Các phương pháp phân loại lai phân tử

Chương 7 Các phương pháp phân loại 7.1 Phương pháp phân loại hình thái Xem chương 9 và 10 7.2 Phương pháp phân loại giải phẫu 7.2.1 Nghiên cứu cấu trúc biểu bì lá Biểu bì lá là một d

Thực vật có hoa NXB Đại học quốc gia Hà Nội 2006 Tr 78 – 100 Từ khoá: Phương pháp phân loại, nhiễm sắc thể, tế bào, izoenzym, giải phẫu Tài liệu trong Thư viện điện tử ĐH Khoa học Tự nhiên có thể được sử dụng cho mục đích học tập và nghiên cứu cá nhân Nghiêm cấm mọi hình thức sao chép, in ấn phục vụ các mục đích khác nếu không được sự chấp thuận của nhà xuất bản và tác giả Mục lục Chương 7 Các phương pháp phân loại 3

7.1 Phương pháp phân loại hình thái 3

7.2 Phương pháp phân loại giải phẫu 3

7.2.1 Nghiên cứu cấu trúc biểu bì lá 3

7.2.2 Nghiên cứu cấu tạo giải phẫu gỗ 3

7.3 Phương pháp phân loại bào tử phấn hoa 8

7.4 Phương pháp nghiên cứu tế bào 10

7.4.1 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 10

7.4.2 Hình thái thể nhiễm sắc 16

7.4.3 Kiểu nhân 17

7.5 Phương pháp phân loại izoenzym 18

7.5.1 Định nghĩa izoenzym 18

7.5.2 Phương pháp phân tích izozym bằng kỹ thuật điện di 19

7.6 Phương pháp phân loại bằng ADN 23

Chương 7 Các phương pháp phân loại

Nguyễn Nghĩa Thìn

7.6.1 Kỹ thuật phản ứng trùng hợp - PCR 23

7.6.2 Phân loại dựa trên kỹ thuật cắt giới hạn - RFLP 24

7.6.3 Phân loại dựa trên kỹ thuật nhân ngẫu nhiên ADN đa hình - RAPD 24

7.6.4 Phân loại dựa trên kỹ thuật nhân đoạn AFLP 25

7.6.5 Phân loại dựa trên kỹ thuật tiểu vệ tinh là các đoạn ADN ngắn có một số lượng các chuỗi nucleotid lặp lại - SSR 26

Chương 7

Các phương pháp phân loại

7.1 Phương pháp phân loại hình thái

(Xem chương 9 và 10)

7.2 Phương pháp phân loại giải phẫu

7.2.1 Nghiên cứu cấu trúc biểu bì lá

Biểu bì lá là một dấu hiệu có ý nghĩa trong phân loại đã được nhiều người sử dụng trước hết cấu trúc của các kiểu tế bào biểu bì ví dụ ở Vulpa (hình 7.3) hay các kiểu lông trên bề mặt,

ví dụ ở Combretum (hình 7.1) Các kiểu lông tùy theo điều kiện chúng ta có thể xem dưới kính hiển vi thường hay kính hiển vi quét (hình 7.2)

Bên cạnh nghiên cứu cấu tạo lông, người ta sử dụng lưỡi dao để bóc các lớp biểu bì để xem cấu tạo hệ thống lỗ khí hoặc người ta dùng parafin lo•ng tráng qua bề mặt lá rồi sau đó bóc ra để xem cấu tạo các tế bào quanh lỗ khí Ba mươi lăm kiểu lỗ khí đã tìm thấy trong thực vật có mạch (hình 7.1) có ý nghĩa lớn trong phân loại Những kiểu đó thường có ý nghĩa ở các bậc taxôn cao Ví dụ như ở Acanthaceae đặc trưng kiểu diacytic, trong khi đó có liên quan chặt chẽ với Scrophulariaceae với kiểu monomocytic… Trong họ Poaceae hoa tiêu giảm mạnh và các dấu hiệu đặc trưng rất hạn chế Do đó người ta quan tâm các dấu hiệu giải phẫu

cơ quan dinh dưỡng và tế bào học hơn trong đó các tế bào biểu bì được quan tâm

7.2.2 Nghiên cứu cấu tạo giải phẫu gỗ

Cấu tạo giải phẫu gỗ được nghiên cứu trên các bản cắt ngang, tiếp tuyến, xuyên tâm và tiêu bản làm mủn Nó có ý nghĩa lớn trong tiến hóa (hình 7.3 – 7.8) Dụng cụ nghiên cứu là kính hiển vi hai mắt với vật kính x8, x20, x40; thị kính x7, máy ảnh, trắc vi thị kính, trắc vi vật kính

7.2.2.1 Làm tiêu bản lát cắt

Theo tính chất của gỗ cứng hay mềm để có cách xử lý khác nhau, nếu là gỗ mềm thì cắt trực tiếp ngay, không cần qua các bước xử lý cũng được Nếu là gỗ cứng thì xử lý bằng glyxerin và cồn hoặc đun trong nước sôi và để vài tiếng đồng hồ mới tiến hành cắt Mục đích cho tống hết các bọt khí làm cho gỗ mềm ra và tiêu bản nguyên vẹn

Chuẩn bị mẫu:

Hình 7.1.

Các dạng tế bào quanh lỗ khí (theo Dilcher, 1974)

A anomocytic, B cycocytic; C amphicyclocytic; D actinocytic, E anisocytic,

F amphianisocytic, G adiacytic, H amphidiacytic, I.paracytic, J amphiparacytic,

K brachyparacytic, L amphibrachyparacytic, M hemiparacytic, N paratetracytic,

O amphitetracytic, P brachyparacytic, Q amphibrachyparatetracytic, R

staurocytic,

S anomotetracytic, T parahexacytic-monopolar, U parahexacytic-dipolar,

V brachyparahexacytic-monopolar, W brachyparahexacytic-dipolar, X polocytic,

Y copolocytic, Z axillocytic, AA coaxillocytic, BB desmocytic, CC pericytic, DD

copericytic , EE amphipericytic

Hình 7.2

Các dạng lông tuyến của chi Combretum: 6 tuyến có cuống và các tuyến khác

dạng khiên (theo Dilcher, 1974)

* Khử nước ở nguyên liệu: Vật mẫu lấy ra khỏi dung dịch làm mềm phải được rửa thật

kỹ bằng nước thường rồi ngâm lần lượt vào cồn 70o, cồn 96o, cồn tuyệt đối lần thứ nhất, lần thứ hai và lần thứ ba Thời gian ngâm mẫu khoảng từ 15 - 30 phút hoặc hơn tùy theo độ dày của vật mẫu

* Chuyển vào dung môi trung gian: sau khi lấy mẫu ra khỏi cồn tuyệt đối lần thứ ba, chuyển mẫu vào metylbenzoat lần thứ nhất, rồi lần thứ hai, mỗi giai đoạn để 1 - 2 giờ sau đó đưa vào xylen lần thứ nhất và lần thứ hai, mỗi giai đoạn không quá 30 phút

* Chuyển vào parafin: từ trong môi trường xylen ta chuyển tiếp như sau:

Xylen - parafin (tỷ lệ 3: 1), để ở nhiệt đồ bình thường trong 1 - 2 giờ

Xylen - parafin (tỷ lệ 1: 1), giữ ở 40o trong khoảng 1 - 2 giờ

Xylen - parafin (tỷ lệ 1: 3), giữ ở 40o trong khoảng 1 - 2 giờ, sau đó cho vào parafin nóng chảy trong tủ sấy ở nhiệt độ tủ cao không quá 62oC Thời gian để phụ thuộc vào bề dày của mẫu và bản chất của mô, có thể để từ 10 - 12 giờ đến vài ngày Nhiệt độ tủ sấy phải giữ đều

* Đúc khối parafin để dựng vật mẫu:

Khi parafin đã ngấm hoàn toàn vào vật mẫu thì đem đúc thành khối, sau đó để nguội Chú ý: Nên đặt vật mẫu vào giữa khối parafin Nếu cần, điều chỉnh vật mẫu sau khi parafin đã đông đặc thì phải dùng một kim sắt hơ nóng để cho parafin chảy nóng trở lại

• Chuẩn bị khối parafin đựng vật mẫu: trong khối parafin nói trên thường chứa nhiều vật mẫu do đó phải chia mỗi mẫu nằm trong một khối parafin nhỏ riêng Sửa các khối parafin mang vật mẫu thành hình thang cụt có đáy vuông Các cạnh đối diện của mặt cắt phải song song với nhau

Gắn khối parafin này lên một miếng gỗ nhỏ bằng cách hơ nóng lưỡi dao mổ trên đèn cồn rồi làm chảy parafin ở hai mặt cắt gắn với nhau Sửa lại khối parafin một lần nữa để cho mặt cắt phải thật phẳng, các cạnh thật vuông góc với nhau và để cho các lát cắt vào ngay với mặt cắt

- Tiến hành cắt: Có thể cắt bằng tay hoặc bằng

máy cắt Sau khi gỗ đã được làm mềm tiến hành cắt

theo 3 mặt phẳng: ngang, tiếp tuyến và xuyên tâm

Với độ dày vừa phải (khoảng 15 - 18 *m) để vừa

mỏng vừa giữ được các yếu tố nguyên vẹn Sau đó

sửa thành các mảnh một cách cân đối (vuông hay chữ

nhật)

- Loại parafin ở lát cắt: để có thể nhuộm và

quan sát được vi phẫu, cần loại hết parafin trên lát cắt

Phương pháp loại parafin như sau: chuyển các mẫu

qua lần lượt các ống Boren đựng các dung dịch dưới đây

Xylen (lần thứ nhất) Thời gian 10 phút

Xylen - cồn tuyệt đối (3:1) Thời gian 5 phút

Xylen - cồn tuyệt đối (1:1) Thời gian 5 phút

Xylen - cồn tuyệt đối (1:3) Thời gian 5 phút

Sau đó chuyển tiêu bản vào các chậu đựng thuốc nhuộm tùy theo yêu cầu nghiên cứu

* Nhuộm màu:

Thuốc nhuộm safranin 1 - 9% trong cồn tuyệt đối, khi dùng ta phải pha lo•ng gấp đôi Cách nhuộm: Lấy các lát cắt ra thấm

khô và tiến hành nhuộm bằng thuốc nhuộm

safranin từ 5 phút đến 2 giờ Sau đó cố định

trong HCl và rửa bằng nước cất cho sạch

Chuyển sang giai đoạn loại nước

Loại nước: Để loại hết nước các bản

cắt được ngâm trong các dung dịch cồn từ

nồng độ thấp đến cao Vì cồn tan trong

nước và sẽ rút dần dần nước ra Sau đó

chuyển sang dung dịch cồn + xylen D•y

các dung dịch xylen nồng độ cao dần để

loại hết cồn ra (do keo canada chỉ tan trong xylen) Cuối cùng chuyển sang dung dịch xylen + cacbon có tác dụng khử trùng Vật mẫu ngâm trong các dung dịch với khoảng thời gian từ 15 đến 30 phút hoặc hơn

* Dán tiêu bản:

Chuẩn bị lamen và lam kính sạch Đặt

các lát cắt đã loại hết nước và ngâm trong

dung dịch xylen + cacbon lên lam kính, sửa

đúng hướng, nhỏ vài giọt keo canada và đậy

từ từ lamen tránh cho bọt khí xuất hiện

7.2.2.2 Làm tiêu bản ngâm mủn

Dựa trên nguyên tắc một số hóa chất có

tác dụng phá hủy màng gắn giữa các tế bào,

làm cho các tế bào tách rời nhau ra Phương pháp này thường dùng để nghiên cứu từng tế bào nguyên vẹn mà không làm hư hại chúng

Phương pháp tiến hành như sau:

* Làm mủn: Cũng lấy ở mẫu gỗ ban đầu chẻ vài que nhỏ bỏ vào ống nghiệm, cho một vài tinh thể KCIO3, thêm HNO3

và sau đó thêm một ít nước cho ngập gỗ

và đun bằng đèn cồn khoảng 15 - 20 phút Khi thấy các que gỗ đã trắng ra, dùng đũa thủy tinh đánh cho gỗ tơi ra, để lắng và dùng nước cất rửa axit, sau đó ngâm trong cồn khoảng 15 phút Tiến hành quá trình nhuộm

* Nhuộm mẫu: Dung dịch nhuộm là safranin 1 - 9% trong cồn Thấm khô mẩu

gỗ mủn bằng giấy thấm, cho vài giọt thuốc nhuộm safranin (cho ướt hết mẫu)

để khoảng 5 phút, cố định bằng HCl, rửa nước và sau đó tiến hành loại nước

• Loại nước: Ngâm trong dung dịch cồn 90o khoảng 15 phút, chuyển sang cồn tuyệt đối lần thứ nhất, lần thứ hai để rút nước ra, sau đó là quá trình rút cồn khỏi tế bào bằng xylen (vì keo canada chỉ tan trong xylen chứ không tan trong cồn) Quá trình này tiến hành bằng cách chuyển mẫu sang dung dịch cồn + xylen lần thứ nhất, lần thứ hai và cuối cùng là cacbon xylen tương tự như trên tiêu bản cắt lát

Hình 7.6

Các giai đoạn tiến hóa của bản thủng lỗ từ kiểu hình thang của kiểu trung gian và từ kiểu đối nhau tới kiểu cách nhau (Takhtajan 1964)

Hình 7.7

Các giai đoạn tiến hóa của bản thủng lỗ hình thang từ kiểu

thủng lỗ nguyên thủy có nhiều vách ngang tới kiểu thủng lỗ

chuyên hóa chỉ có một số vách ngang (Takhtajan 1964)

• Dán tiêu bản: Sau khi mẫu đã được loại nước và thấm xylen lấy một ít mủn, dùng kim mũi mác dàn đều trên lam kính đã sạch và khô, nhỏ vài giọt keo canada và từ từ đậy lamen

7.2.2.3 Quan sát

* Quan sát bằng mắt thường

cấu tạo chung của gỗ

* Quan sát trên kính hiển vi

Căn cứ trên bản mô tả và các

sơ đồ tiến hóa, chúng ta phân tích,

đánh giá các mức độ tiến hóa khác

nhau, có thể lập thành khóa xác định

7.3 Phương pháp phân loại bào tử phấn hoa

Phấn hoa là một dấu hiệu được nhiều nhà phân loại sử dụng bởi tính ổn định của nó, dễ lấy mẫu, phương pháp đơn giản, ít tốn kém và thời gian tiến hành ngắn phù hợp với nghiên cứu trong phân loại Mặt khác chúng thể hiện các mức độ tiến hóa một cách rõ ràng qua các dấu hiệu về hình dạng, kích thước, cấu trúc bề mặt rất đa dạng của chúng cũng như sự có mặt rãnh, số lượng rãnh, sự có mặt các lỗ, số lượng của chúng trên rãnh, cấu trúc rãnh (hình 7.10 - 7.12)

hợp; 5 Đồng hình nhiều dãy; 6 Đồng hình một dãy; 7 Nhu

mô phân tán; 8 Không dính mạch trong giải (gian mạch);

9 Nhu mô quanh bó (Takhtajan 1964)

Hình 7.9

Các giai đoạn tiến hóa của các thành phần mạch với kiểu thủng lỗ đơn, ở phần mạch đầu tiên trên bản thủng lỗ dưới còn lại một vạch ngang (Takhtajan 1964)

4 3 2 1 Hình 7.10.

Hình thái hạt phấn

1 Hình bầu dục đứng; 2 Hình cầu gai; 3 Hình ngũ giác gai thấp;

4 Hình bầu dục đứng rộng bề mặt mạng lưới (Webster)

Phương pháp này tiến hành theo các bước sau:

+ Lấy mẫu nghiên cứu: mẫu hạt phấn lấy từ hoa đã trưởng thành của các mẫu cho vào

một túi giấy nhỏ và ghi rõ tên khoa học của tiêu bản, số hiệu và nơi lưu giữ

+ Xử lý mẫu: hiện nay có nhiều phương pháp để xử lý

mẫu bào tử phấn hoa nhưng phương pháp axetolyza được

sử dụng phổ biến, nhuộm và làm sáng Các bước tiến hành như sau:

* Cho mẫu chứa phấn hoa vào ống nghiệm, khẽ nghiền nhỏ

* Pha hỗn hợp axetoliza: cho vào ống đo 4,5 ml alhydric, sau đó cho thêm vào 5 ml H2SO4 đậm đặc

* Đổ hỗn hợp trên vào ống nghiệm chứa mẫu phấn hoa, sau đó đun sôi trên nồi cách thủy ở nhiệt độ 70 – 100oC, vừa đun vừa khuấy đều bằng đũa thủy tinh, rồi đưa

ra ly tâm 3 phút với vận tốc 300 vòng/phút, đổ dịch trong

• Phần B nhuộm màu Cho vào ống nghiệm chứa mẫu phấn hỗn hợp và nước cất và 1

giọt fusxin, để yên từ 2 - 5 phút; quay ly tâm gạn nước trong và rửa vật mẫu bằng hỗn hợp

cồn và nước cất rồi ly tâm gạn nước trong

• Phần C làm mẫu sáng Rửa vật mẫu trong hỗn hợp cồn và nước cất, ly tâm gạn nước

trong Đổ hỗn hợp làm sáng mẫu vào ống nghiệm để yên 2 phút sau đó ly tâm 5 phút gạn

nước trong Hỗn hợp làm sáng gồm có: Axit axetic đặc (8ml), NaClO3 30% (12 giọt), HCl

(1ml)

A

B Hình 7.11.

Ảnh hiển vi cấu trúc bề mặt hạt phấn

A: một loài trong họ Cúc -

Compositae; B: một loài trong họ

Thầu dầu – Euphorbiaceae

Đổ phần B và phần C vào phần A, cho vào ống nghiệm một ít nước cất khuấy đều, ly tâm

5 phút rồi gạn nước trong

Rửa vật mẫu bằng cồn 95o và nước cất, ly tâm và gạn nước trong Cho vào ống nghiệm một ít glyxerin đặc, khuấy đều rồi để yên

+ Làm tiêu bản hiển vi hạt phấn: hút mẫu bằng pipet, nhỏ một ít dịch mẫu lên lam kính để soi, quan sát (chụp ảnh, mô tả, đo kích thước trên các tiêu bản tạm thời với kính hiển vi quang học ở các vật kính *20, *40

+ Phương pháp đo hiển vi: để đo kích thước hạt phấn gồm đo trục xích đạo và trục cực của hạt phấn dùng thước đo vật kính và thước đo thị kính Mỗi chỉ số đo ít nhất 30 mẫu, các

số đo kích thước được xử lý theo phương pháp thống kê để tính được kích thước trung bình

và độ lệch chuẩn của mỗi mẫu

+ Phương pháp mô tả: đối với mỗi loài cần có một bản mô tả Đây là phần tư liệu cơ sở của nghiên cứu, sơ đồ mô tả gồm: Tên khoa học, họ; địa điểm thu mẫu, người thu, số hiệu, nơi lưu giữ như Bảo tàng hay phòng mẫu; kiểu hạt phấn, kích thước và các đặc điểm khác + Phương pháp chụp ảnh hiển vi: phương pháp này nhằm mục đích minh hoạ cho phần

mô tả hình thái hạt phấn, đòi hỏi phải phản ánh chính xác hình dạng, cấu trúc hạt phấn ở các

vị trí khác nhau trong đó cơ bản là hai vị trí: cực và xích đạo, đôi khi cả vị trí nghiêng nếu cần Phải làm rõ cấu trúc phân lớp của vỏ hạt phấn bằng các ảnh phân tích sáng

Các quan sát để chụp ảnh tiến hành trên các tiêu bản tạm thời gắn trong glyxerin với kính hiển vi quang học Hiện nay với kỹ thuật hiện đại người ta có nhiều cách chụp khác nhau để thể hiện một cách đầy đủ các chi tiết của đối tượng

+ Đánh giá và lập khóa định loại: trên cơ sở những thông số mô tả chúng ta căn cứ trên những dấu hiệu liên quan đến tiến hóa để xây dựng khóa phân loại

7.4 Phương pháp nghiên cứu tế bào

7.4.1 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của hệ thống học tế bào thực vật là bộ thể nhiễm sắc của toàn bộ các taxôn thực vật bậc thấp cũng như bậc cao Để nghiên cứu bộ thể nhiễm sắc phục vụ cho

hệ thống học thực vật người ta thường tiến hành nghiên cứu bộ nhiễm sắc ở giai đoạn phân bào nguyên nhiễm cụ thể người ta thường sử dụng mầm non của lá, đỉnh sinh trưởng của thân, đỉnh rễ non của cây hoặc đỉnh rễ chính của hạt vừa nẩy mầm vì đó là vùng đang ở giai đoạn phân chia mạnh nhất và vùng phân chia ở ngay ở dưới lớp bao của các cơ quan đó Bên cạnh

đó người ta còn tiến hành nghiên cứu bộ nhiễm sắc ở giai đoạn phân bào giảm nhiễm cụ thể người ra dùng bông non đối với họ Lúa (Poaceae) ngay sau hay khi mới nhú bông hoặc nụ hoa đối với các loài khác lúc chưa có màu đặc trưng hoặc từ hạt phấn cho nẩy mầm trong ống nghiệm

Phương pháp thông thường tiện lợi và dễ chủ động nhất là gieo hạt trong đĩa petri ở nhiệt

độ 23 – 25oC cho hạt nẩy mầm Thời gian nẩy mầm tuỳ theo từng loại 1 - 2 ngày đến vài tuần

lễ Độ dài của rễ từ 0,8 - 2 cm là dùng được Người ta tiến hành dùng panh hay kim mũi mác ngắt một đoạn cách đỉnh rễ khoảng 2 mm và nhúng vào dung dịch cố định Bên cạnh gieo hạt trong đĩa petri người ta còn có thể tiến hành trồng cây trong chậu với đất ẩm và tơi xốp Đối

với các loài cây gỗ có hạt to và có vỏ cứng tốt nhất lấy trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng của thân hay lá non hoặc có thể trồng thành cây con và sau đó lấy trực tiếp từ đỉnh rễ non Trước khi lấy 1 - 2 giờ hoặc từ đêm hôm trước cần tưới nước cho đất đủ ẩm để kích thích rễ phát triển Thời gian lấy rễ tốt nhất trong khoảng 8 - 10 giờ sáng tùy mùa, đối với các loài cây sinh sản bằng căn hành, thân củ hay bằng hom v.v thì phải đặt hom, củ hay căn hành trong cát ướt hoặc trong lọ đựng nước có hỗn hợp chất dinh dưỡng nhân tạo

7.4.1.1 Xử lý các đối tượng trước lúc cố định

Trong một số trường hợp khó đếm số lượng thể nhiễm sắc hoặc thể nhiễm sắc quá dài thì trước khi cố định phải xử lý rễ hay mầm lá, đỉnh sinh trưởng của thân qua một số thuốc như 8

- oxyquinolin, chloranhydrat, consixin, paradichlorobenzen hoặc làm lạnh

Đối tượng sau khi ngắt khỏi cơ thể thực vật phải cho ngay vào dung dịch 8 - oxyquinolin

ở nồng độ 0,002 M ở nhiệt độ 10-14oC trong khoảng 3 giờ Trong trường hợp này người ta pha dung dịch như sau: dùng 0,58 g 8 - oxyquinolin hòa vào 200 ml nước cất ấm Xử lý bằng chất này để làm tăng độ lớn của thể nhiễm sắc lên 1,5 lần mà không làm thay đổi chiều dài của chúng, đồng thời làm cho các eo sơ cấp và thứ cấp hiện rõ hơn

Muốn xem thể nhiễm sắc dễ dàng và chính xác thì trước khi xử lý đối tượng cần làm lạnh

ở 0oC trong 24 giờ vì lúc đó thể nhiễm sắc sẽ co ngắn đáng kể Kagava đã ngâm trong dung dịch chloranhydrat 0,3 - 1% để làm ngắn thể nhiễm sắc sau đó cho vào nước cất để rửa trong một giờ và tiếp tục cho vào buồng ấm 2 - 4 giờ rồi mới cho vào dung dịch cố định Những năm gần đây người ta sử dụng dung dịch Consixin 0,01 - 0,05% để xử lý trong thời gian 2 giờ trước khi cố định

Đối với lá non người ta ngâm trong dung dịch consixin 0,2% trong 1 - 2 giờ

Người ta cũng có thể dùng dung dịch paradiclorobenzen đậm đặc để xử lý rễ ở nhiệt độ

12 - 16oC trong 2 - 3 giờ Để có dung dịch này chúng ta lấy 5 - 10 g tinh thể paradiclorobenzen hòa tan trong 500 ml nước cất để trong bình đậy kín đặt vào tủ ấm ở nhiệt

độ 60oC trong 10 - 12 giờ

Để phân tích kiểu nhân người ta thường xử lý dung dịch consixin kết hợp với hỗn hợp dung dịch paradiclorobenzen đậm đặc và 8 - oxyquinolin 0,002 M theo tỷ lệ 1:1 trong thời gian 2 giờ Hai dung dịch này pha trong tủ ấm ở 60oC

Để nghiên cứu hình thái thể nhiễm sắc đôi khi trước khi cố định người ta xử lý theo một trong các phương pháp sau:

1 Ngâm vào dung dịch cumarin 2% trong 2 giờ ở nhiệt độ 12-16oC

2 Ngâm vào hỗn hợp dung dịch cumarin 2% và 8 - oxyquinolin 0,002 M theo tỷ lệ 1:1 trong thời gian 2 giờ ở nhiệt độ 16oC (Nikolop Daxcalop, 1966)

7.4.1.2 Cố định vật mẫu

Vật mẫu sau khi đã được xử lý được chuyển vào dung dịch cố định trong một khoảng thời gian nhất định tùy thuộc vào các dung dịch khác nhau Khi tiến hành cố định cần chú ý một số nguyên tắc:

1 Lượng dung dịch để cố định phải nhiều hơn khối lượng của vật mẫu cố định 50 - 100 lần

2 Cố định vật mẫu ngay sau khi vừa tách vật mẫu ra khỏi cơ thể cây, không được tiến hành việc cố định ngoài ánh nắng

3 Đối với vật mẫu lớn phải tách nhỏ hoặc bỏ những bộ phận không cần thiết trước khi

cố định

4 Trước khi lấy mẫu ra khỏi cây phải tạo mọi điều kiện thuận lợi về nhiệt độ, về độ ẩm

để thúc đẩy quá trình phân chia tế bào như tưới nước, để ở nhiệt độ 20 - 25oC

5 Phải chuẩn bị các ống nghiệm, tốt nhất là các lọ penicilin hay lọ nút nhám có nh•n đầy

đủ Nh•n trên lọ phải khớp nh•n trên đĩa petri, trên chậu hay trên đồng ruộng

6 Nếu cây trồng trong chậu thì dùng tay trái lật ngược chậu lên và dùng tay phải bỏ chậu

ra Các rễ mới mọc sẽ bám trắng xung quanh bồn đất Dùng kéo cắt các rễ non trắng nõn, khoắng vào chậu nước cho sạch đất rồi nhúng ngay vào dung dịch xử lý hay dung dịch cố định Nếu gieo hạt trong đĩa petri thì dùng panh và kim mũi mác để ngắt rễ Mỗi lần ngắt xong cho ngay vào dung dịch xử lý hay dung dịch cố định

Hiện nay có nhiều loại dung dịch cố định khác nhau Về nguyên tắc các dung dịch này có tác dụng làm cho tế bào thực vật chết một cách nhanh chóng mà không gây ảnh hưởng đến số lượng và hình thái thể nhiễm sắc của tế bào Để nghiên cứu thể nhiễm sắc người ta thường dùng nhất dung dịch Navasin và Cacnua Tất cả các thuốc cố định hoặc được pha trong cồn hoặc được pha trong nước Thuốc pha trong cồn thường ngấm nhanh hơn nên chỉ giữ vật mẫu trong đó từ 30 phút đến 12 giờ, còn thuốc pha trong nước mức độ ngấm vào mô chậm hơn do

đó có thể giữ trong đó đến 24 giờ hay lâu hơn nữa

• Foocmalin 16% tức là foocmalin thị trường 40% : 4 phần

• Axit axêtic đã kết băng: 1 phần

Thuốc này chỉ pha ngay trước khi dùng vì rất nhanh hỏng Đây là thuốc có tác dụng rất dịu và giữ được cấu trúc của thể nhiễm sắc tốt

• Axit axêtic đã kết băng: 1 phần

* Dung dịch Clac (còn gọi là dung dịch Cacnua cải tiến 3 : 1)

Thời gian cố định 2 - 12 giờ đôi khi có thể để lâu hơn, nhiệt độ 0-3oC

Thành phần:

• Cồn êtylic 96 độ hay 100 độ : 3 phần

Ba loại dung dịch trên đây được sử dụng phổ biến nhất hiện nay vừa đơn giản, vừa dễ kiếm Ngoài ra hiện nay đối với đối tượng thực vật có thể dùng các công thức sau (Sacma, 1965):

hè, 2 - 3 giờ trong mùa đông Sau khi rửa xong phải làm mất nước bằng cách cho vào dung dịch cồn êtylic theo từng mức độ 20%, 40%, 60%, 80% Mỗi lần ngâm trong thời gian 30 phút mục đích để cho vật mẫu không bị quăn lại trong khi làm mất nước Sau khi làm mất nước người ta có thể giữ vật mẫu lâu dài trong cồn 80%

Đối với thuốc cố định pha cồn thì vật mẫu sau khi cố định xong được rửa sạch trong cồn 80% mỗi lần 1 - 2 giờ cho đến khi hết mùi axit axêtic Muốn thế người ta dùng vải màn bịt lọ rồi đổ thuốc ra và đổ cồn 80% vào, sau 1 - 2 giờ lại thay cồn 1 lần Vật mẫu đã rửa sạch có thể giữ lâu dài trong cồn 80% Để đơn giản người ta có thể rửa vật mẫu bằng nước cất rồi giữ vật mẫu trong tủ lạnh