TIỂU LUẬN TỔNG QUAN VỀ ENZYME CYLANASE

Trong sinh giới, động vật và thực vật không có khả năng tự sinh xylanase, do đó vai trò thủy phân xylan phụ thuộc chủ yếu vào nguồn vi sinh vật, đặc biệt quan trọng là các nhóm vi khuẩn,

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

KHOA HÓA

- -TIỂU LUẬN

TỔNG QUAN VỀ ENZYME CYLANASE

GVHD: TS.NGUYỄN HOÀNG MINH SVTH : TRƯƠNG CHÂU GIANG

NGUYỄN THỊ LỆ HÀ QUÁCH THANH HỒNG PHẠM THỊ ANH THƯ NGUYỄN THỊ MỸ UYÊN DƯƠNG NGUYỄN ÁI XUÂN LỚP : 17SH

Đà Nẵng, 3/2021

MỤC LỤC

MỤC LỤC I DANH MỤC HÌNH II DANH MỤC BẢNG III

LỜI MỞ ĐẦU 1

1 XYLAN 2

1.1 Xylan 2

1.2 Cấu trúc của Xylan 2

2 ENZYME PHÂN GIẢI XYLAN – XYLANASE 2

2.1 Khái niệm 2

2.2 Phân loại và cấu trúc của Xylanase 3

2.2.1 Phân loại 3

2.2.2 Cấu trúc 3

2.3 Nguồn phân lập enzyme xylanases 4

2.3.1 Các loài có khả năng sinh enzyme xylanase đã được nghiên cứu 4

2.3.2 Thành phần môi trường để phân lập các chủng vi sinh vật và nấm có tiềm năng sinh enzym xylanase 5

2.4 Cơ chế hoạt động của enzyme Xylanase 7

2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme Xylanase 7

2.6 Ứng dụng của enzyme xylanase 10

TÀI LIỆU THAM KHẢO 12

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 1 Cấu trúc hóa học của Xylan2 3

Hình 2 1 Cấu trúc không gian của Xylanse được phân lập từ Bacillus subtilis 4 5

Hình 2 2 Phương thức hoạt động của Xylanase 9

Hình 2 3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của xynalase6 9

Hình 2 4 Ảnh hưởng của độ pH đến hoạt động của xynalase6 10

Hình 2 5 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hoạt tính của xylanase6 10

Hình 2 6 Ảnh hưởng của các ion kiêm loại đến hoạt tính của xylanase6 11

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2 1 Thành phần môi trường phân lập sơ cấp6 7 Bảng 2.2 Thành phần môi trường phân lập thứ cấp 6 8

LỜI MỞ ĐẦU

Sản xuất enzyme là một lĩnh vực đang ngày càng phát triển, là một trong những hướng đi hàng đầu của ngành công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm Nhu cầu sử dụng các loại enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật ngày càng tăng cao, trong đó có enzyme xylanase

Xylanase là một trong những loại enzyme được sử dụng trong nhiều ngành sản xuất trên toàn thế giới Trong sinh giới, động vật và thực vật không có khả năng tự sinh xylanase, do đó vai trò thủy phân xylan phụ thuộc chủ yếu vào nguồn vi sinh vật, đặc biệt quan trọng là các nhóm vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm Bên cạnh đó, các lĩnh vực liên quan đến enzyme xylanase và ứng dụng của loại enzyme này rất được quan tâm

Chính vì tầm quan trọng cũng như các ứng dụng thiết thực của enzyme xylanase trong các ngành công nghiệp nên bài tiểu luận của nhóm sẽ đề cập những vấn đề tổng quan về enzyme xylanase và các vấn đề liên quan

1 XYLAN

1.1 Xylan

Xylan là thành phần chính của hemicellulose thực vật, là polysaccharide phổ biến thứ hai trong tự nhiên chỉ sau cellulose và được tìm thấy trong thành tế bào thực vật Là một phức hợp polysaccharide gồm: xylan, xylanglucan, glucomannan, galactoglucomannan và arabinogalactan Phức hợp này cùng với cellulose và lignin hình thành nên thành phần polymer của vách tế bào thực vật Xylan còn tham gia vào cấu trúc

và giúp lignocellulose bền hơn1

1.2 Cấu trúc của Xylan

Xylan là một polysaccharide không đồng nhất, bao gồm các gốc D-xylose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4-xylanosidic (β-1,4- D-xylopyranosyl) giữa đường xylopyranose với acetyl, arabinosyl và glucuronysy (Sao nó cách nhau quá đáng v)

Hình 1 1 Cấu trúc hóa học của Xylan2

2 ENZYME PHÂN GIẢI XYLAN – XYLANASE

2.1 Khái niệm

Xylanase là glycosidase ( O -glycoside hydrolase, EC 3.2.1.x) xúc tác quá trình thủy phân endohydro hóa các liên kết 1,4-β- D -xylosidic trong xylan, một polysaccharide không đông nhất Chúng là một phức hệ các enzyme cần thiết, tham gia vào việc sản xuất xylose, một nguồn cacbon chính cho quá trình trao đổi chất của tế bào và trong quá trình

lây nhiễm tế bào thực vật bởi các mầm bệnh thực vật, và được tạo ra bởi rất nhiều sinh vật bao gồm vi khuẩn, tảo, nấm, động vật nguyên sinh, động vật chân bụng và nhân trắc3 Phát hiện về xylanase được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1955, ban đầu chúng được gọi là pentosanase và được Liên minh Hóa sinh và Sinh học Phân tử Quốc tế (IUBMB) công nhận vào năm 1961 khi chúng được gán mã enzym EC 3.2.1.8 Tên chính thức của chúng là endo-1,4-β-xylanase, nhưng các thuật ngữ đồng nghĩa thường được sử dụng bao gồm xylanase, endoxylanase, 1,4-β- D -xylan-xylanohydrolase, endo-1,4-β- D -xylanase, β- 1,4-xylanase và β-xylanase3

2.2 Phân loại và cấu trúc của Xylanase

2.2.1 Phân loại

Enzyme xylanase thường được tìm thấy ở thực vật và vi sinh vật Xylanase chủ yếu được phân loại thành GH10 (Glycoside hydrolase họ 10) và 11 dựa trên phân tích cụm kỵ nước của các miền xúc tác và sự tương đồng trong trình tự axit amin

Xylanase từ họ GH10 (hoặc họ G) có khối lượng phân tử thấp với pI từ 8-9,5: Glycoside hydrolase họ 10 bao gồm endo-1,4-β-xylanase và endo-1,3-β-xylanase, có cấu trúc α/β gấp cuộn 8 lần và thủy phân các liên kết glycoside vẫn giữ được hình thể nguyên vẹn

Xylanase từ họ GH11 (hoặc họ F) có khối lượng phân tử cao và giá trị pI thấp hơn:

Có độ chọn lọc cơ chất và hiệu suất xúc tác cao, kích thước nhỏ và nhiều giá trị pH và nhiệt độ tối ưu, làm cho chúng phù hợp trong các điều kiện khác nhau và trong nhiều ứng dụng

2.2.2 Cấu trúc

Hình 2 1 Cấu trúc không gian của Xylanse được phân lập từ Bacillus subtilis 4.

Cấu trúc là điển hình của hầu hết các Xylanase G11 và chứa hai tấm β xoắn tạo thành một nếp gấp trông giống một bàn tay phải, trong đó các sợi β riêng lẻ luồn qua lại

để tạo thành "ngón tay" và các miền "lòng bàn tay" (được hiển thị như các vùng F và P) Một vòng mở rộng tạo thành miền "ngón tay cái" (được hiển thị dưới dạng T), có thể mở

và đóng trên vị trí hoạt động, do đó điều chỉnh sự tiếp cận của cơ chất đến vùng xúc tác của enzym Lùi dô

2.3 Nguồn phân lập enzyme xylanases

2.3.1 Các loài có khả năng sinh enzyme xylanase đã được nghiên cứu.

Enzyme xylanase có thể tìm thấy trong nhiều sinh vật sống khác nhau như: vi sinh vật, động vật nguyên sinh, động vật thân mềm và trong dạ cỏ của động vật nhai lại.Tuy nhiên ở quy mô công nghiệp, các xylanase chủ yếu được sản xuất bởi vi sinh vật như vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn

Một số các vi khuẩn có khả năng sinh xylanase có thể kể đến như một số chủng vi

khuẩn Bacillus sp đã được báo cáo là sinh ra enzyme có độ phân giải xylano mạnh nhất:

B.halodurans, B.pumilus, B.subtilis, B.amyloliquefacials, B.circulans và

B.stearotherphilus Xylanase với tính bền nhiệt cao, ổn định trong kiềm/axit và thích ứng

được với nhiệt độ lạnh đã được phân lập từ nhiều loại vi khuẩn được tìm thấy trong môi trường khắc nghiệt Xylanase của chất làm mát có thể hoạt động ở nhiệt độ từ 60-70 độ C

có thể được phân lập từ Bacillus Halodurans TSEV1, Closditrium thermocellum,

Rhodothermus marinus, Streptomyces sp., Stenotrophomonas maltophila, Thermotoga

thermarum Một số xylanase bền kiềm có thể phân lập từ một số vi khuẩn như: Clostridium sp PXLY1, Flavobacterium frigidarium, Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3A 5

Nguồn xylanase từ nấm ưa nhiệt có thể kể đến thuộc các chi Aspergillus và

Trichoderma là loài sản xuất xylanase mạnh và được áp dụng rộng rãi để sản xuất thương

mại Một số chủng có khả năng sản xuất xylanase siêu ưa nhiệt có thể kể đến như:

Thielavia terrestris, Talaromyces thermophilus, Paecilomyces thermophile, Rhizomucor pusillus, Rasamsonia emersonii, Melanocarpus albomyces và Aspergillus oryzae LC1.

Một số xylanase bền kiềm được thu nhận từ các chủng nấm khác nhau như: Paenbacillus

barcinonensis, Aspergillus fumigatus MA28, Cladosporium oxysporum và Aspergillus oryzae LC1 5

2.3.2 Thành phần môi trường để phân lập các chủng vi sinh vật và nấm có tiềm năng sinh enzym xylanase.

Mặc dù xylanase đã được phát hiện từ nhiều loài vi khuẩn và nấm sợi nhưng tùy vào mục đích sử dụng khác nhau mà chủng vi khuẩn sinh enzyme xylanase sẽ được chọn phân lập từ các nguồn tương ứng khác nhau Mẫu vi sinh vật dùng để phân lập có thể lấy

từ mẫu đất, đất rừng, phân, mẫu giống cũ, kho giống,

Thành phần môi trường dùng để phân lập các chủng vi sinh vật và nấm có khả năng sinh enzyme xylanase:

Bảng 2 1 Thành phần môi trường phân lập sơ cấp6

Thành phần Hàm lượng (1000ml dung

dịch)

pH của môi trường được điều chỉnh tới 5,0 và được khử trùng ở nhiệt độ 121°C với áp suất 15 lb trong 20 phút Sau đó môi trường được đổ vào đĩa petri đã được khử trùng Môi trường lỏng dùng để phân lập vi nấm có thành phần tương tự nhưng không có agar Lùi dô

*Các bước để phân lập chủng vi khuẩn sinh enzyme xylanase.

 Thu thập mẫu và đưa vào thùng vô trùng bảo quản ở 4°C cho tới khi cần dùng tiếp

 Pha loãng mẫu với nước cất theo thứ tự tới khi có độ pha loãng cao nhất là 10 -5/0,1 mL sau đó cấy trải trên nền giàu hemicellulose Nếu cần chủng chịu kiềm thì

có thể chỉnh ph của môi trường lên 9,0 bằng dung dịch Na2CO3 10%

 Ủ 3 ngày để sự phát triển của vi sinh vật được phong phú (ủ ở nhiệt độ 50°C để lựa chọn được giống có khả năng chịu nhiệt)

 Các vi sinh vật thu được sau bước sàng lọc sơ bộ này được thu khuẩn lạc đơn và

tiếp tục nuôi cấy

trường thạch xylan như

Bảng 2.2 Thành phần môi trường phân lập thứ cấp6.

Cao sinh khối nấm men

0.5%

Sau khi ủ 3 ngày, kiểm tra khả năng xylanase ngoại bào bằng thuốc thử Congo đỏ Đặt trong dung dịch Congo đỏ 1% và giữ trong vòng 10-15 phút Sau đó khử bằng dung dịch NaCl 1M để có thể nhìn thấy vùng thủy phân

Chọn chủng có vòng thủy phân rộng nhất, nuôi cấy thử nghiệm và tính hiệu suất của giống

2.4 Cơ chế hoạt động của enzyme Xylanase

Xylanase phân giải polysaccharide xylan mạch thẳng thành xylose bằng cách xúc tác quá trình thủy phân liên kết glycosidic(β-1,4) của xyloside thành phần chính của hemicellulose,làm phá vỡ hemicellulose một trong những thành phần chính của thành tế bào7

Trong trung tâm hoạt động của xylanase, axit amin quyết định sự hoạt động của enzyme là axit glutamic

Sự thủy phân xylan đòi hỏi sự hỗ trợ hoạt động của các thành phần trong hệ thống enzyme xylanolytic

Hình 2 2 Phương thức hoạt động của Xylanase 1

2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme Xylanase

Hoạt động xúc tác của enzyme bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố

Hình 2 3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của xynalase8

Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của xylanase được phát hiện là 60 ° C Tương tự, trong các nghiên

cứu khác được thực hiện với Trichoderma sp kết luận rằng nhiệt độ tối ưu thay đổi trong khoảng từ

45 đến 60 ° C (Dekker, 1983; Gomes và cộng sự, 1992) Ngoài ra, đối với nấm xylanase, nhiệt độ tối

ưu là 60 ° C (Chandra và Chandra, 1995; Chandra và Chandra, 1996; Gandhi và cộng sự, 1994).

Hình 2 4 Ảnh hưởng của độ pH đến hoạt động của xynalase8

Các nghiên cứu của Ghanem và cộng sự cho thấy hoạt động của xylanase là tối đa ở khoảng pH

5 Trong các nghiên cứu được thực hiện với Trichoderma sp., người ta cũng kết luận rằng giá trị

pH thích hợp nhất cho hoạt động của xylanase là 5 (Dekker, 1983; Gomes và cộng sự, 1992; Royer và Nakkas, 1991) PH tối ưu cũng là khoảng 5 trong các thí nghiệm tương tự trên xylanase của nấm (Milagres và cộng sự, 1993; Gandhi và cộng sự, 1994; Sigoillot và cộng sự, 2002) Trong một số nghiên cứu khác, để xác định hoạt tính của xylanase, pH thường được giữ ở khoảng 5 (Bailey và cộng sự, 1992) Nhưng giá trị pH tối ưu được phát hiện là 3 trong một nghiên cứu

được thực hiện với T reesei Rut C-30 (Couchon và LeDuyt, 1985) Kết quả của các thí nghiệm

tương tự cho thấy rằng pH tối ưu cho xylanase của vi khuẩn nói chung là cao hơn một chút so với pH tối ưu của xylanase nấm, (Pham và cộng sự, 1998; Subramaniyan và cộng sự, 2000; Sá-Pereira và cộng sự, 2002).

Hình 2 5 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hoạt tính của xylanase8

Khi ảnh hưởng của thời gian phản ứng được khảo sát, người ta quan sát thấy hoạt động của xylanase là tối đa ở 50 phút Khi thời gian tương tác cơ chất của enzyme tăng lên, lượng sản phẩm cũng

tăng lên đến một thời điểm nhất định Có các báo cáo về sự thay đổi trong thời gian ủ để xác định hoạt tính xylanase Điều này là do vi sinh vật và nguồn xylan khác nhau (Royer và Nakas, 1991; Deschamps và Huet, 1985; Atev và cộng sự, 1987; Dekker, 1983; Gomes và cộng sự, 1993)

Đề cập đến việc sử dụng tiềm năng của enzyme xylanase trong ngành công nghiệp giấy và bột giấy, một số ion kim loại xuất hiện trong bột giấy đã được đưa vào nghiên cứu này Trong số các ion kim loại đó, Mn 2+ , Ca 2+ và Zn 2+ tăng cường hoạt tính xylanase trong khi K 2+ làm giảm hoạt tính Mg 2+ và

Cu 2+ không có ảnh hưởng đáng kể đến hoạt tính.

Hình 2 6 Ảnh hưởng của các ion kiêm loại đến hoạt tính của xylanase8 kim loại cập nhật

lại tên hình

Tương tự như phát hiện kết quả thực nghiệm của Ghanem et al đối với Aspergillus

terreus (Ghanem và cộng sự, 2000) và Cesar và Mrsa đối với T lanuginosus (Cesar và Mrsa, 1996) cho

thấy Ca 2+ tăng cường hoạt động xylanase Các ion Mn 2+ và Zn 2+ cũng có ảnh hưởng tích cực đến hoạt động xylanase (Castro và cộng sự, 1997; Cesar và Mrsa, 1996).

2.6 Ứng dụng của enzyme xylanase

Từ lâu xylanase đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau

 Một trong những ứng dụng phổ biến được biết đến của xylanse là được dùng để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi

- Xylanase sẽ giúp phá vỡ cấu trúc của arabinoxylan trong thành phần thức

ăn làm giảm độ nhớt của nguyên liệu tươi

- Bổ sung xylanase vào thức ăn gia súc làm tăng khả năng hấp thu dưỡng chất của hệ tiêu hóa, giúp quá trình sử dụng thức ăn hiệu quả hơn

 Xylanase còn được ứng dụng nhiều trong công nghiệp sản xuất bánh mì, thức ăn

và đồ uống

- Bổ sung xylanase vào bột bánh mì sẽ làm phá vỡ các cấu trúc hemicellulose trong bột bánh mì làm cho bột dễ nhào hơn và nở to, xốp hơn

- Tương tự như thành phần nguyên liệu tươi thì xylanse còn giúp giảm độ nhớt của hoa quả giúp quá trình ép dễ hơn phù hợp trong ngành sản xuất nước hoa quả

- Ngoài ra, việc bổ sung xylanase sẽ làm giảm độ đục của bia cũng như dịch quả

 Xylanase có vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy Đối với ngành công nghiệp giấy, việc sử dụng một lượng lớn hóa chất gốc clo và natri hydrosulfit gây ra tình trạng ô nhiễm và các vấn đề về nước thải, chính vì thế việc sử dụng enzyme xylanse để tẩy trắng giấy bằng cách phân hủy lignin có trong thành phần giấy dường như mang lại hiệu quả tốt hơn và đảm bảo an toàn môi trường

 Ứng dụng trong chuyển hóa sinh học các chất lignocellulose:

Thành phần các phụ phẩm nông nghiệp chủ yếu là hemicellulose là các đường và một lượng nhỏ các axit hữu cơ Việc phân giải xylan trong hemicellulose dẫn đến phá hủy cấu trúc tổ hợp lignocellulose tạo thành các loại đường làm cơ chất cho quá trình lên men các sản phẩm công nghiệp khác

2.6 Tình hình sản xuất enzyme xylanase:

Từ lâu xylanase đã được sản xuất ở quy mô công nghiệp từ Aspergillus spp.và

Trichoderma 9

Hầu hết các nhà sản xuất sản xuất xylanase bằng kỹ thuật lên men chìm từ một số học

vi khuẩn như Bacillus, Streptomyces.

Ngoài ra ở cấp độ sinh học phân tử xylanase được sản xuất nhân tạo bằng kỹ thuật

DNA tái tổ hợp với đối tượng được nghiên cứu là vi khuẩn như Escherichia coli, nấm men như Saccharosemyces cerevisae, nấm sợi như P.griseofulvum.