ỨNG DỤNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI ĐỂ XÁC ĐỊNH KIỂU GEN VÀ CÁC ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC CỦA SIÊU VI VIÊM GAN B ppt

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI ĐỂ XÁC ĐỊNH KIỂU GEN VÀ CÁC ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC CỦA SIÊU VI VIÊM GAN B Tóm Tắt Tám kiểu gen của siêu vi viêm gan B HBV đã được xác định Từ A đến

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI

ĐỂ XÁC ĐỊNH KIỂU GEN VÀ CÁC ĐỘT BIẾN

KHÁNG THUỐC CỦA SIÊU VI VIÊM GAN B

Tóm Tắt

Tám kiểu gen của siêu vi viêm gan B (HBV) đã được xác định (Từ A đến H) dựa vào sự khác nhau trên 8 % của bộ gen HBV, và sự phân bố của các kiểu gen khác nhau ở các châu lục, các nước khác nhau Việc xác định kiểu gen của HBV ngày càng được quan tâm bởi vì kiểu gen HBV có liên quan đến biểu hiện triệu chứng lâm sàng, diễn tiến của bệnh cũng như đáp ứng với điều trị của viêm gan siêu vi B Bên cạnh đó, vấn đề phát hiện đột biến kháng thuốc, đặc biệt là các đột biến kháng Lamivudine trong điều trị HBV giữ một vai trò rất quan trọng để từ đó chúng ta mới có lựa chọn thuốc đúng và hiệu quả trong điều trị viêm gan siêu vi B Chúng tôi ứng dụng kỹ thuật giải trình tự chuỗi (Sequencing) trên hệ thống OpenGene với

bộ thuốc thử TruGene (Bayer) trong việc xác định kiểu gen và các đột biến kháng thuốc Lamivudine đã được công bố của HBV Trong thời gian từ tháng 8/2004 đến tháng 5/2006, tại phòng xét nghiệm Trung Tâm Y Khoa MEDIC, chúng tôi thực hiện giải trình tự chuỗi cho 122 trường hợp bệnh nhân Việt Nam viêm gan siêu vi

B mãn tính đang điều trị Lamivudine Nam chiếm 97 trường hợp (79,5%), nữ 25

trường hợp (20,5%), với tuổi trung bình của bệnh nhân 33,9 ± 10,4 Tất cả các trường hợp đều HBVDNA [+], trong đó HBeAg [+] là 100 trường hợp (82,0 %) và HBeAg [-] là 22 trường hợp (18,0 %) Chỉ có 2 kiểu gen của HBV là kiểu gen B

và C, trong đó kiểu gen B là 76 trường hợp (62,3 %) và kiểu gen C là 46 trường hợp (37,7 %) Tổng cộng có 78 trường hợp (63,9%) có đột biến kháng Lamivudine, tỷ lệ và các kiểu đột biến như sau: L180M & M204I (11,5%); L180M & M204V (36,1%); L180M, M204V & V173L (0,8%); L180M, M204V

& V207I (0,8%); M204I (12,3%); M204I & V207I (0,8%); M204V (1,6%) Trong

76 trường hợp kiểu gen B có 49 trường hợp (64,5%) có đột biến kháng Lamivudine, và 46 trường hợp kiểu gen C có 29 trường hợp (63,0%) có đột biến kháng Lamivudine Tất cả bệnh nhân đang điều trị Lamivudine với thời gian điều trị trung bình là 2,5 ± 0,9 năm với số trường hợp tương ứng cho điều trị 1, 2, 3, 4 năm là 18, 41, 45, 18 trường hợp Tỷ lệ có đột biến kháng Lamivudine sau 1, 2, 3,

4 năm điều trị Lamivudine là 27,8%; 63,4%; 71,1%; 83,3% Qua kết quả bước đầu đạt được chúng tôi thấy rằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi giữ một vai trò rất quan trọng trong việc xác định kiểu gen siêu vi viêm gan B cũng như việc nhận diện được các đột biến kháng thuốc Lamivudine để từ đó chúng ta có một phác đồ điều trị tối ưu

Summary

APPLYING SEQUENCING TO IDENTIFY HEPATITIS B VIRUS

GENOTYPES AND MUTATIONS

Hepatitis B Virus (HBV) can be classified into 8 genotypes A through H based on

an intergroup divergence of 8% or more in the complete nucleotide sequence, and the different distribution of various genotypes in different continents, countries The identification of HBV genotypes are more concerned as it is HBV genotypes relating to clinical manifestation, activity of liver disease as well as treatment responses of Hepatitis B Additionally, the discovery of resistance to medicines in HBV treatment plays a very important role from which we can have an appropriate and effective choice in Hepatitis B treatment.We have applied the Sequencing by OpenGene system with Trugene HBV Genotyping kit (Bayer) to identify Hepatitis B Virus Genotypes and Lamivudine – resistant mutation

From August 2004 to May 2006, in MEDIC laboratory, we have implemented sequencing for 122 cases Vietnamese with Chronic Hepatitis B on Lamivudine treatment in which: 97 cases are males (take 79.5%) and 25 cases are females (take 20.5%), medium age: 33.9±10.4 All cases are HBVDNA [+] in which: 100 cases are HBeAg [+] (82.0%) and 22 cases are HBeAg [-] (18.0%) There are only two genotypes of HBV: genotype B and genotype C, in which 76 cases are genotypes B (62.3%) and 46 cases are genotype C (37.7%)

Totally there are 78 cases (63.9%) mutations with following established proportion and types: L180M & M204I (11.5%); L180M & M204V (36.1%); L180M, M204V & V173L (0.8%); L180M, M204V & V207I (0.8%); M204I (12.3%); M204I&V207I (0.8%); M204V (1.6%)

There are 49 cases mutations in 76 cases of genotypes B (64.5%) and 29 cases in

46 cases of genotypes C (63.0%) All patients are on Lamivudine treatment with average time is 2.5±0.9 years, the corresponding number of patients in treatment period of 1, 2, 3, 4 year are 18, 41, 45, 18 The proportion of developing mutations after 1, 2, 3, 4 years of treatment with Lamivudine is 27.8%; 63.4%; 71.1%; 83.3%

We have found that - with above preliminary results - the sequencing plays a very important role in identifying Hepatitis B Virus Genotypes and Mutations From those results we can approach an optimal treatment course

I Đặt vấn đề:

Những tiến bộ mới trong điều trị viêm gan do siêu vi B (HBV) đã góp phần đáng

kể trong việc hạn chế những biến chứng của bệnh Cho đến nay đã có 4 loại thuốc điều trị HBV đã được FDA (Food and Drug Administration: Cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ) công nhận là Interferone, Lamivudine, Adefovir và Entecavir, trong đó Lamivudine vẫn được xem là thuốc uống được lựa chọn đầu tiên Tuy nhiên trong quá trình điều trị Lamivudine đã có vấn đề phát sinh: Vấn đề

đột biến kháng Lamivudine của HBV, tỉ lệ đột biến kháng này xảy ra ngày càng cao tăng theo thời gian dùng thuốc Lamivudine

Một vấn đề mới ngày càng được quan tâm là kiểu gen của HBV (HBV Genotype) Khác với kiểu gen siêu vi viêm gan C (HCV) có vai trò quan trọng trong việc đánh giá điều trị đặc hiệu thì vai trò của kiểu gen HBV chưa được rõ ràng lắm Sự phân

bố của kiểu gen HBV thay đổi tùy theo vùng địa dư, mỗi châu lục hay mỗi nước sẽ

có các kiểu gen vượt trội khác nhau

Có nhiều kỹ thuật sinh học phân tử có thể dùng để xác định các đột biến kháng thuốc của HBV cũng như xác định kiểu gen của HBV Chúng tôi sử dụng kỹ thuật giải trình tự chuỗi (Sequengcing) để đồng thời vừa xác định các đột biến kháng thuốc Lamivudine của HBV vừa xác định được kiểu gen HBV, khảo sát kiểu gen nào vượt trội ở người Việt Nam cũng như đánh giá các loại và tỉ lệ đột biến kháng Lamivudine theo thời gian điều trị Lamivudine

Mục tiêu của nghiên cứu này là: (1) Xác định kiểu gen của HBV ở bệnh nhân Việt Nam; (2) Khảo sát các kiểu đột biến và tỉ lệ đột biến kháng Lamivudine ở bệnh nhân điều trị Lamivudine liên tục

II Đối tượng và phương pháp nghiên cứu:

1, Đối tượng nghiên cứu:

Bệnh nhân người Việt Nam, đã được chẩn đoán viêm gan siêu vi B mãn tính đang được điều trị liên tục bằng Lamivudine

Các bệnh nhân được chia làm 4 nhóm với thời gian điều trị liên tục Lamivudine tương ứng là 1, 2, 3, 4 năm

Có xét nghiệm HBVDNA dương tính

Không bị đồng nhiễm siêu vi viêm gan C

2, Kỹ thuật thực hiện:

2.1, Kỹ thuật giải trình tự chuỗi:

Huyết thanh bệnh nhân được tách và lưu trong ống mẫu tinh sạch, nếu mẫu chưa thực hiện ngay thì được lưu ở nhiệt độ – 200C DNA của HBV được tách chiết theo nguyên tắc hấp thụ trên hạt Silicate (Phương pháp BOOM) rồi rửa bằng Ethanol 70% Thực hiện phản ứng trùng hợp chuỗi (PCR) trên bộ thuốc thử TruGene HBV Genotyping (Bayer), máy luân nhiệt Bio-Rad theo hướng dẫn của nhà sản xuất Sau khi kiểm tra có sản phẩm khuếch đại (Amplicons) bằng điện di trên thạch Agarose thì tiếp tục thực hiện phản ứng cắt đoạn (Clip reaction) theo hướng dẫn của nhà sản xuất trên máy luân nhiệt, tiếp tục thực hiện điện di trên thạch Acrylamide với hệ thống OpenGene Tín hiệu sẽ tự động thu nhận từ hệ thống điện di và phần mềm máy tính sẽ sắp xếp trình tự chuỗi của mẫu, và trình tự chuỗi này sẽ được so sánh với thư viện gen (Gene Librarian) có sẵn được cung cấp

bởi nhà sản xuất (Bayer) Kết quả thu nhận được là kiểu gen của HBV và các đột biến kháng Lamivudine đã được công bố

2.2, HBeAg:

Kỹ thuật thực hiện theo phương pháp điện hóa phát quang, thuốc thử của hãng Abbott, thực hiện trên máy Architect (Abbott)

3, Phương pháp nghiên cứu:

Cắt ngang

4, Thống kê:

Phần mềm SPSS for Win, Ver 7.5

III, Kết quả:

1, Tổng số có 122 trường hợp được thực hiện giải trình tự chuỗi:

Tuổi nhỏ nhất là 10, lớn nhất là 63 với độ tuổi trung bình là 33,9 ± 10,4

Nam có 97 trường hợp chiếm 79,5% và nữ có 25 trường hợp chiếm 20,5%

2, Kiểu gen của HBV trong 122 trường hợp:

Chỉ có 2 kiểu gen của HBV được xác định là kiểu gen B và C Trong đó kiểu gen

B là 76 trường hợp (62,3%) và kiểu gen C là 46 trường hợp (37,7%)

3, Kết quả HBeAg:

Tất cả 122 trường hợp đều có HBVDNA dương tính, trong đó HBeAg âm tính là

22 trường hợp (18%) và HBeAg dương tính là 100 trường hợp (82%) Kết quả của HBeAg trong các kiểu gen khác nhau cũng được ghi nhận

Bảng 1 Tỉ lệ HBeAg và các kiểu gen B, C

Kiểu gen B Kiểu gen C

Số lượng Phần trăm Số lượng Phần trăm

HBeAg dương tính 64 84,2% 36 78,3%

4, Kiểu gen HBV và các đột biến kháng Lamivudine:

Bảng 2 Tỉ lệ của đột biến kháng Lamivudine và kiểu gen HBV

Số lượng Phần trăm Số lượng Phần trăm

Không có đột biến kháng Lamivudine 27 35,5% 17 37%

Có đột biến kháng Lamivudine 49 64,5% 29 63%

5, Các kiểu đột biến kháng Lamivudine và tỉ lệ đột biến kháng Lamivudine theo thời gian điều trị:

Tổng cộng có 78 (63,9%) trường hợp có đột biến kháng Lamivudine

Bảng 3 Tỷ lệ các loại đột biến kháng Lamivudine và tỉ lệ phần trăm

Loại

đột biến

L180M,

M204I

L180M, M204V

L180M, M204V &

V173L

L180M, M204V &

V207I

M204I M204I,

V207I

M204V

Số

lượng

Ghi chú: L (Leucine); M (Methionine); I (Isoleucine); V (Valine)

Có 4 nhóm bệnh nhân được khảo sát dựa trên thời gian điều trị Lamivudine, số lượng bệnh nhân sau 1, 2, 3, 4 năm điều trị Lamivudine tương ứng là 18, 41, 45,

18 trường hợp Thời gian điều trị Lamivudine trung bình là 2,5 ± 0,9 năm

Bảng 4 Tỉ lệ đột biến kháng Lamivudine và thời gian điều trị Lamivudine

Số lượng

Phần trăm

Số lượng

Phần trăm

Số lượng

Phần trăm

Số lượng

Phần trăm

Không có đột biến

kháng Lamivudine

13 72,2% 15 36,6% 13 28,9% 3 16,7%

Có đột biến kháng

Lamivudine

5 27,8% 26 63,4% 32 71,1% 15 83,3%

IV, Bàn luận:

1, Kiểu gen HBV:

Có 2 cách phân loại HBV: Kiểu huyết thanh (Serotype) và kiểu gen (Genotype) Trước đây người ta phân HBV thành 4 kiểu huyết thanh adr, adw, ayr và ayw dựa vào các kháng nguyên của kháng nguyên bề mặt HBV (HBsAg) Tuy nhiên những

ý nghĩa của kiểu huyết thanh chưa được nghiên cứu nhiều Với sự phát triển của sinh học phân tử, ngày nay người ta phân loại HBV dựa vào nghiên cứu trên bộ gen của HBV và phân HBV thành 8 loại đặt tên từ A đến H dựa vào sự khác nhau trên 8% của toàn bộ bộ gen của HBV Có nhiều kỹ thuật dùng để xác định kiểu gen HBV như kỹ thuật giải trình tự chuỗi (Sequencing), sự đa hình của các đoạn cắt giới hạn (RFLP), phản ứng lai các đoạn dò (LiPA), phản ứng trùng hợp chuỗi với các đoạn mồi đặc hiệu (PCR with Specific Primers), phản ứng miễn dịch gắn men (Enzyme-linked immunoassay)…Kỹ thuật chúng tôi dùng để xác định kiểu gen của HBV là kỹ thuật giải trình tự chuỗi vì bên cạnh việc xác định được kiểu gen của HBV chúng tôi còn tìm được các đột biến kháng Lamivudine chỉ trong một lần thực hiện giải trình tự chuỗi

Vai trò của kiểu gen HBV chưa được nghiên cứu nhiều cũng như có nhiều nghiên cứu với số liệu nhỏ, rãi rác công bố với kết quả không phù hợp nhau, điều này khác với vai trò của kiểu gen HCV trong vấn đề điều trị viêm gan siêu vi C

Kiểu gen của HBV phân bố ở các châu lục và vùng lãnh thổ khác nhau thì khác nhau Kiểu gen HBV chủ yếu ở Đông Nam Á là kiểu gen B và C, điều này cũng phù hợp với kết quả của chúng tôi với 122 trường hợp thực hiện giải trình tự chuỗi

có 76 trường hợp (62,3%) kiểu gen B và 46 trường hợp (37,7%) kiểu gen C Trong

122 trường hợp thực hiện giải trình tự chuỗi (HBV DNA dương tính) chúng tôi ghi nhận trong đó HBeAg âm tính là 22 trường hợp (18%) và HBeAg dương tính là

100 trường hợp (82%) Có vài nghiên cứu đã được công bố cho thấy đối với kiểu gen B của HBV có thải trừ HBeAg cao hơn so với kiểu gen C Tuy nhiên kết quả của chúng tôi (Bảng 1) không có sự khác biệt rõ rệt giữa tỉ lệ HBeAg âm tính ở kiểu gen B và C (15,8% và 21,7%) Vai trò của kiểu gen HBV trong diễn tiến của bệnh viêm gan siêu vi B cũng được nghiên cứu, kết quả cho thấy kiểu gen C dường như làm cho rối loạn chức năng gan nhiều hơn kiểu gen B cũng như kiểu gen C dễ diễn tiến đến xơ gan nhiều hơn kiểu gen B Mối liên hệ giữa kiểu gen HBV và ung thư tế bào gan cũng được ghi nhận: Kiểu gen B thường kết hợp với

sự phát triển ung thư tế bào gan ở người trẻ tuổi, một nghiên cứu khác lại cho thấy kiểu gen C thường kết hợp với ung thư tế bào gan và có tỉ lệ tái phát ung thư tế bào gan cao hơn sau khi được phẫu thuật cắt bỏ ung thư tế bào gan so với kiểu gen

B Anh hưởng của kiểu gen HBV với đáp ứng điều trị Lamivudine cũng chưa được nghiên cứu nhiều, một nghiên cứu cho thấy dường như bệnh nhân kiểu gen B

dễ phát triển đột biến kháng Lamivudine hơn các kiểu gen khác Kết quả của chúng tôi ghi nhận (Bảng 2) tỉ lệ có đột biến kháng Lamivudine ở kiểu gen B (64,5%) và kiểu gen C (63%) là gần bằng nhau Do đó các vấn đề về ảnh hưởng của kiểu gen HBV cần phải được nghiên cứu lâu dài và số lượng bệnh nhân nhiều hơn

2, Các kiểu và tỷ lệ đột biến kháng Lamivudine ở bệnh nhân điều trị Lamivudine:

Lamivudine là thuốc uống được lựa chọn đầu tiên trong điều trị viêm gan siêu vi B mãn tính vì có nhiều ưu điểm như giá thành có thể chấp nhận được, an toàn, ít tác dụng phụ, dễ sử dụng (Dùng đường uống), tuy nhiên có một nhược điểm mà ngày càng được nhiều người quan tâm là vấn đề đột biến kháng Lamivudine của siêu vi viêm gan B và tỉ lệ đột biến kháng thuốc Lamivudine tăng theo thời gian sử dụng Lamivudine

Vị trí đột biến kháng Lamivudine xảy ra trên vùng C (Domain C) của đoạn gen sao chép ngược (RT: Reverse Transcriptase) của HBV chủ yếu là kiểu YMDD (tyrosine-methionine-aspartate-aspartate), ở đó Methionine sẽ được thay bằng Valine, Isoleucine và hiếm khi là Serine (Đột biến rtM204V/I/S) Những đột biến khác cũng liên quan đến kháng Lamivudine như đột biến thay Leucine thành Methionine ở vùng B (Domain B) là đột biến rtL180M; Đột biến V173L; Đột biến V207I Trong 122 trường hợp giải trình tự chuỗi thì có 78 trường hợp (63,9%) có đột biến kháng Lamivudine Có nhiều kiểu đột biến kháng Lamivudine, chủ yếu là đột biến ở vị trí 204 và có kèm hoặc không các đột biến rtL180M, V173L, V207I Kết quả của chúng tôi cho thấy có rất nhiều dạng của đột biến kháng Lamivudine (Bảng 3) trong đó chiếm nhiều nhất là đột biến rtL180M và M204V (36,1%)

Lamivudine được dùng điều trị viêm gan siêu vi B thường với thời gian điều trị kéo dài, tối thiểu phải là 1 năm Nhiều nghiên cứu đã công bố cho thấy tỉ lệ xuất hiện đột biến kháng Lamivudine của HBV lại tăng dần theo thời gian điều trị Lamivudine Theo Guan R và cộng sự, tỉ lệ xuất hiện đột biến kháng Lamivudine