp dụng để xác định đặc tính của độc lực và gen AMR có trong các chủng Salmonella có

liên quan đến lâm sàng ở người

Trang 54

Kỹ thuật Giải trình tự gen

+ Giải trình tự tồn bộ hoặc một phần bộ gen của vi sinh vật

+ Cung câp thơng tin phong phú, phát hiện được nhiều điểm đột biến+ Nhiều bước thủ cơng, nhiều thiết bị

+ Yêu cầu cao về người làm

Trang 55

Kỹ thuật Giải trình tự gen

+ Xét nghiệm kiểu gen - genotype chủ yếu sử dụng kỹ thuật PCR để khếch đại và giải trình tự gen

+ Kỹ thuật giải trình tự gen Sanger; SGS (Single genome sequencing ); UDS (Ultradeep

sequencing), WGS, NGS…

Trang 56

Quy trình xác định đột biến kháng thuốc và genotype

Xử lý mẫu bệnh phẩm Lấy mẫu bệnh phẩm Kỹ thuật PCR, GTTG Phân tích/trả kết quả, lưu trữ

Trang 57

Quy trình PCR

1. Bệnh phẩm được thu thập theo đúng quy định

2. Xác định đoạn gen đặc trưng, xác định trình tự mồi

3. Tách chiết acid nucleic

4. Thực hiện phản ứng PCR

5. Điện di kết quả

Trang 58

Trang 59

Quy trình PCR

Kết quả điện di sản phẩm PCR

Trang 60

Quy trình Real – time PCR

1. Bệnh phẩm được thu thập theo đúng quy định

2. Xác định đoạn gen đặc trưng, xác định trình tự mồi

3. Tách chiết acid nucleic

4. Thực hiện phản ứng Real – time PCR

5. Đọc tín hiệu huỳnh quang ở các kênh màu đã chọn

6. Phân tích và báo cáo kết quả

Trang 61

Quy trình Real - time PCR

- VD: Multiplex Real-time PCR phát hiện gen vanA/vanB xác định enterococci kháng

Trang 62

Quy trình Real - time PCR

Trang 64

Mục đích của giải trình tự gene

• Xác định trình tự nucleotide của tác nhân gây bệnh nhằm tìm ra kiểu genotype hoặc tìm đột biến kháng thuốc, xác định cây phân lồi…

Trang 65

Giải trình tự gen kháng thuốc HIV

Xác định sự thay đổi trình tự các nucleotide để tìm kiếm các đột biến đặc hiệu trong cấu trúc di

truyền của men sao chép ngược (gene pol)và men protease (gene prot)

Trang 66

Trang 67

Giải trình tự gene: Phương pháp Sanger

Trang 68

• Chỉ định xét nghiệm giải trình tự gen kháng thuốc HIV:

+ Bệnh nhân đang phải dùng thuốc ARV > 6 tháng; thất bại điều trị

+ Xét nghiệm chỉ phát hiện các đột biến xuất hiện > 20% lượng vi rút lưu hành+ Tải lượng vi rút > 1.000 coppies/mL

Trang 69

Trang 70

• Điện di sản phẩm PCR

để sequencing

• Chọn 1 hay 2??

Phương pháp 1 Phương pháp 2

Trang 71

• Nhận định kết quả:

+ Sản phẩm PCR phải có 1 băng duy nhất, rõ nét, không đứt gãy

+ Trình tự DNA của gen đích không bị nhiễu

Trang 72

Trang 73

Phân tích kết quả HIV kháng thuốc

• Copy trình tự gene lên website về dữ liệu HIV kháng thuốc của đại học Stanford

• Cơ sở dữ liệu sẽ trả kết quả như ví dụ bên dưới

Trang 74

Báo cáo kết quả HIV kháng thuốc

Hệ thống phần mềm xử lý bằng các thuật tốn đưa ra kết quả mức độ kháng thuốc tương đối của từng loại thuốc ARV theo từng đột biến

Trang 75

- Xác định chính xác vị trí và loại đột biến

- Đánh giá mức độ kháng thuốc tương đối từng loại thuốc  bác sỹ lựa chọn phác đồ điều trị

- Giá thành cao, quy trình dài phức tạp

- Thời gian trả kết quả lâu, đòi hỏi nhiều trang thiết bị và nhân viên được đào tạo kĩ

Trang 76

Giải trình tự Sanger

- - Thực hiện phản ứng PCR với khuơn là trình tự cần biết Quá trình diễn ra làm ngưng ngẫu

nhiên, hỗn hợp chứa các đoạn DNA mới khác biệt nhau chỉ một nu

- - DNA biến tính mạch đơn  mồi gắn phĩng xạ hoặc chuỳnh quang gắn vào mạch đơn 

chia làm 4 ống A, T, G, C  bổ sung từng nu ddNTPs và AND polymerase vào mỗi ống

Trang 77

- - Mỗi ống chứa nồng độ của mỗi loại ddNTP với nồng độ thấp hơn dNTP  ddNTP gắn ngẫu

nhiên và làm ngừng chuỗi

-  4 ống được biến tính lần 2 và điện di trên gel polyacrylamide phân tách các sản phẩm theo

kích thước

Trang 78

Trang 79

Giải trình tự gen thế hệ mới

- NGS (Next Generation Sequencing) -2000

- Cho phép giải mã đồng thời hàng triệu DNA cùng lúc

- Thế hệ 1 (Thế hệ cũ): Phương pháp của Frederick sanger: Dùng ngẫu nhiên phản ứng tổng

hợp DNA bang đieoxynucleotide

Trang 80

- Thế hệ 2 (bắt đầu thế hệ mới):

- PP Pyrosenquencing: Đo lượng PPI giải phĩng trong phản ứng tổng hợp chuỗi AND;

- PP Semiconductor: đo tín hiệu H+ giải phĩng ra trong phản ứng tổng hợp chuỗi AND;

- PP Illumina: đo tín hiệu huỳnh quang gắn vào nucleotide trong phản ứng tổng hợp DNA

Trang 81

Giải trình tự gen thế hệ 2

- PP pyrosenquencing: là phương pháp giải trình tự DNA dựa trên nguyên lý “đọc trình tự

bằng tổng hợp” Khác Sanger: dựa trên sự phát hiện sự giải phóng pyrophosphate (Ppi) khi dNTP được thêm vào chuỗi, thay vì kết thúc bằng ddNTP

- https://youtu.be/bNKEhOGvcaI

Trang 82

- PP semiconductor: phát hiện trình tự thơng qua việc phát tín hiệu đo hiệu điện thế do ion H+

được giải phĩng ra trong quá trình tổng hợp DNA bằng các máy đo pH siêu nhỏ gắn vào

chip cảm ứng

Trang 83

- PP Illumina:

- https://youtu.be/fCd6B5HRaZ8

Trang 84

Trang 85

- Thế hệ 3:

- Gỉai trình tự dựa trên các kỹ thuật phân tích tín hiệu đơn phân tử Phân tích tức thời tín hiệu đơn

phân tử huỳnh quang găn vào nucleotide trong phản ứng tổng hợp chuội DNA trong giếng nano

- https://youtu.be/NHCJ8PtYCFc

Trang 86

Tĩm tắt các ý chính

Xử lý mẫu bệnh phẩm Lấy mẫu bệnh phẩm Kỹ thuật PCR, GTTG Phân tích/trả kết quả, lưu trữ

Trang 87

Câu hỏi lượng giá

Câu 1: Nguyên nhân chính làm xuất hiện gen kháng thuốc?

A. Đột biến gen trên NST và tiếp nhận gen đột biến qua plasmid

B. Nguyên nhân ngoài gen

Tiêu đề	Giải trình tự gen xác định đột biến kháng thuốc và phenotype của vi sinh vật
Trường học	Đại học Y tế công cộng

Định dạng
Số trang	91
Dung lượng	8,69 MB