Chuong 10 1 lai phan tu

Tính đặc hiệu của phản ứng lai1 Lai đặc hiệu: toàn bộ trình tự của mẫu dò probe bổ sung với trình tự của DNA cần dò.. Có thể phát hiện một phân tử DNA giữa một hỗn hợp nhiều DNA dựa vào

Chương 10

Kỹ thuật lai phân tử

1

nguyên-Lai DNA-DNA hoặc DNA-RNA

Lai phân tử là quá trình kết hợp lại của hai

mạch đơn của axít nucleic (DNA, RNA) Cơ

sở của việc lai phân tử là các mối liên kết

hydro giữa các base trên hai mạch.

DNA có thể biến tính hoặc tái hồi khi đun nóng hoặc

làm lạnh

Để tiến hành phản ứng lai phân tử trước hết DNA mạch kép phải được biến tính Đó là một quá trình trong đó các liên kết hydro của mạch DNA kép ban đầu bị phá vỡ giải phóng hai mạch đơn với toàn bộ các base sẵn sàng tiếp nhận các liên kết hydro mới

Một số trường hợp xảy ra khi lai DNA

Tính đặc hiệu của phản ứng lai

1) Lai đặc hiệu: toàn bộ trình tự của mẫu dò (probe) bổ

sung với trình tự của DNA cần dò.

2) Lai không đặc hiệu: phản ứng lai xảy ra khi trình tự

mẫu dò và trình tự DNA có trình tự không hoàn toàn bổ sung cho nhau.

Lai ở nhiệt độ42oC đảm bảocho phản ứng laiđặc hiệu hơn tạinhiệt độ 35oC

Có thể phát hiện một phân tử DNA giữa một hỗn hợp nhiều DNA dựa vào một mẫu dò đặc hiệu cho phân tử DNA đó

Hỗn hợp DNA

Mẫu dò

Hỗn hợp sau lai với mẫu dò

Phát hiện

Mẫu dò: là đoạn DNA hoặc RNA mạch đơn ngắn (< 2000 nu) được sử dụng

Một số kỹ thuật tạo mẫu dò DNA/RNA

Phát hiện vị trí mẫu dò

Phản ứng tạo màu với cơ chất là BCIP và NBT

Màu hồng

Màu xanh

X-ray film

light at 477 nm.

Một số kỹ thuật tạo mẫu dò DNA/RNA

Một số kỹ thuật tạo mẫu dò DNA/RNA

Một số kỹ thuật tạo mẫu dò DNA/RNA

• Tạo mẫu dò bằng

phương pháp

Nick translation

Dùng PCR để sinh tổng hợp mẫu dò DNA/RNA

• DNA khuôn (mang đoạn gen cần phân tích)

• Primers (đặc hiệu của đoạn gen phân tích)

• DIG dNTP mix = 2mM dATP/dGTP/dCTP, 1.3 mM dTTP, 0.7

Southern Blot

Northern Blot

Western Blot

RNAse protection Assay

FISH (Fluorescence in situ Hybridization) EMSA (Electromobility Shift Assay)

IHC (Immunohistochemistry)

DNA microarray

Một số phương pháp lai

Các bước cơ bản

• Tách chiết ADN tổng số

• Cắt bởi enzyme giới hạn

• Điện di để phân tách các đoạn DNA, protein

• Chuyển mẫu lên màng cứng

SO SÁNH CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH GEN X BẰNG

LAI Southern, Northern, and Western

KỸ THUẬT LAI SOUTHERN BLOT

I KHÁI NIỆM

II NGUYÊN LÝ

III QUI TRÌNH KỸ THUẬT

IV CÁC ỨNG DỤNG

Professor of Biochemistry at the University of Oxford

Là kỹ thuật dùng để nhận dạng một

đoạn DNA đặc thù dựa trên trình tự

thể hiện của nó sau khi điện di trên

gel agarose

Được phát triển bởi Edwin Southern

(1975) ➔ “Southern Blot”

Kỹ thuật Southern Blot cho biết

◼Sự có mặt của đoạn DNA (gen)

◼Số bản sao DNA (tương ứng với số

gen, số bản copy).

◼Độ lớn của đoạn DNA.

◼Trình tự tương tự giữa đoạn DNA

mục tiêu và mẫu dò

KHÁI NIỆM

II NGUYÊN LÝ

Southern blotting phát triển dựa trên việc chuyển và

cố định các đoạn DNA cần dò lên một màng rắn (solid support), sau đó đoạn DNA mục tiêu được lai với mẫu

dò dựa trên các trình tự bổ sung Nhờ sự phát hiện

mẫu dò, người ta có thể kết luận về sự có mặt của

đoạn DNA cần dò

III QUI TRÌNH KỸ THUẬT

Bước 1: Chuẩn bị DNA

Chiết tách DNA nghiên cứu, cắt DNA nghiên cứu bằng enzym giới hạn (thường tiến hành trên 2 phản ứng, mỗi phảnứng chọn ngẫu nhiên 1 RE), kết quả cho một hỗn hợp các đoạn cắt có kích thước khác nhau

Tiến hành điện di hỗn hợp sản phẩm cắt trên gel agarose

Lane 1 – DNA marker Lane 2 – Unrestricted DNA Lane 3 – Restricted DNA

Bước 2: chuyển DNA lên màng

Làm biến tính (tạo thành các sợi đơn) các băng DNA trên gel điện di bằng

cách xử lý gel điện di 20 phút trong dung dịch NaOH 0,4M.

Đặt gel lên hệ thống giá chuyển (máy Blotting) để chuyển nguyên vẹn các DNA

đã biến tính trên gel lên một tấm lọc (nylon Filter) gọi là màng lai Tấm lọc có cấu tạo là nitrocellulose sẽ giữ chặt các đoạn DNA được chuyển lên từ gel

điện di Quá trình này thực hiện với dung dịch dẫn chuyển là NaOH 0,4M.

Hệ thống Blotting phát triển bởi Southern,

University of Oxford

Bước 2 - chuyển DNA lên màng (tiếp)

DNA trên màng lai sau đó được cố định trên màng bằng tác nhân nhiệt độ

cao (80oC) hoặc dưới tác dụng của tia UV.

• Các đoạn DNA cố định trên màng lai được đem lai với mẫu

dò đã được đánh dấu hoặc bằng p 32 hoặc một chất gây

phản ứng màu Quá trình được thực hiện ở buồng lai (nhiệt

độ 65- 680 C) trong thời gian 6- 12 giờ

• Sau khi kết thúc phản ứng lai, màng lai được rửa loại bỏ các mẫu dò không tham gia phản ứng lai

Bước 3: Lai mẫu dò DNA (DNA probe)

đặc hiệu với màng lai.

Bước 3: Lai mẫu dò DNA (DNA probe)

đặc hiệu với màng lai.

Bước 4: Phát hiện mẫu dò

Phát hiện vị trí lai nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghi (autoradiogragh).Nơi xảy ra phản ứng lai sẽ mang hoạt tính phóng xạ (do có mặt mẫu

dò mang phóng xạ), khi đặt phim lên tấm lọc, nơi có phản ứng lai sẽphát xạ, phim sẽ ghi lại tín hiệu phóng xạ Tráng phim sẽ thu đượccác vết đen tại nơi phát xạ địa điểm lai

Ví dụ

“Real” Southern blot (DNA-DNA blot)

www.mun.ca/biology/scarr/ 3250_Southern_Blot_analysis.htm

STAINED by Et Br VIZUALIZED by P32

http://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120078/bio_g.swf::Southern%20Blot

IV ỨNG DỤNG CỦA SOUTHERN BLOT

Phương pháp Northern Blot

• Phương pháp lai Northern Blot là phương pháp lai

RNA của tế bào với mẫu dò DNA Về mặt nguyên lý

và các bước tiến hành cũng tương tự như phương pháp Southern blot.

• Phương pháp này cho biết

– Sự có mặt của mARN trong mô

– Mức độ thể hiện của gen

– Độ lớn của mRNA

– Trình tự tương đồng giữa đoạn mục tiêu và mẫu dò

Northern blot

Western blot

• Lai Western Blot được thực hiện giữa các protein với nhau dựa trên nguyên tắc phản ứng miễn dịch giữa kháng nguyên và

kháng thể

• Phương pháp này cho biết:

– Sự thể hiện của gen thông qua sự có mặt của protein trong

mô

– Mức độ thể hiện của gen

– Độ lớn của protein

Các bước tiến hành - Western Blot

Mixture of protein molecules

Protein ở dạng cấu trúc 2' and 3' thường không

tích điện âm→ xử lý với SDS (sodium dodecyl

sulfate) để bọc protein với điện tích âm

Cố định protein trên màng

Bổ sung kháng thể sơ cấp đặc hiệu để hình thành phức protein-kháng thể

Bổ sung kháng thể thứ cấp có gắn với enzyme alkalin phosphatase hoặc horseradish peroxidase.

Bổ sung cơ chất indolyphosphate p-toluidine (BCIP) hoặc nitro blue tetrazolium (NBT) tạo phản ứng đặc hiệu với enzyme, phát hiện vị trí lai (màu hồng hoặc xanh tương ứng).

5-bromo-4-chloro-3'-Phản ứng tạo màu với cơ chất là BCIP và NBT

Màu hồng

Màu xanh

Một số phương pháp được sử dụng để phát hiện vị trí

protein trong westen blot

So sánh 3 phương pháp lai

Các phương pháp lai khác

In situ Hybridization

RNAse protection Assay

EMSA (Electromobility Shift Assay)

IHC (Immunohistochemistry)

DNA microarray

Lai tại chỗ - In situ hybridization

(Fluorescence in situ hybridization (FISH) hoặc đồng vị hoặc không đồng vị

DNA probes có thể lai với chromosome của tế bào ở metaphase hoặc

interphase

Chu kỳ tế bào qua các pha: G1,

S; G2 và pha M.

Fluorescence in situ hybridization (FISH) experiment visualizing two gut bacteria colonizing the epithelial cell surface of the honey bee gut The

gammaproteobacterial gut symbiont Gilliamella apicola is shown in

magenta, the betaproteobacterial gut symbiont Snodgrassella alvi is

shown in green Counterstain with DAPI in blue shows DNA of bacteria and host nuclei

RNAse Protection Assay

or T3) để tổng hợp mẫu dò cRNA được đánh dấu phóng xạ, dùng cDNA làm

được bảo vệ khỏi enzyme do hình thành sợi kép.

Ưu điểm của RNAse Protection Assay

1 Nhạy gấp hơn 10 lần so với Northern Blots

2 Có thể nhận biết nhiều đoạn mục tiêu cùng lúc

3 Có tính đặc hiệu cao do khả năng bắt cặp chính xác

giữa RNA và mẫu dò

4 Có thể nhận biết trong trường hợp mẫu có ít bản sao

trong tế bào/mô

Sử dụng mẫu dò đánh dấu biotin trong RPA

Câu hỏi

(using Horse Radish Peroxidase-Conjugated Secondary Antibodies)

phenyldiboronic acid (PDBA),

Salicylhydroxamic acid (SHA)

,

Kỹ thuật hóa mô miễn dịch immunohistochemistry

Kiểm tra sự có mặt của protein trong tế bào dựa vào

phản ứng antigen-antibody Đánh dấu kháng thể

(antibody) bằng chất nhuộm mầu hoặc phát huỳnh

quang để dễ dàng quan sát vị trí, sự phân bố và lượng

protein trong tế bào.

Các bước:

1 Đánh dấu mẫu dò DNA bằng 32 P

2 Trộn probe đánh dấu với protein mục tiêu→ phức hợp

3 Bổ sung mẫu dò không đặc hiệu (cạnh tranh)

4 Tách phức hợp với mẫu dò tự do trên gel âm tính

Electromobility Shift Assay (EMSA) (hay Gel Shift Assay)

Nguyên lý: phức hợp DNA-Protein di chuyển chậm hơn các đoạn DNA tự do trên

gel