KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH tự GEN PHÁT HIỆN đột BIẾN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNGGẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Xác định trình tự ADN là việc xác định trình tự sắp xếp các nucleotides trong một đoạn DNA... TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNGG

Trang 2

Chuẩn đầu ra bài học

Sau khi học xong, sinh viên có khả năng :

1 Tóm tắt nguyên lý và ứng dụng của một số kỹ thuật SHPT ứng dụng trong chẩn đoán một số bệnh di truyền

2 Trình bày được nguyên lý giải trình tự gen

Trang 3

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP

Xác định trình tự ADN là việc xác định

trình tự sắp xếp các nucleotides trong một đoạn DNA.

Khái niệm

Trang 4

Các mốc giải mã hệ gen của các sinh vật

khác nhau

Trang 5

Genome Sequencing

Supratim Mukherjee; Dimitri Stamatis; Jon Bertsch; Galina Ovchinnikova; Hema Y Katta; Alejandro Mojica; I-Min A Chen; Nikos

C Kyrpides; TBK Reddy Genomes OnLine database (GOLD) v.7: updates and new features Nucl Acids Res (2018) doi:

10.1093/nar/gky977

Trang 6

✓ Maxam-Gilbert method (1977)

✓ Sanger method (1977)

✓ Giải trình tự tự động

✓ Next generation sequencing

✓ Third generation sequencing

Các phương pháp xác định trình tự

Trang 7

Trang 8

• Là phương pháp phân giải hóa học.

• Sử dụng hóa chất để phân hủy ADN ở các vị trí base đặc hiệu→ tạo ra các đoạn có chiều dài khác nhau.

Phương pháp Maxam-Gilbert

Trang 9

Trang 10

Nguyên tắc hoạt động: khi sinh tổng hợp sợi DNA,

DNA polymerase cần vị trí 3’OH

Phương pháp Sanger (chain termination or dideoxy method)

Trang 11

Nucleotide

Trang 12

Đơn phân của ADN

Deoxyadenosine

Deoxyguanosine

Trang 13

Đơn phân của ARN

Trang 14

DNA (Deoxyribonucleic acid )

Trang 15

Trang 16

Nguyên tắc hoạt động: khi sinh tổng hợp sợi DNA,

DNA polymerase cần vị trí 3’OH

Trang 17

• Nguyên tắc hoạt động: trình tự của một sợi DNA đơn được

xác định dựa vào hoạt động của enzyme DNA polymerase

trong quá trình tổng hợp sợi DNA bổ xung Các sợi DNA

được tổng hợp mới này được kết thúc tại các vị trí đặc hiệu là

các dideoxynucleotide

• DNA polymerase xúc tác gắn các Nu

vào mạch đơn đang tổng hợp ở vị trí

3 ' OH, khi gặp nucleotid khơng cĩ

nhĩm 3 ' OH, phản ứng tổng hợp bị

dừng lại.

• Nhân tố kết thúc đặc hiệu được sử dụng là các

dideoxynucleotide (phương pháp dideoxynucleotid)

Trang 18

• Các bản sao của DNA khuôn ở dạng sợi đơn

• Một mồi thích hợp (bắt cặp với DNA khuôn)

• DNA polymerase

• 4 loại nucleotides

• Một lượng nhỏ dideoxynucleotides được đánh dấu (phóng xạ hoặc chất nhuộm huỳnh quang) Mỗi phản ứng chỉ bổ sung một loại ddNTP, thực hiện trong 4 ống phản ứng riêng rẽ.

Chỉ cần đánh dấu hoặc với mồi hoặc

với dideoxynucleotides

Các yêu cầu cần thiết của phương pháp Sanger

Trang 19

• Các phân tử ddNTP cĩ thể kết hợp ngẫu nhiên vào chuỗi ADN đang

tổng hợp một cách bình thường qua nhĩm 5 triphosphat nhưng lại

khơng tiếp tục kết hợp được với phân tử desoxynucleotit triphosphat

• Chạy điện di các đoạn này rồi hiện hình chúng, ta cĩ thể xác định được trình tự chuỗi ADN.

Trang 21

Mồi

4 ống phản ứng

riêng biệt

Trang 23

Giải trình tự theo Sanger

Trang 24

• Tính ổn định cao, có thể tiến hành với quy mô lớn

• Phản ứng không phụ thuộc vào tính đặc trưng hoá của các chất hoá học, không có phản ứng phụ

• Nếu kết hợp dùng với phản ứng PCR thì chỉ cần lượng

ADN mẫu nhỏ, đồng thời có thể giảm được ảnh hưởng của ADN cấu trúc bậc 2

• Xác định được trình tự đoạn gen tương đối dài, khoảng

300 ~ 400 bp.

Ưu điểm của phương pháp Sanger

Trang 25

Cĩ thể tự động hĩa khơng?

Vấn đề đặt ra

Cĩ thể chạy trên 1 giếng khơng vì sẽ tiết

kiệm thời gian, nguyên vật liệu và hiệu

quả hơn ➔ Sử dụng các ddNTPs huỳnh

quang khác nhau.

Trang 27

Giải trình tự tự động

Trang 28

• Các đoạn có huỳnh quang khác nhau được phân tách bởi điện di mao quản.

• Trình tự DNA được đọc tự động.

Giải trình tự tự động theo Sanger

Trang 29

Giải trình tự tự động theo Sanger

Trang 30

• Có hai phương pháp giải trình tự tự động dựa

theo phương pháp Sanger bao gồm:

– Phương pháp sử dụng ddNTPs được đánh dấu (mồi không cần đánh dấu).

– Phương pháp sử dụng mồi được đánh dấu và

Phương pháp tự động

Trang 31

Trang 32

Sanger 1977 Citations

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000

Trang 33

Bộ genome người cĩ bao nhiêu bp?

Tốn bao nhiêu cho dự án đầu tiên giải trình tự bộ genome

người?

Bao lâu để giải trình tự bộ genome người?

Dự án giải trình tự bộ genome người được hồn thành khi

nào?

Bộ genome đĩ là của ai?

Một số thơng tin về dự án genome người sử dụng

phương pháp Sanger

Trang 34

Bộ genome người có bao nhiêu bp?

Bộ genome đó là của ai?

Nhiều người, nhưng hầu hết là lấy từ một người ở Buffalo

Một số thông tin về dự án genome người sử dụng phương pháp Sanger

Trang 35

• Thế hệ 1

- Sanger sequencing

• Thế hệ 2 (Next generation sequencing)

- The bead-amplification sequencing (Roche/454FLX) -Sequencing by synthesis (Illumina/Solexa Genome analyzer) -Sequencing by ligation (Applied Biosystems SOLID System)

• Thế hệ 3

- Nanopore sequencing

- Real-time monitoring of PCR activity

Các thế hệ máy giải trình tự

Trang 36

Next-Generation Sequencing Technologies

Trang 37

Trang 38

Trang 39

CHUẨN BỊ DNA ĐỂ GIẢI TRÌNH TỰ

Trang 41

Trang 43

LỰA CHỌN PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ

Trang 44

Shotgun Genome Sequencing

Trang 45

ATTGTTCCCACAGACC G

CGGCGAAGCATTGTTC C

ACCGTGTTTTCCGACC

C AGCTCGATGCCGGCGAAG

17 bp

Trình tự liên ứng

Lắp ráp

Trang 46

Trình tự liên ứng (consensus sequence)

Lắp ráp

Trang 47

Độ che phủ (Coverage): Số lượng đoạn được đọc để cĩ thể lắp ráp

được một đoạn trình tự hồn chỉnh

6 lần che phủ, độ che phủ 100%

TAATGCGACCTCGATGCCGGCGAAGCATTGTTCCCACAGACCGTGTTTTCCGACCGAAATGGCTCC

Lắp ráp

Trang 48

5 lần che phủ, độ che phủ 80%

TAATGCGACCTCGATGCCGGCGAAGCATTGTTCCCACAGACCGTGTTTTCCGACCGAAATGGCTCC

Lắp ráp

Trang 49

Lắp ráp

Trang 50

Lắp ráp

Trang 51

Giải trình tự thế hệ 2

(Next generation sequencing)

Trang 53

• Trong quá trình tổng hợp DNA nhờ DNA

polymerase , cứ mỗi dNTP khi được gắn vào đầu 3’

của mạch DNA thì sẽ giải phĩng 1 phân tử

phosphates dưới dạng pyrophosphate (PPi).

• Sử dụng ATP sulfurylase xúc tác sự kết hợp giữa

PPi và adenosine 5’-phosphosulfate thành ATP.

• Luciferase sử dụng luciferin và ATP làm cơ chất

chuyển hĩa luciferin thành oxyluciferin và giải

phĩng năng lượng dưới dạng ánh sáng Năng

lượng ánh sáng tạo thành tỷ lệ thuận với số

nucleotides tổng hợp mới vào mạch DNA.

• Sau khi phản ứng kết thúc, sử dụng enzyme

apyrase để phân hủy tất cả các dNTPs dư thừa.

Pyrosequencing Biochemistry

Trang 54

Pyrosequencing Biochemistry

Trang 55

Pyrogram

Ronaghi M Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing Genome Res 2001

Trang 56

• Chúng ta có thể phát hiện tín hiệu ánh sáng phát

ra từ một phân tử ATP không?

• Làm thế nào chúng ta có thể đồng thời giải trình

tự được hàng triệu phản ứng cùng một lúc?

• Làm thế nào chúng ta có thể thực hiện đồng thời hàng triệu phản ứng PCR trong ống phản ứng?

Disscussion questions?

Trang 57

1) Prepare Adapter Ligated ssDNA

Library (A-[insert]-B)

2) EmPCR: Clonal Amplification on

28 µ beads followed by enrichment

4) Perform sequencing-by-synthesis on the 454 Sequencer

3) Load beads and enzymes

Trang 58

Mix DNA Library

& capture beads (limited dilution)

Adapter carrying library DNA

A

B

Micro-reactors

Trang 59

CSB2008 August 2008

Centrifuge Step

Load Enzyme Beads

Trang 60

Sequencing By Synthesis

DNA Capture Bead Containing Millions

of Copies of a Single Clonal Fragment

Trang 61

454 Technology

Trang 62

Pyrosequencing Biochemistry

Trang 63

• Chuẩn bị DNA khuơn

• Nhân DNA bằng PCR

• Nạp sản phẩm PCR vào máy giải trình tự sequencer, chạy máy

• Phân tích kết kết quả từ các dữ liệu do máy cung cấp,

so sánh kết quả đọc trên hai mạch và đồ thị.

Các bước

Trang 64

* Bệnh của Hemoglobin

Trang 65

Đặc điểm huyết sắc tố bình thường

Trang 67

1 Đột biến cấu trúc thay thế 1 aa 1.1 Hemoglobin S: Bệnh tế bào hồng cầu hình liềm (HbS)

 Đột biến cấu trúc thay thế 1 aa

Trang 68

Bệnh tế bào hồng cầu hình liềm (HbS)

-Do sự biến đổi cấu trúc aa thứ 6 của chuỗi beta globin: G A G

(Glutamin) → G T G ( Valin) hồng cầu hình lưỡi liềm

- Bệnh do đột biến gen lặn trên NST thường

Trang 69

HC hình lưỡi liềm

Trang 70

1 Đột biến cấu trúc thay thế 1 aa

1.2 Hemoglobin C:

-Do sự biến đổi cấu trúc aa thứ 6 của chuỗi beta globin: GAG (Glutamin) → AAG (Lyzin)

-Dạng đồng hợp tử: CC thiếu máu tan huyết nhẹ, lách to, trong máu có nhiều hồng cầu hình bia và ít hc nhỏ

- Dạng dị hợp tử: AC không biểu hiện lâm sàng.

Trang 71

1 Đột biến cấu trúc thay thế 1 aa

1.3 Hemoglobin E:

ĐỘT BIẾN GEN VÀ BỆNH PHÂN TỬ Ở NGƯỜI

-Do sự biến đổi cấu trúc aa thứ 26 của chuỗi beta globin : GAG (Glutamin) → AAG ( Lyzin)

-Dạng đồng hợp tử: EE thiếu máu tan huyết nhẹ, lách to, trong máu cĩ nhiều hồng cầu hình bia và ít hc nhỏ

- Dạng dị hợp tử: AE khơng biểu hiện lâm sàng.

Trang 72

2 Đột biến số lượng số lượng chuỗi globin (Thalassemia)

Trang 73

Trang 74

Thalassemia dạng alpha

Có 4 gene: 2 gene từ bố và 2 gene từ mẹ

(mang gene bất thường và có thể di truyền)

nhẹ hay alpha-thalassemia thể ẩn)

(bệnh hemoglobin H)

Trang 75

Trang 76

Thalassemia dạng beta

Có 2 gene: một gene từ bố và một từ mẹ

nhẹ)

(thể nặng hoặc thiếu máu Cooley)

• Trẻ thường khỏe mạnh khi sinh, nhưng các dấu hiệu và triệu chứng sẽ xuất hiện trong hai năm đầu đời.

Trang 77

Kỹ thuật di truyền - Nguyên lý và Ứng dụng, Đinh Trường Sơn, dinhtruongson77@gmail.com

Ứng dụng PCR trong chẩn đoán bệnh hồng cầu

hình lưỡi liềm

Trang 78

Ứng dụng PCR trong chẩn đoán bệnh hồng cầu

hình lưỡi liềm

Trang 79

• Sau khi diễn ra phản ứng, sản phẩm của cả 4 ống được trộn lẫn và cho điện di trong cùng một “giếng” trên gel (sẽ cho các băng cùng dẫy) …

• Gần phần đỉnh của gel là một máy phân tích, nĩ sẽ kích

thích sự phát huỳnh quang của các oligo nucleotid bởi tia laser khi di chuyển qua Màu của ánh sáng huỳnh quang của từng Oligo nucleotid sẽ được phát hiện qua các thiết bị điện

tử

Trang 80

• Thông tin này được kết nối với máy tính đã có phần mềm chương trình hoá biến đổi thông tin về màu thành trình tự base Thí dụ xanh da trời là màu của chuỗi oligonucleotid thu được từ phản ứng dideoxy C, như vậy kết thúc sẽ là

base ddC, xanh lá cây là A, da cam là G và đỏ là T.

• Máy tính sẽ in ra sơ đồ xác định trình tự vừa nêu và lưu giữ

Định dạng
Số trang	80
Dung lượng	4,36 MB